植物細(xì)胞的獲取課件

第一節(jié)外植體的選擇與預(yù)處理成功關(guān)鍵：培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件、外植體的來源。一、外植體的選擇從生長正常，無病蟲害的母株中，選擇適宜的組織器官1、用于直接分離細(xì)胞的外植體的選擇原則：細(xì)胞之間粘連程度較??；葉片最佳；限制：機(jī)械或酶傷害細(xì)胞，完整細(xì)胞較少。第一節(jié)外植體的選擇與預(yù)處理12、用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體的選擇雙子葉植物中常用的外植體有：幼胚、成熟胚、下胚軸、子葉、葉片、根等。單子葉植物中常用的外植體有：幼胚、成熟胚、細(xì)穗、花藥等。無論是雙子葉植物還是單子葉植物、均以幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的為最佳。因?yàn)橛着哒T導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)量最好，分化能力強(qiáng)?；蛐偷挠绊懀翰煌N類及不同品種之間存在差異；2、用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體的選擇2同一植物，不同部位脫分化和再分化能力存在差異：百合：外層＞內(nèi)層；紫草根＞莖葉；蘋果頂芽褐變程度＜側(cè)芽；蘭科：莖尖；還要考慮生產(chǎn)目的：選用植株中主要生產(chǎn)所需的的次級(jí)代謝產(chǎn)物的組織和器官同一植物，不同部位脫分化和再分化能力存在差異：百合：外層＞內(nèi)32、用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體的選擇外植體的生理狀態(tài)：紅豆杉：新生的嫩枝；取材季節(jié)：母株生長旺盛的季節(jié)；紫草：秋天（紫草寧合成和積累）；外植體大?。哼m當(dāng)大小；脫毒率和莖尖大小及成活率之間的關(guān)系；2、用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體的選擇43、用于分離原生質(zhì)體的外植體的選擇分離原生質(zhì)體則以葉片為最好。苗齡與葉齡有關(guān)；太老不易游離，太嫩，易游離，但細(xì)胞膜易損害；以苗齡15－25d，剛展開的幼葉為最佳。無菌苗幼葉；還要考慮培養(yǎng)目的；多數(shù)情況下，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定；3、用于分離原生質(zhì)體的外植體的選擇54、花粉材料的選擇用作花粉培養(yǎng)的親本植株的基因型、生長情況以及接種時(shí)花粉所處的發(fā)育時(shí)期，對(duì)花粉植株的誘導(dǎo)頻率都有直接的影響。關(guān)鍵選取處于合適發(fā)育期的花藥，離體培養(yǎng)后才能啟動(dòng)花粉發(fā)育。實(shí)踐表明，從減數(shù)分裂期至雙核期的花藥，均有可能誘導(dǎo)離體孤雄發(fā)育。大多數(shù)園藝植物的花藥培養(yǎng)，成功率最高的時(shí)期為單核期，或單核中晚期。第二章植物細(xì)胞的獲取課件6四分體－－小孢子－－單核花粉－－雙核花粉花粉的發(fā)育時(shí)期四分體－－小孢子－－單核花粉－－雙核花粉花粉的發(fā)育時(shí)期7花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)范疇花粉培養(yǎng)也稱為小孢子培養(yǎng)。是從花藥中分離出花粉粒,使之成為分散的或游離的狀態(tài),通過培養(yǎng)使花粉粒脫分化,進(jìn)而發(fā)育成完整植株的過程.屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范疇花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)范疇花粉培養(yǎng)也稱為小孢子培養(yǎng)。是從花藥中81、外植體的滅菌處理

常用表面滅菌劑使用濃度及效果比較表二、外植體的預(yù)處理1、外植體的滅菌處理

常用表面滅菌劑使用濃度及效果比較表二、9幾種常用消毒劑的效果比較消毒劑使用濃度消毒時(shí)間效果殘液去除難易次氯酸鈣/鈉105-30好易新潔爾滅10－205-30好易氯化汞0.1－12-10最好最難過氧化氫10－125-15較好最易抗菌素4－50mg/L30-60較好較難幾種常用消毒劑的效果比較消毒劑使用濃度消毒時(shí)間效果殘液去除難10外植體表面滅菌過程：選材 刷洗、沖洗 用洗衣粉水或肥皂水浸洗并攪動(dòng) 自來水沖凈洗衣粉水70％酒精浸泡10～30秒振蕩0.1％升汞3～10分鐘(表面活性劑)無菌水沖先3～5次接種外植體表面滅菌過程：選材 刷洗、沖洗 用洗衣粉水或肥皂水浸112、外植體的其他處理目的：提高愈傷組織誘導(dǎo)率；促進(jìn)原生質(zhì)體游離。方法：預(yù)培養(yǎng)；暗處理；低溫或高溫處理；萎蔫處理；抗氧化劑處理；高滲透壓預(yù)處理；2、外植體的其他處理目的：提高愈傷組織誘導(dǎo)率；促進(jìn)原生質(zhì)體游12花藥和花粉培養(yǎng)的預(yù)處理：最常用的方法是低溫冷藏。具體做法是將帶有葉鞘的穗子或花蕾用濕紗布包裹后再用塑料袋套起，放在冰箱中冷藏。不同材料對(duì)處理溫度的高低有不同的要求，一般耐寒植物比喜溫可耐受較低的溫度。低溫處理時(shí)間視使用的溫度而定，較低的溫度處理時(shí)間要短，反之則長。煙草7～9度下處理7～14天，水稻7～10度下處理10～15天，大麥3～7度下處理7～14天，都可顯著提高花藥的出愈率?；ㄋ幒突ǚ叟囵B(yǎng)的預(yù)處理：13低溫處理的作用：預(yù)處理引起花藥、花粉內(nèi)源激素發(fā)生變化，改變了小孢子（花粉粒）第一次有絲分裂的軸向發(fā)育（正常發(fā)育時(shí)，兩次有絲分裂形成三核花粉粒），產(chǎn)生兩個(gè)相等核，進(jìn)而形成愈傷組織或胚狀體。保持高比例的強(qiáng)生活力花粉，同時(shí)延緩體細(xì)胞組織的衰老。激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚。促使細(xì)胞同步分裂。技術(shù)要點(diǎn)低溫處理的作用：預(yù)處理引起花藥、花粉內(nèi)源激素發(fā)生變化，改變了14第二節(jié)從外植體直接分離植物細(xì)胞一、機(jī)械搗碎法將外植體搗碎，然后通過過濾和離心分離細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：不用酶，細(xì)胞不會(huì)受到傷害；沒有經(jīng)過質(zhì)壁分離，利于生理生化研究。缺點(diǎn)：機(jī)械作用，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞大，得率低。最佳材料：葉片第二節(jié)從外植體直接分離植物細(xì)胞一、機(jī)械搗碎法15方法及步驟：第一種方法：用刀片刮葉片第二種方法：先把葉片輕輕研碎，然后通過過濾和離心凈化細(xì)胞。葉片表面滅菌→切成小于1cm2的小塊→玻璃勻漿管中勻漿→過濾（孔徑分別為：61m和38m）→低速離心，棄上清→懸浮細(xì)胞→細(xì)胞培養(yǎng)方法及步驟：16二、酶解法利用果膠酶、纖維素酶等處理，分離出具有代謝活性的細(xì)胞；該法不僅能降解中膠層，而且還能軟化細(xì)胞壁。所以在用酶解法分解細(xì)胞的時(shí)候，必須對(duì)細(xì)胞給予滲透壓保護(hù)。常用的滲透壓保護(hù)劑是甘露醇。首次成功：煙草葉細(xì)胞步驟：葉片表面滅菌→撕去下表皮→切成4cm2小塊→放入酶液中→抽真空→搖床上酶解→每30min更換一次酶液（第一次棄去，第二次主要含海綿細(xì)胞，第三、四次主要含柵欄細(xì)胞）→收集細(xì)胞，培養(yǎng)基洗二次后培養(yǎng)二、酶解法利用果膠酶、纖維素酶等處理，分離出具有代謝活性的細(xì)17機(jī)械法和酶解法比較機(jī)械法：細(xì)胞不受到酶的傷害；不用質(zhì)壁分離，有利于進(jìn)行生理和生化研究；容易傷害細(xì)胞結(jié)構(gòu)，獲得完整細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞數(shù)量極低；細(xì)胞易破。酶解法：細(xì)胞受到酶的傷害；要質(zhì)壁分離；細(xì)胞產(chǎn)量高；細(xì)胞不易破。機(jī)械法和酶解法比較18第三節(jié)通過愈傷組織誘導(dǎo)獲取植物細(xì)胞一、獲取過程：（1）誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；（2）愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性。（3）將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物。具體方法：用鑷子或小刀分割得到植物小細(xì)胞團(tuán)；液體培養(yǎng)基中加入小玻璃珠，振蕩培養(yǎng)，使其分散，再過濾獲得；適量的果膠酶可促使細(xì)胞分開。在植物的組織培養(yǎng)中，從一塊外植體形成典型的愈傷組織，大致要經(jīng)歷三個(gè)時(shí)期：啟動(dòng)期、分裂期和形成期。第三節(jié)通過愈傷組織誘導(dǎo)獲取植物細(xì)胞19啟動(dòng)期是指細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期。外源植物生長素對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂效果很好。常用的有：2,4－D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。通常使用細(xì)胞分裂素和生長素比例在1:l或是小于1來誘導(dǎo)植物愈傷組織的形成。分裂期是指外植體細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)以后脫分化，不斷分裂、增生子細(xì)胞的過程。分裂期愈傷組織的特點(diǎn)是：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明。分化期是指在分裂的末期，細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)一系列形態(tài)和生理上的變化，從而使愈傷組織內(nèi)產(chǎn)生不同形態(tài)和功能的細(xì)胞。這些細(xì)胞類型有薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞、纖維細(xì)胞等等。第二章植物細(xì)胞的獲取課件20外植體的細(xì)胞經(jīng)過啟動(dòng)、分裂和分化等一系列變化，形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織。如果在原來的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)愈傷組織，會(huì)由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)不足或有毒代謝物的積累，導(dǎo)致愈傷組織停止生長，甚至老化變黑、死亡。如果要讓愈傷組織繼續(xù)生長增殖，必須定期地（2～4個(gè)星期）將它們分成小塊接種到新鮮的培養(yǎng)基上，這樣愈傷組織就可以長期保持旺盛的生長。即經(jīng)常地繼代培養(yǎng)。

第二章植物細(xì)胞的獲取課件21二、影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素1、外植體：細(xì)胞越成熟，脫分化越困難。無菌萌發(fā)的幼苗。2、培養(yǎng)條件：1）激素的種類及濃度：生長素：2,4－D、IAA、NAA；細(xì)胞分裂素：KT、ZT、6－BA。2）培養(yǎng)基的種類二、影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素223）光照和溫度（21±0.3）℃最佳。4）NH4＋/NO3-5）碳源良好的愈傷組織的條件：高度的胚性或再分化能力；容易分散，以便建立優(yōu)良的懸浮細(xì)胞系和分離原生質(zhì)體；旺盛的增殖能力，以便建立大規(guī)模的無性系；繼代不喪失胚性黑暗培養(yǎng)下煙草的愈傷組織3）光照和溫度黑暗培養(yǎng)下煙草的愈傷組織23繼代培養(yǎng)常見問題

1.變異問題

影響變異的因素：基因型發(fā)生途徑繼代次數(shù)減少變異的措施：選擇變異率低的品種選擇不容易產(chǎn)生變異的發(fā)生途徑嚴(yán)格控制繼代代數(shù)（10代以內(nèi)）繼代培養(yǎng)常見問題1.變異問題24繼代培養(yǎng)常見問題2.玻璃化問題玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的主要原因：一是通氣不良；二是激素濃度太高；三是基因型；四是水分。培養(yǎng)基中可利用水的含量過高，試管苗可吸收的水分太多，植物內(nèi)具有過多的游離水?？朔ＡЩF(xiàn)象的措施：兩個(gè)“增加”：增加瓊脂濃度；增加蔗糖含量；兩個(gè)“增強(qiáng)”：增強(qiáng)溶器通風(fēng)；增強(qiáng)光照；兩個(gè)“加入”：加入滲透劑；加入ABA（脫落酸）；一個(gè)“減少”：減少培養(yǎng)基氮含量。繼代培養(yǎng)常見問題2.玻璃化問題25第四節(jié)通過原生質(zhì)體再生獲取植物細(xì)胞原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。亞原生質(zhì)體(subprotoplast)：在原生質(zhì)體分離過程中，有時(shí)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)含物的斷裂而形成一些較小的原生質(zhì)體就叫做亞原生質(zhì)體。它可以具有細(xì)胞核或沒有細(xì)胞核。胞質(zhì)體（cytoplast）：不含細(xì)胞核而僅含有部分細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。第四節(jié)通過原生質(zhì)體再生獲取植物細(xì)胞原生質(zhì)體(protopl26第四節(jié)通過原生質(zhì)體再生獲取植物細(xì)胞關(guān)于原生質(zhì)體研究的重要成就：1880年，Hanstein首次起用原生質(zhì)體一詞。1960年，Cocking首次應(yīng)用酶法制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功。1971年，Takebe首次得到煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。1985年，F(xiàn)ujimura第一例禾谷類作物－水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。1986年，Spangenberg單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株在甘藍(lán)型油菜上獲得成功。第四節(jié)通過原生質(zhì)體再生獲取植物細(xì)胞關(guān)于原生質(zhì)體研究的重要成27一、植物原生質(zhì)體的材料來源幾乎能從植物的所有部位得到原生質(zhì)體，其中以葉片為多，因?yàn)橹参锶~肉細(xì)胞的原生質(zhì)體有下面幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1.取材容易，植株可來自盆栽和溫室栽培，也可在試管中培育無菌苗。2.原生質(zhì)體在生理和遺傳特性上比較一致。3.比較容易用酶解法分離。根尖組織也是植物原生質(zhì)體的重要來源，它可由各種植物的種子萌發(fā)后取得。花粉經(jīng)特異酶處理也能得到原生質(zhì)體，在單倍體遺傳育種中有特殊的用途。一、植物原生質(zhì)體的材料來源幾乎能從植物的所有部位得到原生質(zhì)28二、植物原生質(zhì)體的材料來源原生質(zhì)體也可以從組織培養(yǎng)的材料中大量獲得。由于組織培養(yǎng)的嚴(yán)格條件，使得材料的重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)材料可做到常年供應(yīng)。值得注意的是，在考慮分離植物原生質(zhì)體時(shí)，既要采用容易獲得原生質(zhì)體的植物材料，但更重要的是要選用易于再生完整植株的細(xì)胞。二、植物原生質(zhì)體的材料來源原生質(zhì)體也可以從組織培養(yǎng)的材料中29第二章植物細(xì)胞的獲取課件30二.植物原生質(zhì)體的分離和純化

(一)原生質(zhì)體的分離早在1892年就有人用機(jī)械法分離原生質(zhì)體。直到1960年，英國的科金(Cocking)首先采用酶解法分離原生質(zhì)體。酶解法有下面幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：能獲得大量的原生質(zhì)體；條件溫和，原生質(zhì)體完整性好；原生質(zhì)體純凈度高；下面以葉片和懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞為材料介紹分離原生質(zhì)體的一般步驟。二.植物原生質(zhì)體的分離和純化

311.材料準(zhǔn)備與表面滅菌2.酶解：用鑷子撕去葉子的下表皮后，切成2厘米見方的小片，使去表皮的一層朝下放入酶液中處理，在25-28℃，黑暗下酶解3-4hr。若采用懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，則采用繼代3d的細(xì)胞最好，經(jīng)離心收集細(xì)胞，放入酶液中置低速轉(zhuǎn)床酶解8-12hr。1.材料準(zhǔn)備與表面滅菌32(二)原生質(zhì)體的純化酶解后純化原生質(zhì)體的步驟如下：1.酶解懸浮液用400目的不銹鋼或尼龍網(wǎng)過濾，以除去未消化的碎片。2.將含有原生質(zhì)體的酶液收集到離心管中，低速離心使原生質(zhì)體沉于管底，倒掉上清液。3.在離心管中加入適量的洗滌液，并離心。4.重復(fù)上述操作三次，使酶解液充分除去，最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌一次。上述的離心純化法可細(xì)分為：A．沉降法；B．漂浮法；C．沉降法和漂浮法結(jié)合等三種。(二)原生質(zhì)體的純化酶解后純化原生質(zhì)體的步驟如下：33原生質(zhì)體培養(yǎng)基分離時(shí)酶的溶劑為原生質(zhì)體培養(yǎng)基甘露醇和蔗糖為滲透壓調(diào)節(jié)劑在酶液中加入適量的氯化鈣和磷酸二氫鉀作為原生質(zhì)體穩(wěn)定劑，可增強(qiáng)質(zhì)膜的穩(wěn)定性原生質(zhì)體培養(yǎng)基分離時(shí)酶的溶劑為原生質(zhì)體培養(yǎng)基34第二章植物細(xì)胞的獲取課件35酶溶劑用原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制酶溶劑用原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制36(三)原生質(zhì)體的活力測(cè)定一是目測(cè)法：憑借形態(tài)可識(shí)別原生質(zhì)體的存活性。二是采用特異的染色方法來確定：0.1%酚藏花紅液染色，活的原生質(zhì)體能吸收而呈紅色，死的則無此能力；伊文思藍(lán)與之相反，僅死原生質(zhì)體可吸收；熒光素雙醋酸酯(FDA)染色，F(xiàn)DA本身沒有熒光和極性，可自由滲透進(jìn)出完整質(zhì)膜。活的原生質(zhì)體的酯酶能分解FDA成為具有熒光的極性物質(zhì)，無活力的不產(chǎn)生熒光。(三)原生質(zhì)體的活力測(cè)定一是目測(cè)法：憑借形態(tài)可識(shí)別原生質(zhì)37Beforeprotoplastscanbecultureditisnecessarytotestthemforviability.Beforeprotoplastscanbecult38三.影響原生質(zhì)體分離的幾個(gè)因素1.

酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶溶液的滲透壓等。不同細(xì)胞細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)有差異，故酶的種類和濃度也不相同，如分離根尖細(xì)胞要有較多的果膠酶；花粉母細(xì)胞及四分體小孢子：蝸牛酶及胼胝質(zhì)酶聯(lián)合；成熟花粉細(xì)胞：果膠酶和纖維素酶。酶液pH值也直接影響分離的速度和穩(wěn)定性。pH值低則分離速度較快，而損壞的較多；pH值高則分離速度較慢，而完整性較好；故酶液的pH值一般為5.7左右。三.影響原生質(zhì)體分離的幾個(gè)因素1.酶解條件：酶質(zhì)量、濃39三.影響原生質(zhì)體分離的幾個(gè)因素2.滲透壓穩(wěn)定劑種類和濃度因材料不同而有變化。在酶液中加入適量的CaCl2和KH2PO4作為原生質(zhì)體穩(wěn)定劑，可增強(qiáng)質(zhì)膜的穩(wěn)定性。3.取材植株的生理狀態(tài)也是重要的因素，如采用懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般用繼代3d的較為理想。三.影響原生質(zhì)體分離的幾個(gè)因素40四.培養(yǎng)原生質(zhì)體的幾種方法原生質(zhì)體經(jīng)分離和純化后，需要進(jìn)行活力測(cè)定和計(jì)數(shù)。原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)有一種密度效應(yīng)，一般104－5個(gè)/mL有利于培養(yǎng)。計(jì)數(shù)可用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行。四.培養(yǎng)原生質(zhì)體的幾種方法原生質(zhì)體經(jīng)分離和純化后，需要進(jìn)41BrassicaprotoplastsTheoptimumplatingefficiency(tobaccoprotoplasts)5×104protoplasts/cm3.ProtoplastsfailtodividewhenplatedatonetenthofthisconcentrationBrassicaprotoplastsTheoptimu42第二章植物細(xì)胞的獲取課件43液體淺層培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，對(duì)原生質(zhì)體的操作小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。缺點(diǎn)：使原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育情況。液體淺層培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口44固體平板培養(yǎng)固體培養(yǎng)也就是瓊脂瑭包埋培養(yǎng)。低融點(diǎn)的瓊脂糖可在30℃左右融化與原生質(zhì)體混合而不影響原生質(zhì)體的生命活動(dòng)?；旌虾蟮暮性|(zhì)體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：可以跟蹤觀察單個(gè)原生質(zhì)體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體分裂頻率。缺點(diǎn)：操作要求嚴(yán)格，尤其是混合時(shí)的溫度掌握必須合適，溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快，原生質(zhì)體不易混合均勻。固體平板培養(yǎng)固體培養(yǎng)也就是瓊脂瑭包埋培養(yǎng)。低融點(diǎn)的瓊脂糖可在45液體－固體雙層培養(yǎng)即在培養(yǎng)皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。缺點(diǎn)：不易觀察細(xì)胞的發(fā)育過程。液體－固體雙層培養(yǎng)即在培養(yǎng)皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再46瓊脂糖珠培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50微升一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，通過調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進(jìn)一步的生長和發(fā)育。這種方法由于改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進(jìn)了原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。瓊脂糖珠培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約5047第五節(jié)通過花藥獲取花粉?；ǚ鄣姆蛛x有二種方法，即花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法和機(jī)械分離法。（1）花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于液體表面經(jīng)1～7天的培養(yǎng)，藥壁自然開裂，花粉自然散落下來，及時(shí)將花藥壁從培養(yǎng)瓶中取出來，留下的花粉繼續(xù)培養(yǎng)，如水稻、大麥等。第五節(jié)通過花藥獲取花粉?；ǚ鄣姆蛛x有二種方法，即花藥漂浮培48（2）機(jī)械分離方法分離：把花藥放在玻璃容器中，加入一定量適當(dāng)濃度的蔗糖溶液或適量液體培養(yǎng)基，用注射器內(nèi)徑輕輕擠壓花藥把花粉擠出來，或用磁力攪拌器把花藥攪裂使花粉散出來。過篩：將上述混合液經(jīng)過一定孔徑的不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾。一般孔徑應(yīng)比花粉直徑大10um左右，將濾液離心，去上清液。清洗：加入蔗糖液或液體培養(yǎng)，置100～1000轉(zhuǎn)/分離心1～5分鐘，再去上清液，如此重復(fù)2～3次。最后一次用需用培養(yǎng)花粉的液體培養(yǎng)基進(jìn)行，以保證培養(yǎng)基成分的穩(wěn)定性。培養(yǎng)時(shí)花粉的密度一般為104～105個(gè)/ml。（2）機(jī)械分離方法49第二章植物細(xì)胞的獲取課件50謝謝觀看謝謝觀看51第二章植物細(xì)胞的獲取課件52第二章植物細(xì)胞的獲取課件53第一節(jié)外植體的選擇與預(yù)處理成功關(guān)鍵：培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件、外植體的來源。一、外植體的選擇從生長正常，無病蟲害的母株中，選擇適宜的組織器官1、用于直接分離細(xì)胞的外植體的選擇原則：細(xì)胞之間粘連程度較??；葉片最佳；限制：機(jī)械或酶傷害細(xì)胞，完整細(xì)胞較少。第一節(jié)外植體的選擇與預(yù)處理542、用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體的選擇雙子葉植物中常用的外植體有：幼胚、成熟胚、下胚軸、子葉、葉片、根等。單子葉植物中常用的外植體有：幼胚、成熟胚、細(xì)穗、花藥等。無論是雙子葉植物還是單子葉植物、均以幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的為最佳。因?yàn)橛着哒T導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)量最好，分化能力強(qiáng)?；蛐偷挠绊懀翰煌N類及不同品種之間存在差異；2、用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體的選擇55同一植物，不同部位脫分化和再分化能力存在差異：百合：外層＞內(nèi)層；紫草根＞莖葉；蘋果頂芽褐變程度＜側(cè)芽；蘭科：莖尖；還要考慮生產(chǎn)目的：選用植株中主要生產(chǎn)所需的的次級(jí)代謝產(chǎn)物的組織和器官同一植物，不同部位脫分化和再分化能力存在差異：百合：外層＞內(nèi)562、用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體的選擇外植體的生理狀態(tài)：紅豆杉：新生的嫩枝；取材季節(jié)：母株生長旺盛的季節(jié)；紫草：秋天（紫草寧合成和積累）；外植體大小：適當(dāng)大?。幻摱韭屎颓o尖大小及成活率之間的關(guān)系；2、用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體的選擇573、用于分離原生質(zhì)體的外植體的選擇分離原生質(zhì)體則以葉片為最好。苗齡與葉齡有關(guān)；太老不易游離，太嫩，易游離，但細(xì)胞膜易損害；以苗齡15－25d，剛展開的幼葉為最佳。無菌苗幼葉；還要考慮培養(yǎng)目的；多數(shù)情況下，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定；3、用于分離原生質(zhì)體的外植體的選擇584、花粉材料的選擇用作花粉培養(yǎng)的親本植株的基因型、生長情況以及接種時(shí)花粉所處的發(fā)育時(shí)期，對(duì)花粉植株的誘導(dǎo)頻率都有直接的影響。關(guān)鍵選取處于合適發(fā)育期的花藥，離體培養(yǎng)后才能啟動(dòng)花粉發(fā)育。實(shí)踐表明，從減數(shù)分裂期至雙核期的花藥，均有可能誘導(dǎo)離體孤雄發(fā)育。大多數(shù)園藝植物的花藥培養(yǎng)，成功率最高的時(shí)期為單核期，或單核中晚期。第二章植物細(xì)胞的獲取課件59四分體－－小孢子－－單核花粉－－雙核花粉花粉的發(fā)育時(shí)期四分體－－小孢子－－單核花粉－－雙核花粉花粉的發(fā)育時(shí)期60花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)范疇花粉培養(yǎng)也稱為小孢子培養(yǎng)。是從花藥中分離出花粉粒,使之成為分散的或游離的狀態(tài),通過培養(yǎng)使花粉粒脫分化,進(jìn)而發(fā)育成完整植株的過程.屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范疇花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)范疇花粉培養(yǎng)也稱為小孢子培養(yǎng)。是從花藥中611、外植體的滅菌處理

常用表面滅菌劑使用濃度及效果比較表二、外植體的預(yù)處理1、外植體的滅菌處理

常用表面滅菌劑使用濃度及效果比較表二、62幾種常用消毒劑的效果比較消毒劑使用濃度消毒時(shí)間效果殘液去除難易次氯酸鈣/鈉105-30好易新潔爾滅10－205-30好易氯化汞0.1－12-10最好最難過氧化氫10－125-15較好最易抗菌素4－50mg/L30-60較好較難幾種常用消毒劑的效果比較消毒劑使用濃度消毒時(shí)間效果殘液去除難63外植體表面滅菌過程：選材 刷洗、沖洗 用洗衣粉水或肥皂水浸洗并攪動(dòng) 自來水沖凈洗衣粉水70％酒精浸泡10～30秒振蕩0.1％升汞3～10分鐘(表面活性劑)無菌水沖先3～5次接種外植體表面滅菌過程：選材 刷洗、沖洗 用洗衣粉水或肥皂水浸642、外植體的其他處理目的：提高愈傷組織誘導(dǎo)率；促進(jìn)原生質(zhì)體游離。方法：預(yù)培養(yǎng)；暗處理；低溫或高溫處理；萎蔫處理；抗氧化劑處理；高滲透壓預(yù)處理；2、外植體的其他處理目的：提高愈傷組織誘導(dǎo)率；促進(jìn)原生質(zhì)體游65花藥和花粉培養(yǎng)的預(yù)處理：最常用的方法是低溫冷藏。具體做法是將帶有葉鞘的穗子或花蕾用濕紗布包裹后再用塑料袋套起，放在冰箱中冷藏。不同材料對(duì)處理溫度的高低有不同的要求，一般耐寒植物比喜溫可耐受較低的溫度。低溫處理時(shí)間視使用的溫度而定，較低的溫度處理時(shí)間要短，反之則長。煙草7～9度下處理7～14天，水稻7～10度下處理10～15天，大麥3～7度下處理7～14天，都可顯著提高花藥的出愈率。花藥和花粉培養(yǎng)的預(yù)處理：66低溫處理的作用：預(yù)處理引起花藥、花粉內(nèi)源激素發(fā)生變化，改變了小孢子（花粉粒）第一次有絲分裂的軸向發(fā)育（正常發(fā)育時(shí)，兩次有絲分裂形成三核花粉粒），產(chǎn)生兩個(gè)相等核，進(jìn)而形成愈傷組織或胚狀體。保持高比例的強(qiáng)生活力花粉，同時(shí)延緩體細(xì)胞組織的衰老。激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚。促使細(xì)胞同步分裂。技術(shù)要點(diǎn)低溫處理的作用：預(yù)處理引起花藥、花粉內(nèi)源激素發(fā)生變化，改變了67第二節(jié)從外植體直接分離植物細(xì)胞一、機(jī)械搗碎法將外植體搗碎，然后通過過濾和離心分離細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：不用酶，細(xì)胞不會(huì)受到傷害；沒有經(jīng)過質(zhì)壁分離，利于生理生化研究。缺點(diǎn)：機(jī)械作用，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞大，得率低。最佳材料：葉片第二節(jié)從外植體直接分離植物細(xì)胞一、機(jī)械搗碎法68方法及步驟：第一種方法：用刀片刮葉片第二種方法：先把葉片輕輕研碎，然后通過過濾和離心凈化細(xì)胞。葉片表面滅菌→切成小于1cm2的小塊→玻璃勻漿管中勻漿→過濾（孔徑分別為：61m和38m）→低速離心，棄上清→懸浮細(xì)胞→細(xì)胞培養(yǎng)方法及步驟：69二、酶解法利用果膠酶、纖維素酶等處理，分離出具有代謝活性的細(xì)胞；該法不僅能降解中膠層，而且還能軟化細(xì)胞壁。所以在用酶解法分解細(xì)胞的時(shí)候，必須對(duì)細(xì)胞給予滲透壓保護(hù)。常用的滲透壓保護(hù)劑是甘露醇。首次成功：煙草葉細(xì)胞步驟：葉片表面滅菌→撕去下表皮→切成4cm2小塊→放入酶液中→抽真空→搖床上酶解→每30min更換一次酶液（第一次棄去，第二次主要含海綿細(xì)胞，第三、四次主要含柵欄細(xì)胞）→收集細(xì)胞，培養(yǎng)基洗二次后培養(yǎng)二、酶解法利用果膠酶、纖維素酶等處理，分離出具有代謝活性的細(xì)70機(jī)械法和酶解法比較機(jī)械法：細(xì)胞不受到酶的傷害；不用質(zhì)壁分離，有利于進(jìn)行生理和生化研究；容易傷害細(xì)胞結(jié)構(gòu)，獲得完整細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞數(shù)量極低；細(xì)胞易破。酶解法：細(xì)胞受到酶的傷害；要質(zhì)壁分離；細(xì)胞產(chǎn)量高；細(xì)胞不易破。機(jī)械法和酶解法比較71第三節(jié)通過愈傷組織誘導(dǎo)獲取植物細(xì)胞一、獲取過程：（1）誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；（2）愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性。（3）將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物。具體方法：用鑷子或小刀分割得到植物小細(xì)胞團(tuán)；液體培養(yǎng)基中加入小玻璃珠，振蕩培養(yǎng)，使其分散，再過濾獲得；適量的果膠酶可促使細(xì)胞分開。在植物的組織培養(yǎng)中，從一塊外植體形成典型的愈傷組織，大致要經(jīng)歷三個(gè)時(shí)期：啟動(dòng)期、分裂期和形成期。第三節(jié)通過愈傷組織誘導(dǎo)獲取植物細(xì)胞72啟動(dòng)期是指細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期。外源植物生長素對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂效果很好。常用的有：2,4－D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。通常使用細(xì)胞分裂素和生長素比例在1:l或是小于1來誘導(dǎo)植物愈傷組織的形成。分裂期是指外植體細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)以后脫分化，不斷分裂、增生子細(xì)胞的過程。分裂期愈傷組織的特點(diǎn)是：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明。分化期是指在分裂的末期，細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)一系列形態(tài)和生理上的變化，從而使愈傷組織內(nèi)產(chǎn)生不同形態(tài)和功能的細(xì)胞。這些細(xì)胞類型有薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞、纖維細(xì)胞等等。第二章植物細(xì)胞的獲取課件73外植體的細(xì)胞經(jīng)過啟動(dòng)、分裂和分化等一系列變化，形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織。如果在原來的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)愈傷組織，會(huì)由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)不足或有毒代謝物的積累，導(dǎo)致愈傷組織停止生長，甚至老化變黑、死亡。如果要讓愈傷組織繼續(xù)生長增殖，必須定期地（2～4個(gè)星期）將它們分成小塊接種到新鮮的培養(yǎng)基上，這樣愈傷組織就可以長期保持旺盛的生長。即經(jīng)常地繼代培養(yǎng)。

第二章植物細(xì)胞的獲取課件74二、影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素1、外植體：細(xì)胞越成熟，脫分化越困難。無菌萌發(fā)的幼苗。2、培養(yǎng)條件：1）激素的種類及濃度：生長素：2,4－D、IAA、NAA；細(xì)胞分裂素：KT、ZT、6－BA。2）培養(yǎng)基的種類二、影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素753）光照和溫度（21±0.3）℃最佳。4）NH4＋/NO3-5）碳源良好的愈傷組織的條件：高度的胚性或再分化能力；容易分散，以便建立優(yōu)良的懸浮細(xì)胞系和分離原生質(zhì)體；旺盛的增殖能力，以便建立大規(guī)模的無性系；繼代不喪失胚性黑暗培養(yǎng)下煙草的愈傷組織3）光照和溫度黑暗培養(yǎng)下煙草的愈傷組織76繼代培養(yǎng)常見問題

1.變異問題

影響變異的因素：基因型發(fā)生途徑繼代次數(shù)減少變異的措施：選擇變異率低的品種選擇不容易產(chǎn)生變異的發(fā)生途徑嚴(yán)格控制繼代代數(shù)（10代以內(nèi)）繼代培養(yǎng)常見問題1.變異問題77繼代培養(yǎng)常見問題2.玻璃化問題玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的主要原因：一是通氣不良；二是激素濃度太高；三是基因型；四是水分。培養(yǎng)基中可利用水的含量過高，試管苗可吸收的水分太多，植物內(nèi)具有過多的游離水?？朔ＡЩF(xiàn)象的措施：兩個(gè)“增加”：增加瓊脂濃度；增加蔗糖含量；兩個(gè)“增強(qiáng)”：增強(qiáng)溶器通風(fēng)；增強(qiáng)光照；兩個(gè)“加入”：加入滲透劑；加入ABA（脫落酸）；一個(gè)“減少”：減少培養(yǎng)基氮含量。繼代培養(yǎng)常見問題2.玻璃化問題78第四節(jié)通過原生質(zhì)體再生獲取植物細(xì)胞原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。亞原生質(zhì)體(subprotoplast)：在原生質(zhì)體分離過程中，有時(shí)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)含物的斷裂而形成一些較小的原生質(zhì)體就叫做亞原生質(zhì)體。它可以具有細(xì)胞核或沒有細(xì)胞核。胞質(zhì)體（cytoplast）：不含細(xì)胞核而僅含有部分細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。第四節(jié)通過原生質(zhì)體再生獲取植物細(xì)胞原生質(zhì)體(protopl79第四節(jié)通過原生質(zhì)體再生獲取植物細(xì)胞關(guān)于原生質(zhì)體研究的重要成就：1880年，Hanstein首次起用原生質(zhì)體一詞。1960年，Cocking首次應(yīng)用酶法制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功。1971年，Takebe首次得到煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。1985年，F(xiàn)ujimura第一例禾谷類作物－水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。1986年，Spangenberg單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株在甘藍(lán)型油菜上獲得成功。第四節(jié)通過原生質(zhì)體再生獲取植物細(xì)胞關(guān)于原生質(zhì)體研究的重要成80一、植物原生質(zhì)體的材料來源幾乎能從植物的所有部位得到原生質(zhì)體，其中以葉片為多，因?yàn)橹参锶~肉細(xì)胞的原生質(zhì)體有下面幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1.取材容易，植株可來自盆栽和溫室栽培，也可在試管中培育無菌苗。2.原生質(zhì)體在生理和遺傳特性上比較一致。3.比較容易用酶解法分離。根尖組織也是植物原生質(zhì)體的重要來源，它可由各種植物的種子萌發(fā)后取得?；ǚ劢?jīng)特異酶處理也能得到原生質(zhì)體，在單倍體遺傳育種中有特殊的用途。一、植物原生質(zhì)體的材料來源幾乎能從植物的所有部位得到原生質(zhì)81二、植物原生質(zhì)體的材料來源原生質(zhì)體也可以從組織培養(yǎng)的材料中大量獲得。由于組織培養(yǎng)的嚴(yán)格條件，使得材料的重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)材料可做到常年供應(yīng)。值得注意的是，在考慮分離植物原生質(zhì)體時(shí)，既要采用容易獲得原生質(zhì)體的植物材料，但更重要的是要選用易于再生完整植株的細(xì)胞。二、植物原生質(zhì)體的材料來源原生質(zhì)體也可以從組織培養(yǎng)的材料中82第二章植物細(xì)胞的獲取課件83二.植物原生質(zhì)體的分離和純化

(一)原生質(zhì)體的分離早在1892年就有人用機(jī)械法分離原生質(zhì)體。直到1960年，英國的科金(Cocking)首先采用酶解法分離原生質(zhì)體。酶解法有下面幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：能獲得大量的原生質(zhì)體；條件溫和，原生質(zhì)體完整性好；原生質(zhì)體純凈度高；下面以葉片和懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞為材料介紹分離原生質(zhì)體的一般步驟。二.植物原生質(zhì)體的分離和純化

841.材料準(zhǔn)備與表面滅菌2.酶解：用鑷子撕去葉子的下表皮后，切成2厘米見方的小片，使去表皮的一層朝下放入酶液中處理，在25-28℃，黑暗下酶解3-4hr。若采用懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，則采用繼代3d的細(xì)胞最好，經(jīng)離心收集細(xì)胞，放入酶液中置低速轉(zhuǎn)床酶解8-12hr。1.材料準(zhǔn)備與表面滅菌85(二)原生質(zhì)體的純化酶解后純化原生質(zhì)體的步驟如下：1.酶解懸浮液用400目的不銹鋼或尼龍網(wǎng)過濾，以除去未消化的碎片。2.將含有原生質(zhì)體的酶液收集到離心管中，低速離心使原生質(zhì)體沉于管底，倒掉上清液。3.在離心管中加入適量的洗滌液，并離心。4.重復(fù)上述操作三次，使酶解液充分除去，最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌一次。上述的離心純化法可細(xì)分為：A．沉降法；B．漂浮法；C．沉降法和漂浮法結(jié)合等三種。(二)原生質(zhì)體的純化酶解后純化原生質(zhì)體的步驟如下：86原生質(zhì)體培養(yǎng)基分離時(shí)酶的溶劑為原生質(zhì)體培養(yǎng)基甘露醇和蔗糖為滲透壓調(diào)節(jié)劑在酶液中加入適量的氯化鈣和磷酸二氫鉀作為原生質(zhì)體穩(wěn)定劑，可增強(qiáng)質(zhì)膜的穩(wěn)定性原生質(zhì)體培養(yǎng)基分離時(shí)酶的溶劑為原生質(zhì)體培養(yǎng)基87第二章植物細(xì)胞的獲取課件88酶溶劑用原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制酶溶劑用原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制89(三)原生質(zhì)體的活力測(cè)定一是目測(cè)法：憑借形態(tài)可識(shí)別原生質(zhì)體的存活性。二是采用特異的染色方法來確定：0.1%酚藏花紅液染色，活的原生質(zhì)體能吸收而呈紅色，死的則無此能力；伊文思藍(lán)與之相反，僅死原生質(zhì)體可吸收；熒光素雙醋酸酯(FDA)染色，F(xiàn)DA本身沒有熒光和極性，可自由滲透進(jìn)出完整質(zhì)膜。活的原生質(zhì)體的酯酶能分解FDA成為具有熒光的極性物質(zhì)，無活力的不產(chǎn)生熒光。(三)原生質(zhì)體的活力測(cè)定一是目測(cè)法：憑借形態(tài)可識(shí)別原生質(zhì)90Beforeprotoplastscanbecultureditisnecessarytotestthemforviability.Beforeprotoplastscanbecult91三.影響原生質(zhì)體分離的幾個(gè)因素1.

酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶溶液的滲透壓等。不同細(xì)胞細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)有差異，故酶的種類和濃度也不相同，如分離根尖細(xì)胞要有較多的果膠酶；花粉母細(xì)胞及四分體小孢子：蝸牛酶及胼胝質(zhì)酶聯(lián)合；成熟花粉細(xì)胞：果膠酶和纖維素酶。酶液pH值也直接影響分離的速度和穩(wěn)定性。pH值低則分離速度較快，而損壞的較多；pH值高則分離速度較慢，而完整性較好；故酶液的pH值一般為5.7左右。三.影響原生質(zhì)體分離的幾個(gè)因素1.酶解條件：酶質(zhì)量、濃92三.影響原生質(zhì)體分離的幾個(gè)因素2.滲透壓穩(wěn)定劑種類和濃度因材料不同而有變化。在酶液中加入適量的CaCl2和KH2PO4作為原生質(zhì)體穩(wěn)定劑，可增強(qiáng)質(zhì)膜的穩(wěn)定性。3.取材植株的生理狀態(tài)也是重要的因素，如采用懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般用繼代3d的較為理想。三.影響原生質(zhì)體分離的幾個(gè)因素93四.培養(yǎng)原生質(zhì)體的幾種方法原生質(zhì)體經(jīng)分離和純化后，需要進(jìn)行活力測(cè)定