肉毒梭菌及其毒素檢驗

肉毒梭菌及其毒素檢驗主講人：王福紅動物性食品微生物檢驗

知識目標：

理解肉毒梭菌的生物學(xué)特性。了解肉毒梭菌及其毒素的致病性。掌握肉毒梭菌及其毒素標準檢驗方法。

能力目標：

會制備肉毒梭菌及其毒素檢驗用培養(yǎng)基。會對肉毒梭菌及其毒素進行檢驗。

肉毒梭菌肉毒梭菌是一種腐物寄生菌，在自然界分布很廣，土壤、霉干草和畜禽糞便中均有存在，可分為A至G七個型。肉毒中毒是一種較嚴重的食物中毒，它是肉毒梭菌的外毒素所引起的。早在18世紀末以前，在德國引起中毒的食品主要是臘腸，所以稱為臘腸中毒（BotuLism）。在我國過去譯為臘腸中毒，把肉毒梭菌譯為臘腸桿菌或臘腸梭菌，現(xiàn)在改稱為肉毒梭菌。引起肉毒中毒主要是食入含有肉毒毒素的食品，食品在調(diào)制加工、運輸貯存的過程中，污染了肉毒梭菌芽胞，在適宜條件下，發(fā)芽、增殖并產(chǎn)生毒素所造成的。國外引起肉毒中毒的食品多為肉類及各種魚、肉制品、火腿、臘腸以及豆類、蔬菜和水果罐頭。中毒食品種類往往與飲食習(xí)慣有關(guān)。如歐洲各國主要的中毒食品為火腿、臘腸和其他獸肉、禽肉等。美國主要是家庭制的水果罐頭，而火腿、臘腸等畜禽肉加工食品僅占7.7%，日本和俄羅斯等國家魚制品中毒者最多，尤其是日本，幾乎全部是魚制品的E型中毒。國內(nèi)因肉類食品及罐頭食品引起的中毒的較少，據(jù)有關(guān)資料調(diào)查統(tǒng)計，主要是臭豆腐、豆鼓、面醬、紅豆制品、爛土豆等植物性食品引起的中毒多見。肉毒梭菌的抵抗力一般，但其芽胞的抵抗力很大，可耐煮沸1～6小時之久，于180℃干熱5～15分鐘才能破壞，120℃高壓蒸氣下10～20分鐘才能殺死。10%鹽酸須經(jīng)1小時才能破壞。在酒精中能存活2個月。其中以A、B型菌的芽胞抵抗力最強。這一點對于罐頭食品的滅菌很重要，若芽胞深藏于食品中，或者數(shù)量過多，雖經(jīng)高溫滅菌，有時也不易殺死芽胞，故應(yīng)特別注意。肉毒毒素抵抗力也較強，80℃30分鐘或100℃10分鐘才能完全破壞。正常胃液和消化酶于24小時不能將其破壞，可被胃腸道吸收而中毒。形態(tài)及染色：本菌為革蘭氏染色陽性的大桿菌，長4～6um,寬0.9～1.2um，多單在，偶見成雙或短鏈。菌端鈍圓。有周身鞭毛，無莢膜，芽胞為橢圓形，A、B型菌的芽胞大于菌體，位于菌體近端，使菌體呈匙形或網(wǎng)球拍狀，另外四型菌的芽胞一般不超過菌體寬度。一、生物學(xué)性狀培養(yǎng)特性：本菌為最嚴格的厭氧菌，對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上都能生長。發(fā)育最適宜溫度為28～37℃，pH為6.8～7.6，產(chǎn)毒的最適pH為7.8～8.2。血清瓊脂：培養(yǎng)48～72小時，形成中央隆起，邊緣不整齊、灰白色、表面較粗糙的絨球狀菌落。直徑可達6～10mm。血液瓊脂：菌落周圍有溶血區(qū)。血液瓊脂培養(yǎng)特性：普通瓊脂：形成灰白色、半透明、邊緣不整齊。呈絨毛網(wǎng)狀、向外擴散的菌落。直徑約為3～5mm。肉渣肉湯：呈均勻混濁生長，肉渣可被A、B和F型菌消化溶解成爛泥狀，并發(fā)黑，產(chǎn)生腐敗惡臭味，從第三天起，菌體下沉，肉湯變清。在肉渣培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基，大量產(chǎn)氣。生化特征本菌生化特性很不規(guī)律，一般能分解葡萄糖、麥芽糖、果糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。對明膠、凝固血清、凝固蛋白均有分解作用，并引起液化。不形成靛基質(zhì)，能產(chǎn)生硫化氫。菌型及毒素目前已知肉毒梭菌有A、B、C、D、E、F、G等7個菌型，其中C型還有Cα和Cβ兩個亞型。引起人群中毒的主要是A、B、E三型，C、D型主要是畜禽肉毒中毒的病原，F(xiàn)型只見報導(dǎo)發(fā)生在個別地區(qū)的人，如丹麥和美國各一起。1980年從瑞士五名突然死亡病例中發(fā)現(xiàn)G型毒素。各型肉毒梭菌產(chǎn)生相應(yīng)型的毒素，所以肉毒毒素也分為A、B、C、D、E、F、G等7型，C型包括Cα和Cβ兩個亞型。肉毒毒素是在肉毒梭菌胞漿中產(chǎn)生，由菌體釋放到培養(yǎng)基中，經(jīng)濾過除菌所得濾液即為毒素液。毒素形成的最適宜溫度為28～37℃，溫度低于8℃與pH在4.0以下時，則不能形成。肉毒梭菌產(chǎn)生的毒素是一種神經(jīng)毒素，是目前已知的化學(xué)毒物與生物毒素中毒性最強的一種，對人的致死量為10-9mg/Kg體重。其毒力比氰化鉀還要大一萬倍。二、致病性肉毒毒素是一種與神經(jīng)親和力較強的毒素，肉毒毒素經(jīng)腸道吸收后，作用于外周神經(jīng)肌肉接頭，植物神經(jīng)末梢以及顱腦神經(jīng)核，毒素能阻止乙酰膽堿的釋放，導(dǎo)致肌肉麻痹和神經(jīng)功能不全。在臨床上表現(xiàn)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀為主，肉毒毒素中毒潛伏期長短不一，短者2小時，長者可達數(shù)天，一般為12～24小時。中毒癥狀，早期為瞳孔放大、明顯無力、虛弱、暈眩，繼而出現(xiàn)視覺不清和霧視，愈來愈感到說話和吞噬困難，通常還可見到呼吸困難，體溫一般正常，胃腸道癥狀不明顯。病程一般為2～3天，也有的長達2周之久。肉毒中毒死亡率較高，據(jù)報導(dǎo)可達30%～50%，死亡主要是由于呼吸麻痹及心肌瘓癱。如早期使用型特異或多價抗血清治療，死亡率可降至10%～15%。三、檢驗方法《中華人民共和國國家標準—食品衛(wèi)生檢驗方法（微生物學(xué)部分）》肉毒梭菌及其毒素的檢驗方法GB4789.12-2003

?！吨腥A人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準》食品中肉毒梭菌的PCR檢測方法SN/T2525-2010

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檢驗方法（GB4789.12）肉毒梭菌檢出分離培養(yǎng)結(jié)果報告肉毒毒素檢驗（一）肉毒毒素檢驗樣品的處理123毒力測定4定型試驗5

檢出試驗

確證試驗液體檢樣可直接離心，固體或半流動檢樣須加適量（例如等量、倍量或5倍量、10倍量）明膠磷酸鹽緩沖液，浸泡、研碎，然后，取上清液進行檢測。另取一部分上清液，調(diào)pH6.2，每份加10%胰酶（活力1：250）水溶液1份，混勻，不繼輕輕攪動，37℃作用60min，進行檢測。1.樣品的處理試驗方法：取樣品處理完的上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠三只，每只0.5mL，觀察4d。結(jié)果觀察：注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h內(nèi)發(fā)病死亡。如遇小鼠猝死以至癥狀不明顯時，則可將注射液做適當(dāng)稀釋，重做試驗。主要癥狀為豎毛、四肢癱軟，呼吸困難，呼吸呈風(fēng)箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最終死于呼吸麻痹。2.檢出試驗結(jié)果判定：若注射加診斷血清與煮沸加熱的兩份混合液的小白鼠均獲得保護存活。注射未經(jīng)其他處理的混合液的小白鼠以特有的癥狀死亡?？膳卸z樣中的肉毒毒素存在，必要時進行毒力測定及定型試驗。3.確證試驗不論上清液或其胰酶激活處理液，凡能致小白鼠發(fā)病、死亡者，取樣分成三份進行試驗：一份加等量多型混合肉毒抗毒診斷血清，混勻，37℃作用30min。一份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻，煮沸10min。一份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻即可，不做其他處理。三份混合液分別注射小白鼠各兩只，每只0.5mL,觀察4d。3.確證試驗取已判含有肉毒毒素的檢樣離心上清液，用明膠磷酸鹽緩沖液做成50倍、500倍及5000倍的稀釋液，分別注射小白鼠各兩只，每只0.5mL,觀察4d。根據(jù)動物死亡情況，計算檢樣所含肉毒毒素的大體毒力（MLD/mL或MLD/g）。4.毒力測定按毒力測定結(jié)果，用明膠磷酸鹽緩沖液將檢樣上清液稀釋至所含毒素的毒力大體在10MLD/mL～1000MLD/mL的范圍，分別與各單型肉毒抗診斷液血清等量混勻，37℃作用30min，各注射小白鼠兩只，每只0.5mL，觀察4d。同時以明膠磷酸鹽緩沖液代替診斷血清，與稀釋毒素等量混合作為對照。能保護動物免于發(fā)病、死亡的診斷血清即為檢樣所含肉毒毒素的型別。5.定型試驗（二）肉毒梭菌檢出（增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)）試驗取庖肉培養(yǎng)基三支，煮沸10min～15min，做如下處理：第一支：急速冷卻，接種檢樣均質(zhì)液1mL～2mL；第二支：冷卻至60℃，接種檢樣，繼續(xù)于60℃保溫10min，急速冷卻；第三支：接種檢樣，繼續(xù)煮沸加熱10min，急速冷卻。培養(yǎng)：30℃，5d。觀察結(jié)果：若無生長，可再培養(yǎng)10d。培養(yǎng)到期，若有生長，取培養(yǎng)液離心，以其上清液進行毒素檢測試驗，方法同肉毒毒素的檢驗，陽性結(jié)果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。選取經(jīng)毒素檢測試驗證實含有肉毒梭菌的前述增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物（必要時可重復(fù)一次適宜的加熱處理）接種卵黃瓊脂平板，35℃厭氧培養(yǎng)48小時。肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長時，菌落及周圍培養(yǎng)基表面覆蓋著特有的虹彩樣（或珍珠層樣）薄層，但G型菌無此現(xiàn)象。根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)挑取可疑菌落，接種庖肉培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)5d,進行毒素檢測及培養(yǎng)特性檢查確證試驗