病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件

Pleaseattention!1.您進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，請(qǐng)穿著白大衣以保護(hù)自身安全！2.本實(shí)驗(yàn)課需要顯微鏡，請(qǐng)您攜帶學(xué)生證去四樓顯微鏡室領(lǐng)??！3.請(qǐng)您不要隨意觸碰實(shí)驗(yàn)用品，以免發(fā)生意外！Pleaseattention!1.您進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，請(qǐng)穿著1張文鈺病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室sqjcbwm@126.com實(shí)驗(yàn)一（5學(xué)時(shí)）張文鈺實(shí)驗(yàn)一（5學(xué)時(shí)）2一、實(shí)驗(yàn)室生物安全

熟悉（1）微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全意義（2）實(shí)驗(yàn)室規(guī)則一、實(shí)驗(yàn)室生物安全熟悉（1）微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全意義32004年4月，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心科研人員，采用未經(jīng)論證的非典病毒滅活方法，在不符合防護(hù)要求的普通實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作非典感染材料，造成北京、安徽發(fā)生非典疫情。2010年12月，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)28名師生在“羊活體解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)課”中感染布魯氏菌病。2011年6月，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)免去該校動(dòng)物醫(yī)學(xué)院院長(zhǎng)和黨支書職務(wù)。感染病菌的學(xué)生稱，羊沒有被檢疫，被染病的羊那天被幾個(gè)班級(jí)的學(xué)生重復(fù)使用。2004年4月，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心科研人員，采用未經(jīng)論證的4感染的主要原因是：防護(hù)意識(shí)不強(qiáng)；操作失誤，防護(hù)條件不足。感染的主要原因是：5P4實(shí)驗(yàn)室P2實(shí)驗(yàn)室P1實(shí)驗(yàn)室操作在通常情況下不會(huì)引起人類或者動(dòng)物疾病的微生物操作能夠引起人類或者動(dòng)物疾病，但一般情況下對(duì)人、動(dòng)物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害操作能夠引起人類或者動(dòng)物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物操作能夠引起人類或者動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病的微生物，尚無有效預(yù)防或治療方法P3實(shí)驗(yàn)室P4實(shí)驗(yàn)室P2實(shí)驗(yàn)室P1實(shí)驗(yàn)室操作在通常情況下不會(huì)引起人類或6病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則學(xué)生進(jìn)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須穿好工作服，離室需脫下反折，要經(jīng)常清洗消毒。進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)隨帶書包、衣物等與實(shí)驗(yàn)無關(guān)物品一律存放指定的儲(chǔ)物柜內(nèi)。嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)食、飲水和喧嘩打鬧。手拿培養(yǎng)物后或出實(shí)驗(yàn)室前要洗手，必要時(shí)用消毒液泡手；避免有菌材料濺出；破損器材及時(shí)處理并報(bào)告。實(shí)驗(yàn)過程中避免一切不良的個(gè)人習(xí)慣；操作中產(chǎn)生的廢料要扔在指定容器內(nèi)；實(shí)驗(yàn)完畢清理臺(tái)面，值日生嚴(yán)格認(rèn)真打掃衛(wèi)生，關(guān)閉水電，門窗，洗手后離開實(shí)驗(yàn)室。病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則學(xué)生進(jìn)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須穿好工作服，離7實(shí)驗(yàn)室意外緊急處理辦法1皮膚破損：去除異物，生理鹽水或蒸餾水洗凈后2%碘酊或2%紅汞涂抹。2燒傷：局部涂凡士林，2%鞣酸或2%苦味酸。3化學(xué)藥品腐蝕傷：若強(qiáng)酸則先用大量清水沖洗，再用碳酸氫鈉溶液洗滌中和；若強(qiáng)堿則先用大量清水沖洗，再用2%硼酸洗滌中和（若傷處為眼部加用橄欖油或者液體石蠟1~2滴滴眼）。4菌液入口：立即吐入消毒容器內(nèi)，1：1000高錳酸鉀或3%雙氧水漱口，根據(jù)菌種服用抗菌藥物。5菌液污染臺(tái)面：2%~3%來蘇爾或0.1%新潔爾滅覆蓋30分鐘后抹去，皮膚手指沾染活菌應(yīng)用上述液體浸泡3分后肥皂和清水洗凈。6火警：勿慌，立即關(guān)閉電閘和煤氣閘。若酒精乙醇乙醚等有機(jī)溶劑起火切不可用水撲救，可用沙土等物撲滅。實(shí)驗(yàn)室意外緊急處理辦法1皮膚破損：去除異物，生理鹽水或蒸餾8二、無菌操作技術(shù)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1掌握常用的細(xì)菌接種方法

2熟悉細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象的觀察方法

二、無菌操作技術(shù)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（一）細(xì)菌的分離培養(yǎng)和接種技術(shù)接種工具接種針和接種環(huán)L型玻璃棒接種環(huán)境接種罩、超凈工作臺(tái)或無菌室內(nèi)進(jìn)行。（一）細(xì)菌的分離培養(yǎng)和接種技術(shù)接種工具10接種方法

1.平板劃線接種法：目的：使混合的細(xì)菌呈單個(gè)分散生長(zhǎng)，形成單個(gè)菌落，以便獲得純菌。方法：分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本。連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本。接種方法1.平板劃線接種法：11分區(qū)劃線劃線時(shí)接種環(huán)與平皿約成30-40度角,輕輕接觸,以腕力在瓊脂表面輕快滑動(dòng),不能劃破瓊脂.第一次劃線應(yīng)占平皿面積的1/10,以后每次劃線約占面積的1/4—1/5.劃線為連續(xù)劃線,不能間斷.應(yīng)占滿平皿.劃線不能交叉重復(fù).每次劃完后應(yīng)滅菌.分區(qū)劃線劃線時(shí)接種環(huán)與平皿約成30-40度角,輕輕接觸,以腕12病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件13連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法142.斜面接種法：用于菌種移種，以進(jìn)一步鑒定和保存菌種。

2.斜面接種法：153.半固體穿刺接種法：保存菌種或觀察細(xì)菌的動(dòng)力和生化反應(yīng)。4.液體接種法：用于肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等液體培養(yǎng)基的接種。病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件16將上述已接種細(xì)菌的培養(yǎng)基置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18～24h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)現(xiàn)象。將上述已接種細(xì)菌的培養(yǎng)基置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18～24h17（二）細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)現(xiàn)象（二）細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)現(xiàn)象181.細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象菌落定義：指單個(gè)細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，形成單一肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。菌落特征：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤(rùn)度、黏度、溶血性。菌苔：指多個(gè)菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物。1.細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象菌落19菌落與菌苔菌落菌苔菌落與菌苔菌落菌苔202.細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象混濁：大多數(shù)細(xì)菌沉淀：多見于鏈狀排列的細(xì)菌。菌膜：專性需氧菌（如結(jié)核分枝桿菌、枯草桿菌）。2.細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象混濁：大多數(shù)細(xì)菌21細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象菌膜菌沉淀均勻渾濁對(duì)照細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象菌膜菌沉淀均勻渾濁對(duì)照223.細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象有鞭毛細(xì)菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外擴(kuò)散生長(zhǎng)，穿刺線邊緣模糊。無鞭毛細(xì)菌：只沿穿刺線生長(zhǎng)，穿刺線邊緣清晰。3.細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象有鞭毛細(xì)菌：23細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象有動(dòng)力現(xiàn)象無動(dòng)力現(xiàn)象細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象有動(dòng)力無動(dòng)力24三、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查形態(tài)學(xué)檢查分類

一、不染色標(biāo)本檢查(活體）懸滴法壓滴法二、染色標(biāo)本檢查

單染法：簡(jiǎn)單染色，一種染料（美蘭染色）復(fù)染法：復(fù)雜染色，兩種以上染料（革蘭染色、抗酸染色）

三、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查25革蘭染色(Gramstain)1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立革蘭染色是最常用的一種染色方法，可以將細(xì)菌初步分為革蘭染色陽性菌和革蘭染色陰性菌，在臨床上具有非常重要的意義.革蘭染色(Gramstain)26目的：1、掌握細(xì)菌涂片的制備及革蘭染色的方法2、熟悉革蘭染色的原理和臨床意義目的：1、掌握細(xì)菌涂片的制備及革蘭染色的方法271、通透性學(xué)說2、等電點(diǎn)學(xué)說3、化學(xué)學(xué)說原理：1、通透性學(xué)說原理：28

通透性學(xué)說G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，脂質(zhì)含量少，乙醇不易脫除染料。G-菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄且交聯(lián)度低，含大量脂質(zhì)，乙醇易脫除染料。通透性學(xué)說G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚且29

等電點(diǎn)學(xué)說G+菌等電點(diǎn)（pI2~3）G-菌等電點(diǎn)（pI4~5）

在相同pH條件下G+菌所帶負(fù)電荷比G-菌多，所以與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合較牢固，不易脫色。等電點(diǎn)學(xué)說G+菌等電點(diǎn)（pI2~3）30化學(xué)學(xué)說G+菌菌體內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫等染料牢固結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不易被乙醇脫色G-菌菌體內(nèi)含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色化學(xué)學(xué)說G+菌菌體內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫等染31

器材和試劑：

1、菌種

金黃色色葡萄球菌大腸桿菌

2、試劑革蘭染色液

初染液結(jié)晶紫媒染液盧戈氏碘液脫色液95%乙醇復(fù)染液稀釋石碳酸復(fù)紅

3、其它

接種環(huán)載玻片染色盤洗液瓶酒精燈等

32沖洗染色完成之后，在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果方法與步驟

1、細(xì)菌涂片的制備

涂片干燥固定

2、染色

初染（結(jié)晶紫）媒染（盧戈氏碘液）脫色（95%乙醇）復(fù)染（稀釋石碳酸復(fù)紅）

吸水紙吸干

1min1min30s30s沖洗沖洗沖洗沖洗染色完成之后，在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果方法33一一半半G+菌G-菌結(jié)晶紫盧戈氏碘液95%乙醇石碳酸復(fù)紅初染

媒染

脫色復(fù)染結(jié)果一一半半G34圖一圖二圖一圖二35無菌操作（接種環(huán)滅菌和取菌）涂片的厚度要適中染色的時(shí)間控制，一一半半沖洗的方法，不要對(duì)著涂片區(qū)沖洗觀察后將玻片放入玻片缸中注意事項(xiàng)無菌操作（接種環(huán)滅菌和取菌）注意事項(xiàng)36

意義1.鑒別細(xì)菌2.研究與致病性的關(guān)系3.指導(dǎo)臨床用藥G+G-G+致病外毒素G-致病內(nèi)毒素G+青霉素、頭孢菌素等G-鏈霉素、慶大霉素等意義1.鑒別細(xì)菌2.研究與致病性的3.指導(dǎo)臨床用藥G+G37細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)（示教）

（二毛莢一胞）從細(xì)胞質(zhì)的基礎(chǔ)顆粒長(zhǎng)出，伸到細(xì)胞外面的細(xì)長(zhǎng)呈波狀彎曲的絲狀物。功能：鞭毛運(yùn)動(dòng)可鑒定、與致病性有關(guān)、具有抗原性（H抗原）細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)（示教）

（二毛莢一胞）從細(xì)胞質(zhì)的基礎(chǔ)顆粒長(zhǎng)出38菌毛比鞭毛更更細(xì)、短、直、硬和多的絲狀蛋白附屬物，與運(yùn)動(dòng)無關(guān)，菌毛中空，可分為普通菌毛和性菌毛。功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛傳遞遺傳物質(zhì)。菌毛比鞭毛更更細(xì)、短、直、硬和多的絲狀蛋白附屬物，與運(yùn)動(dòng)無關(guān)39莢膜細(xì)菌細(xì)胞壁外包繞的一層粘液性物質(zhì)，厚度≥0.2μm邊界明顯者稱為莢膜，厚度＜0.2μm者稱為微莢膜。功能：莢膜護(hù)菌強(qiáng)致病---抗吞噬作用、抗有害物質(zhì)損傷、抗干燥作用、黏附作用。莢膜細(xì)菌細(xì)胞壁外包繞的一層粘液性物質(zhì)，厚度≥0.2μm邊界明40菌體內(nèi)部物質(zhì)縮水（60％）形成圓或卵圓形小體。功能：芽胞形態(tài)辨細(xì)菌，滅菌標(biāo)準(zhǔn)抗力強(qiáng)。芽胞菌體內(nèi)部物質(zhì)縮水（60％）形成圓或卵圓形小體。芽胞41油鏡的使用方法尋找視野：在使用油鏡之前，必須先經(jīng)低、高倍鏡觀察，然后將需進(jìn)一步放大的部分移到視野的中心。增大光照強(qiáng)度：將聚光器上升到最高位置，光圈開到最大。轉(zhuǎn)高倍鏡頭、滴加鏡油、換油鏡頭：轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)油鏡，在轉(zhuǎn)換油鏡時(shí)，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件42調(diào)試觀察：觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。［如果不出現(xiàn)物象或者目標(biāo)不理想要重新尋找，在加油區(qū)之外重找時(shí)應(yīng)按：低倍→高倍→油鏡程序。在加油區(qū)內(nèi)重找應(yīng)按：低倍→油鏡程序，不得經(jīng)高倍鏡，以免油沾污鏡頭。］清洗鏡頭：油鏡使用完畢，先用擦鏡紙擦去鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯（或乙醚）擦去殘余的香柏油，最后再用干擦鏡紙擦干凈。調(diào)試觀察：觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。［如果43物鏡工作距離(mm)低倍目鏡10×5.40高倍目鏡40×0.39油鏡頭100×0.11物鏡工作距離(mm)低倍目鏡10×5.40高倍目鏡444

實(shí)驗(yàn)報(bào)告

在封皮上標(biāo)注班級(jí)和第4實(shí)驗(yàn)室革蘭染色一、目的二、原理（主要通透性）三、材料四、方法五、結(jié)果（2+4幅圖）六、意義七、注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

在封皮上標(biāo)注班45作業(yè)重點(diǎn)1、繪制所涂片染色的G+及G-菌的形態(tài)圖并注明放大倍數(shù)（紅藍(lán)鉛筆）2、繪制示教片中各細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)形態(tài)圖并注明放大倍數(shù)（鉛筆）作業(yè)重點(diǎn)1、繪制所涂片染色的G+及G-菌的形態(tài)圖并注明放大倍46Pleaseattention!1.您進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，請(qǐng)穿著白大衣以保護(hù)自身安全！2.本實(shí)驗(yàn)課需要顯微鏡，請(qǐng)您攜帶學(xué)生證去四樓顯微鏡室領(lǐng)??！3.請(qǐng)您不要隨意觸碰實(shí)驗(yàn)用品，以免發(fā)生意外！Pleaseattention!1.您進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，請(qǐng)穿著47張文鈺病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室sqjcbwm@126.com實(shí)驗(yàn)一（5學(xué)時(shí)）張文鈺實(shí)驗(yàn)一（5學(xué)時(shí)）48一、實(shí)驗(yàn)室生物安全

熟悉（1）微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全意義（2）實(shí)驗(yàn)室規(guī)則一、實(shí)驗(yàn)室生物安全熟悉（1）微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全意義492004年4月，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心科研人員，采用未經(jīng)論證的非典病毒滅活方法，在不符合防護(hù)要求的普通實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作非典感染材料，造成北京、安徽發(fā)生非典疫情。2010年12月，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)28名師生在“羊活體解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)課”中感染布魯氏菌病。2011年6月，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)免去該校動(dòng)物醫(yī)學(xué)院院長(zhǎng)和黨支書職務(wù)。感染病菌的學(xué)生稱，羊沒有被檢疫，被染病的羊那天被幾個(gè)班級(jí)的學(xué)生重復(fù)使用。2004年4月，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心科研人員，采用未經(jīng)論證的50感染的主要原因是：防護(hù)意識(shí)不強(qiáng)；操作失誤，防護(hù)條件不足。感染的主要原因是：51P4實(shí)驗(yàn)室P2實(shí)驗(yàn)室P1實(shí)驗(yàn)室操作在通常情況下不會(huì)引起人類或者動(dòng)物疾病的微生物操作能夠引起人類或者動(dòng)物疾病，但一般情況下對(duì)人、動(dòng)物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害操作能夠引起人類或者動(dòng)物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物操作能夠引起人類或者動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病的微生物，尚無有效預(yù)防或治療方法P3實(shí)驗(yàn)室P4實(shí)驗(yàn)室P2實(shí)驗(yàn)室P1實(shí)驗(yàn)室操作在通常情況下不會(huì)引起人類或52病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則學(xué)生進(jìn)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須穿好工作服，離室需脫下反折，要經(jīng)常清洗消毒。進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)隨帶書包、衣物等與實(shí)驗(yàn)無關(guān)物品一律存放指定的儲(chǔ)物柜內(nèi)。嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)食、飲水和喧嘩打鬧。手拿培養(yǎng)物后或出實(shí)驗(yàn)室前要洗手，必要時(shí)用消毒液泡手；避免有菌材料濺出；破損器材及時(shí)處理并報(bào)告。實(shí)驗(yàn)過程中避免一切不良的個(gè)人習(xí)慣；操作中產(chǎn)生的廢料要扔在指定容器內(nèi)；實(shí)驗(yàn)完畢清理臺(tái)面，值日生嚴(yán)格認(rèn)真打掃衛(wèi)生，關(guān)閉水電，門窗，洗手后離開實(shí)驗(yàn)室。病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則學(xué)生進(jìn)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須穿好工作服，離53實(shí)驗(yàn)室意外緊急處理辦法1皮膚破損：去除異物，生理鹽水或蒸餾水洗凈后2%碘酊或2%紅汞涂抹。2燒傷：局部涂凡士林，2%鞣酸或2%苦味酸。3化學(xué)藥品腐蝕傷：若強(qiáng)酸則先用大量清水沖洗，再用碳酸氫鈉溶液洗滌中和；若強(qiáng)堿則先用大量清水沖洗，再用2%硼酸洗滌中和（若傷處為眼部加用橄欖油或者液體石蠟1~2滴滴眼）。4菌液入口：立即吐入消毒容器內(nèi)，1：1000高錳酸鉀或3%雙氧水漱口，根據(jù)菌種服用抗菌藥物。5菌液污染臺(tái)面：2%~3%來蘇爾或0.1%新潔爾滅覆蓋30分鐘后抹去，皮膚手指沾染活菌應(yīng)用上述液體浸泡3分后肥皂和清水洗凈。6火警：勿慌，立即關(guān)閉電閘和煤氣閘。若酒精乙醇乙醚等有機(jī)溶劑起火切不可用水撲救，可用沙土等物撲滅。實(shí)驗(yàn)室意外緊急處理辦法1皮膚破損：去除異物，生理鹽水或蒸餾54二、無菌操作技術(shù)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1掌握常用的細(xì)菌接種方法

2熟悉細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象的觀察方法

二、無菌操作技術(shù)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?5（一）細(xì)菌的分離培養(yǎng)和接種技術(shù)接種工具接種針和接種環(huán)L型玻璃棒接種環(huán)境接種罩、超凈工作臺(tái)或無菌室內(nèi)進(jìn)行。（一）細(xì)菌的分離培養(yǎng)和接種技術(shù)接種工具56接種方法

1.平板劃線接種法：目的：使混合的細(xì)菌呈單個(gè)分散生長(zhǎng)，形成單個(gè)菌落，以便獲得純菌。方法：分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本。連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本。接種方法1.平板劃線接種法：57分區(qū)劃線劃線時(shí)接種環(huán)與平皿約成30-40度角,輕輕接觸,以腕力在瓊脂表面輕快滑動(dòng),不能劃破瓊脂.第一次劃線應(yīng)占平皿面積的1/10,以后每次劃線約占面積的1/4—1/5.劃線為連續(xù)劃線,不能間斷.應(yīng)占滿平皿.劃線不能交叉重復(fù).每次劃完后應(yīng)滅菌.分區(qū)劃線劃線時(shí)接種環(huán)與平皿約成30-40度角,輕輕接觸,以腕58病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件59連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法602.斜面接種法：用于菌種移種，以進(jìn)一步鑒定和保存菌種。

2.斜面接種法：613.半固體穿刺接種法：保存菌種或觀察細(xì)菌的動(dòng)力和生化反應(yīng)。4.液體接種法：用于肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等液體培養(yǎng)基的接種。病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件62將上述已接種細(xì)菌的培養(yǎng)基置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18～24h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)現(xiàn)象。將上述已接種細(xì)菌的培養(yǎng)基置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18～24h63（二）細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)現(xiàn)象（二）細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)現(xiàn)象641.細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象菌落定義：指單個(gè)細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，形成單一肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。菌落特征：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤(rùn)度、黏度、溶血性。菌苔：指多個(gè)菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物。1.細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象菌落65菌落與菌苔菌落菌苔菌落與菌苔菌落菌苔662.細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象混濁：大多數(shù)細(xì)菌沉淀：多見于鏈狀排列的細(xì)菌。菌膜：專性需氧菌（如結(jié)核分枝桿菌、枯草桿菌）。2.細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象混濁：大多數(shù)細(xì)菌67細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象菌膜菌沉淀均勻渾濁對(duì)照細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象菌膜菌沉淀均勻渾濁對(duì)照683.細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象有鞭毛細(xì)菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外擴(kuò)散生長(zhǎng)，穿刺線邊緣模糊。無鞭毛細(xì)菌：只沿穿刺線生長(zhǎng)，穿刺線邊緣清晰。3.細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象有鞭毛細(xì)菌：69細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象有動(dòng)力現(xiàn)象無動(dòng)力現(xiàn)象細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象有動(dòng)力無動(dòng)力70三、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查形態(tài)學(xué)檢查分類

一、不染色標(biāo)本檢查(活體）懸滴法壓滴法二、染色標(biāo)本檢查

單染法：簡(jiǎn)單染色，一種染料（美蘭染色）復(fù)染法：復(fù)雜染色，兩種以上染料（革蘭染色、抗酸染色）

三、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查71革蘭染色(Gramstain)1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立革蘭染色是最常用的一種染色方法，可以將細(xì)菌初步分為革蘭染色陽性菌和革蘭染色陰性菌，在臨床上具有非常重要的意義.革蘭染色(Gramstain)72目的：1、掌握細(xì)菌涂片的制備及革蘭染色的方法2、熟悉革蘭染色的原理和臨床意義目的：1、掌握細(xì)菌涂片的制備及革蘭染色的方法731、通透性學(xué)說2、等電點(diǎn)學(xué)說3、化學(xué)學(xué)說原理：1、通透性學(xué)說原理：74

通透性學(xué)說G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，脂質(zhì)含量少，乙醇不易脫除染料。G-菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄且交聯(lián)度低，含大量脂質(zhì)，乙醇易脫除染料。通透性學(xué)說G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚且75

等電點(diǎn)學(xué)說G+菌等電點(diǎn)（pI2~3）G-菌等電點(diǎn)（pI4~5）

在相同pH條件下G+菌所帶負(fù)電荷比G-菌多，所以與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合較牢固，不易脫色。等電點(diǎn)學(xué)說G+菌等電點(diǎn)（pI2~3）76化學(xué)學(xué)說G+菌菌體內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫等染料牢固結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不易被乙醇脫色G-菌菌體內(nèi)含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色化學(xué)學(xué)說G+菌菌體內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫等染77

器材和試劑：

1、菌種

金黃色色葡萄球菌大腸桿菌

2、試劑革蘭染色液

初染液結(jié)晶紫媒染液盧戈氏碘液脫色液95%乙醇復(fù)染液稀釋石碳酸復(fù)紅

3、其它

接種環(huán)載玻片染色盤洗液瓶酒精燈等

78沖洗染色完成之后，在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果方法與步驟

1、細(xì)菌涂片的制備

涂片干燥固定

2、染色

初染（結(jié)晶紫）媒染（盧戈氏碘液）脫色（95%乙醇）復(fù)染（稀釋石碳酸復(fù)紅）

吸水紙吸干

1min1min30s30s沖洗沖洗沖洗沖洗染色完成之后，在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果方法79一一半半G+菌G-菌結(jié)晶紫盧戈氏碘液95%乙醇石碳酸復(fù)紅初染

媒染

脫色復(fù)染結(jié)果一一半半G80圖一圖二圖一圖二81無菌操作（接種環(huán)滅菌和取菌）涂片的厚度要適中染色的時(shí)間控制，一一半半沖洗的方法，不要對(duì)著涂片區(qū)沖洗觀察后將玻片放入玻片缸中注意事項(xiàng)無菌操作（接種環(huán)滅菌和取菌）注意事項(xiàng)82

意義1.鑒別細(xì)菌2.研究與致病性的關(guān)系3.指導(dǎo)臨床用藥G+G-G+致病外毒素G-致病內(nèi)毒素G+青霉素、頭孢菌素等G-鏈霉素、慶大霉素等意義1.鑒別細(xì)菌2.研究與致病性的3.指導(dǎo)臨床用藥G+G83細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)（示教）

（二毛莢一胞）從細(xì)胞質(zhì)的基礎(chǔ)顆粒長(zhǎng)出，伸到細(xì)胞外面的細(xì)長(zhǎng)呈波狀彎曲的絲狀物。功能：鞭毛運(yùn)動(dòng)可鑒定、