病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件

Pleaseattention!1.您進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時，請穿著白大衣以保護(hù)自身安全！2.本實(shí)驗(yàn)課需要顯微鏡，請您攜帶學(xué)生證去四樓顯微鏡室領(lǐng)取！3.請您不要隨意觸碰實(shí)驗(yàn)用品，以免發(fā)生意外！Pleaseattention!1.您進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時，請穿著1張文鈺病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室sqjcbwm@126.com實(shí)驗(yàn)一（5學(xué)時）張文鈺實(shí)驗(yàn)一（5學(xué)時）2一、實(shí)驗(yàn)室生物安全

熟悉（1）微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全意義（2）實(shí)驗(yàn)室規(guī)則一、實(shí)驗(yàn)室生物安全熟悉（1）微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全意義32004年4月，中國疾病預(yù)防控制中心科研人員，采用未經(jīng)論證的非典病毒滅活方法，在不符合防護(hù)要求的普通實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作非典感染材料，造成北京、安徽發(fā)生非典疫情。2010年12月，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)28名師生在“羊活體解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)課”中感染布魯氏菌病。2011年6月，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)免去該校動物醫(yī)學(xué)院院長和黨支書職務(wù)。感染病菌的學(xué)生稱，羊沒有被檢疫，被染病的羊那天被幾個班級的學(xué)生重復(fù)使用。2004年4月，中國疾病預(yù)防控制中心科研人員，采用未經(jīng)論證的4感染的主要原因是：防護(hù)意識不強(qiáng)；操作失誤，防護(hù)條件不足。感染的主要原因是：5P4實(shí)驗(yàn)室P2實(shí)驗(yàn)室P1實(shí)驗(yàn)室操作在通常情況下不會引起人類或者動物疾病的微生物操作能夠引起人類或者動物疾病，但一般情況下對人、動物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害操作能夠引起人類或者動物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物操作能夠引起人類或者動物非常嚴(yán)重疾病的微生物，尚無有效預(yù)防或治療方法P3實(shí)驗(yàn)室P4實(shí)驗(yàn)室P2實(shí)驗(yàn)室P1實(shí)驗(yàn)室操作在通常情況下不會引起人類或6病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則學(xué)生進(jìn)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須穿好工作服，離室需脫下反折，要經(jīng)常清洗消毒。進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時隨帶書包、衣物等與實(shí)驗(yàn)無關(guān)物品一律存放指定的儲物柜內(nèi)。嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)食、飲水和喧嘩打鬧。手拿培養(yǎng)物后或出實(shí)驗(yàn)室前要洗手，必要時用消毒液泡手；避免有菌材料濺出；破損器材及時處理并報(bào)告。實(shí)驗(yàn)過程中避免一切不良的個人習(xí)慣；操作中產(chǎn)生的廢料要扔在指定容器內(nèi)；實(shí)驗(yàn)完畢清理臺面，值日生嚴(yán)格認(rèn)真打掃衛(wèi)生，關(guān)閉水電，門窗，洗手后離開實(shí)驗(yàn)室。病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則學(xué)生進(jìn)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須穿好工作服，離7實(shí)驗(yàn)室意外緊急處理辦法1皮膚破損：去除異物，生理鹽水或蒸餾水洗凈后2%碘酊或2%紅汞涂抹。2燒傷：局部涂凡士林，2%鞣酸或2%苦味酸。3化學(xué)藥品腐蝕傷：若強(qiáng)酸則先用大量清水沖洗，再用碳酸氫鈉溶液洗滌中和；若強(qiáng)堿則先用大量清水沖洗，再用2%硼酸洗滌中和（若傷處為眼部加用橄欖油或者液體石蠟1~2滴滴眼）。4菌液入口：立即吐入消毒容器內(nèi)，1：1000高錳酸鉀或3%雙氧水漱口，根據(jù)菌種服用抗菌藥物。5菌液污染臺面：2%~3%來蘇爾或0.1%新潔爾滅覆蓋30分鐘后抹去，皮膚手指沾染活菌應(yīng)用上述液體浸泡3分后肥皂和清水洗凈。6火警：勿慌，立即關(guān)閉電閘和煤氣閘。若酒精乙醇乙醚等有機(jī)溶劑起火切不可用水撲救，可用沙土等物撲滅。實(shí)驗(yàn)室意外緊急處理辦法1皮膚破損：去除異物，生理鹽水或蒸餾8二、無菌操作技術(shù)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1掌握常用的細(xì)菌接種方法

2熟悉細(xì)菌生長現(xiàn)象的觀察方法

二、無菌操作技術(shù)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（一）細(xì)菌的分離培養(yǎng)和接種技術(shù)接種工具接種針和接種環(huán)L型玻璃棒接種環(huán)境接種罩、超凈工作臺或無菌室內(nèi)進(jìn)行。（一）細(xì)菌的分離培養(yǎng)和接種技術(shù)接種工具10接種方法

1.平板劃線接種法：目的：使混合的細(xì)菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌。方法：分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本。連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本。接種方法1.平板劃線接種法：11分區(qū)劃線劃線時接種環(huán)與平皿約成30-40度角,輕輕接觸,以腕力在瓊脂表面輕快滑動,不能劃破瓊脂.第一次劃線應(yīng)占平皿面積的1/10,以后每次劃線約占面積的1/4—1/5.劃線為連續(xù)劃線,不能間斷.應(yīng)占滿平皿.劃線不能交叉重復(fù).每次劃完后應(yīng)滅菌.分區(qū)劃線劃線時接種環(huán)與平皿約成30-40度角,輕輕接觸,以腕12病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件13連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法142.斜面接種法：用于菌種移種，以進(jìn)一步鑒定和保存菌種。

2.斜面接種法：153.半固體穿刺接種法：保存菌種或觀察細(xì)菌的動力和生化反應(yīng)。4.液體接種法：用于肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等液體培養(yǎng)基的接種。病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件16將上述已接種細(xì)菌的培養(yǎng)基置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18～24h，觀察細(xì)菌的生長現(xiàn)象。將上述已接種細(xì)菌的培養(yǎng)基置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18～24h17（二）細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象（二）細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象181.細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌落定義：指單個細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單一肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。菌落特征：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性。菌苔：指多個菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物。1.細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌落19菌落與菌苔菌落菌苔菌落與菌苔菌落菌苔202.細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象混濁：大多數(shù)細(xì)菌沉淀：多見于鏈狀排列的細(xì)菌。菌膜：專性需氧菌（如結(jié)核分枝桿菌、枯草桿菌）。2.細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象混濁：大多數(shù)細(xì)菌21細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌膜菌沉淀均勻渾濁對照細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌膜菌沉淀均勻渾濁對照223.細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有鞭毛細(xì)菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外擴(kuò)散生長，穿刺線邊緣模糊。無鞭毛細(xì)菌：只沿穿刺線生長，穿刺線邊緣清晰。3.細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有鞭毛細(xì)菌：23細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有動力現(xiàn)象無動力現(xiàn)象細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有動力無動力24三、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查形態(tài)學(xué)檢查分類

一、不染色標(biāo)本檢查(活體）懸滴法壓滴法二、染色標(biāo)本檢查

單染法：簡單染色，一種染料（美蘭染色）復(fù)染法：復(fù)雜染色，兩種以上染料（革蘭染色、抗酸染色）

三、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查25革蘭染色(Gramstain)1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立革蘭染色是最常用的一種染色方法，可以將細(xì)菌初步分為革蘭染色陽性菌和革蘭染色陰性菌，在臨床上具有非常重要的意義.革蘭染色(Gramstain)26目的：1、掌握細(xì)菌涂片的制備及革蘭染色的方法2、熟悉革蘭染色的原理和臨床意義目的：1、掌握細(xì)菌涂片的制備及革蘭染色的方法271、通透性學(xué)說2、等電點(diǎn)學(xué)說3、化學(xué)學(xué)說原理：1、通透性學(xué)說原理：28

通透性學(xué)說G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，脂質(zhì)含量少，乙醇不易脫除染料。G-菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄且交聯(lián)度低，含大量脂質(zhì)，乙醇易脫除染料。通透性學(xué)說G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚且29

等電點(diǎn)學(xué)說G+菌等電點(diǎn)（pI2~3）G-菌等電點(diǎn)（pI4~5）

在相同pH條件下G+菌所帶負(fù)電荷比G-菌多，所以與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合較牢固，不易脫色。等電點(diǎn)學(xué)說G+菌等電點(diǎn)（pI2~3）30化學(xué)學(xué)說G+菌菌體內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫等染料牢固結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不易被乙醇脫色G-菌菌體內(nèi)含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色化學(xué)學(xué)說G+菌菌體內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫等染31

器材和試劑：

1、菌種

金黃色色葡萄球菌大腸桿菌

2、試劑革蘭染色液

初染液結(jié)晶紫媒染液盧戈氏碘液脫色液95%乙醇復(fù)染液稀釋石碳酸復(fù)紅

3、其它

接種環(huán)載玻片染色盤洗液瓶酒精燈等

32沖洗染色完成之后，在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果方法與步驟

1、細(xì)菌涂片的制備

涂片干燥固定

2、染色

初染（結(jié)晶紫）媒染（盧戈氏碘液）脫色（95%乙醇）復(fù)染（稀釋石碳酸復(fù)紅）

吸水紙吸干

1min1min30s30s沖洗沖洗沖洗沖洗染色完成之后，在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果方法33一一半半G+菌G-菌結(jié)晶紫盧戈氏碘液95%乙醇石碳酸復(fù)紅初染

媒染

脫色復(fù)染結(jié)果一一半半G34圖一圖二圖一圖二35無菌操作（接種環(huán)滅菌和取菌）涂片的厚度要適中染色的時間控制，一一半半沖洗的方法，不要對著涂片區(qū)沖洗觀察后將玻片放入玻片缸中注意事項(xiàng)無菌操作（接種環(huán)滅菌和取菌）注意事項(xiàng)36

意義1.鑒別細(xì)菌2.研究與致病性的關(guān)系3.指導(dǎo)臨床用藥G+G-G+致病外毒素G-致病內(nèi)毒素G+青霉素、頭孢菌素等G-鏈霉素、慶大霉素等意義1.鑒別細(xì)菌2.研究與致病性的3.指導(dǎo)臨床用藥G+G37細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)（示教）

（二毛莢一胞）從細(xì)胞質(zhì)的基礎(chǔ)顆粒長出，伸到細(xì)胞外面的細(xì)長呈波狀彎曲的絲狀物。功能：鞭毛運(yùn)動可鑒定、與致病性有關(guān)、具有抗原性（H抗原）細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)（示教）

（二毛莢一胞）從細(xì)胞質(zhì)的基礎(chǔ)顆粒長出38菌毛比鞭毛更更細(xì)、短、直、硬和多的絲狀蛋白附屬物，與運(yùn)動無關(guān)，菌毛中空，可分為普通菌毛和性菌毛。功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛傳遞遺傳物質(zhì)。菌毛比鞭毛更更細(xì)、短、直、硬和多的絲狀蛋白附屬物，與運(yùn)動無關(guān)39莢膜細(xì)菌細(xì)胞壁外包繞的一層粘液性物質(zhì)，厚度≥0.2μm邊界明顯者稱為莢膜，厚度＜0.2μm者稱為微莢膜。功能：莢膜護(hù)菌強(qiáng)致病---抗吞噬作用、抗有害物質(zhì)損傷、抗干燥作用、黏附作用。莢膜細(xì)菌細(xì)胞壁外包繞的一層粘液性物質(zhì)，厚度≥0.2μm邊界明40菌體內(nèi)部物質(zhì)縮水（60％）形成圓或卵圓形小體。功能：芽胞形態(tài)辨細(xì)菌，滅菌標(biāo)準(zhǔn)抗力強(qiáng)。芽胞菌體內(nèi)部物質(zhì)縮水（60％）形成圓或卵圓形小體。芽胞41油鏡的使用方法尋找視野：在使用油鏡之前，必須先經(jīng)低、高倍鏡觀察，然后將需進(jìn)一步放大的部分移到視野的中心。增大光照強(qiáng)度：將聚光器上升到最高位置，光圈開到最大。轉(zhuǎn)高倍鏡頭、滴加鏡油、換油鏡頭：轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動油鏡，在轉(zhuǎn)換油鏡時，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件42調(diào)試觀察：觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。［如果不出現(xiàn)物象或者目標(biāo)不理想要重新尋找，在加油區(qū)之外重找時應(yīng)按：低倍→高倍→油鏡程序。在加油區(qū)內(nèi)重找應(yīng)按：低倍→油鏡程序，不得經(jīng)高倍鏡，以免油沾污鏡頭。］清洗鏡頭：油鏡使用完畢，先用擦鏡紙擦去鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯（或乙醚）擦去殘余的香柏油，最后再用干擦鏡紙擦干凈。調(diào)試觀察：觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。［如果43物鏡工作距離(mm)低倍目鏡10×5.40高倍目鏡40×0.39油鏡頭100×0.11物鏡工作距離(mm)低倍目鏡10×5.40高倍目鏡444

實(shí)驗(yàn)報(bào)告

在封皮上標(biāo)注班級和第4實(shí)驗(yàn)室革蘭染色一、目的二、原理（主要通透性）三、材料四、方法五、結(jié)果（2+4幅圖）六、意義七、注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

在封皮上標(biāo)注班45作業(yè)重點(diǎn)1、繪制所涂片染色的G+及G-菌的形態(tài)圖并注明放大倍數(shù)（紅藍(lán)鉛筆）2、繪制示教片中各細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)形態(tài)圖并注明放大倍數(shù)（鉛筆）作業(yè)重點(diǎn)1、繪制所涂片染色的G+及G-菌的形態(tài)圖并注明放大倍46Pleaseattention!1.您進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時，請穿著白大衣以保護(hù)自身安全！2.本實(shí)驗(yàn)課需要顯微鏡，請您攜帶學(xué)生證去四樓顯微鏡室領(lǐng)取！3.請您不要隨意觸碰實(shí)驗(yàn)用品，以免發(fā)生意外！Pleaseattention!1.您進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時，請穿著47張文鈺病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室sqjcbwm@126.com實(shí)驗(yàn)一（5學(xué)時）張文鈺實(shí)驗(yàn)一（5學(xué)時）48一、實(shí)驗(yàn)室生物安全

熟悉（1）微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全意義（2）實(shí)驗(yàn)室規(guī)則一、實(shí)驗(yàn)室生物安全熟悉（1）微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全意義492004年4月，中國疾病預(yù)防控制中心科研人員，采用未經(jīng)論證的非典病毒滅活方法，在不符合防護(hù)要求的普通實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作非典感染材料，造成北京、安徽發(fā)生非典疫情。2010年12月，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)28名師生在“羊活體解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)課”中感染布魯氏菌病。2011年6月，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)免去該校動物醫(yī)學(xué)院院長和黨支書職務(wù)。感染病菌的學(xué)生稱，羊沒有被檢疫，被染病的羊那天被幾個班級的學(xué)生重復(fù)使用。2004年4月，中國疾病預(yù)防控制中心科研人員，采用未經(jīng)論證的50感染的主要原因是：防護(hù)意識不強(qiáng)；操作失誤，防護(hù)條件不足。感染的主要原因是：51P4實(shí)驗(yàn)室P2實(shí)驗(yàn)室P1實(shí)驗(yàn)室操作在通常情況下不會引起人類或者動物疾病的微生物操作能夠引起人類或者動物疾病，但一般情況下對人、動物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害操作能夠引起人類或者動物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物操作能夠引起人類或者動物非常嚴(yán)重疾病的微生物，尚無有效預(yù)防或治療方法P3實(shí)驗(yàn)室P4實(shí)驗(yàn)室P2實(shí)驗(yàn)室P1實(shí)驗(yàn)室操作在通常情況下不會引起人類或52病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則學(xué)生進(jìn)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須穿好工作服，離室需脫下反折，要經(jīng)常清洗消毒。進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時隨帶書包、衣物等與實(shí)驗(yàn)無關(guān)物品一律存放指定的儲物柜內(nèi)。嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)食、飲水和喧嘩打鬧。手拿培養(yǎng)物后或出實(shí)驗(yàn)室前要洗手，必要時用消毒液泡手；避免有菌材料濺出；破損器材及時處理并報(bào)告。實(shí)驗(yàn)過程中避免一切不良的個人習(xí)慣；操作中產(chǎn)生的廢料要扔在指定容器內(nèi)；實(shí)驗(yàn)完畢清理臺面，值日生嚴(yán)格認(rèn)真打掃衛(wèi)生，關(guān)閉水電，門窗，洗手后離開實(shí)驗(yàn)室。病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則學(xué)生進(jìn)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須穿好工作服，離53實(shí)驗(yàn)室意外緊急處理辦法1皮膚破損：去除異物，生理鹽水或蒸餾水洗凈后2%碘酊或2%紅汞涂抹。2燒傷：局部涂凡士林，2%鞣酸或2%苦味酸。3化學(xué)藥品腐蝕傷：若強(qiáng)酸則先用大量清水沖洗，再用碳酸氫鈉溶液洗滌中和；若強(qiáng)堿則先用大量清水沖洗，再用2%硼酸洗滌中和（若傷處為眼部加用橄欖油或者液體石蠟1~2滴滴眼）。4菌液入口：立即吐入消毒容器內(nèi)，1：1000高錳酸鉀或3%雙氧水漱口，根據(jù)菌種服用抗菌藥物。5菌液污染臺面：2%~3%來蘇爾或0.1%新潔爾滅覆蓋30分鐘后抹去，皮膚手指沾染活菌應(yīng)用上述液體浸泡3分后肥皂和清水洗凈。6火警：勿慌，立即關(guān)閉電閘和煤氣閘。若酒精乙醇乙醚等有機(jī)溶劑起火切不可用水撲救，可用沙土等物撲滅。實(shí)驗(yàn)室意外緊急處理辦法1皮膚破損：去除異物，生理鹽水或蒸餾54二、無菌操作技術(shù)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1掌握常用的細(xì)菌接種方法

2熟悉細(xì)菌生長現(xiàn)象的觀察方法

二、無菌操作技術(shù)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?5（一）細(xì)菌的分離培養(yǎng)和接種技術(shù)接種工具接種針和接種環(huán)L型玻璃棒接種環(huán)境接種罩、超凈工作臺或無菌室內(nèi)進(jìn)行。（一）細(xì)菌的分離培養(yǎng)和接種技術(shù)接種工具56接種方法

1.平板劃線接種法：目的：使混合的細(xì)菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌。方法：分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本。連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本。接種方法1.平板劃線接種法：57分區(qū)劃線劃線時接種環(huán)與平皿約成30-40度角,輕輕接觸,以腕力在瓊脂表面輕快滑動,不能劃破瓊脂.第一次劃線應(yīng)占平皿面積的1/10,以后每次劃線約占面積的1/4—1/5.劃線為連續(xù)劃線,不能間斷.應(yīng)占滿平皿.劃線不能交叉重復(fù).每次劃完后應(yīng)滅菌.分區(qū)劃線劃線時接種環(huán)與平皿約成30-40度角,輕輕接觸,以腕58病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件59連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法602.斜面接種法：用于菌種移種，以進(jìn)一步鑒定和保存菌種。

2.斜面接種法：613.半固體穿刺接種法：保存菌種或觀察細(xì)菌的動力和生化反應(yīng)。4.液體接種法：用于肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等液體培養(yǎng)基的接種。病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件62將上述已接種細(xì)菌的培養(yǎng)基置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18～24h，觀察細(xì)菌的生長現(xiàn)象。將上述已接種細(xì)菌的培養(yǎng)基置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18～24h63（二）細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象（二）細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象641.細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌落定義：指單個細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單一肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。菌落特征：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性。菌苔：指多個菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物。1.細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌落65菌落與菌苔菌落菌苔菌落與菌苔菌落菌苔662.細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象混濁：大多數(shù)細(xì)菌沉淀：多見于鏈狀排列的細(xì)菌。菌膜：專性需氧菌（如結(jié)核分枝桿菌、枯草桿菌）。2.細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象混濁：大多數(shù)細(xì)菌67細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌膜菌沉淀均勻渾濁對照細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌膜菌沉淀均勻渾濁對照683.細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有鞭毛細(xì)菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外擴(kuò)散生長，穿刺線邊緣模糊。無鞭毛細(xì)菌：只沿穿刺線生長，穿刺線邊緣清晰。3.細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有鞭毛細(xì)菌：69細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有動力現(xiàn)象無動力現(xiàn)象細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有動力無動力70三、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查形態(tài)學(xué)檢查分類

一、不染色標(biāo)本檢查(活體）懸滴法壓滴法二、染色標(biāo)本檢查

單染法：簡單染色，一種染料（美蘭染色）復(fù)染法：復(fù)雜染色，兩種以上染料（革蘭染色、抗酸染色）

三、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查71革蘭染色(Gramstain)1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立革蘭染色是最常用的一種染色方法，可以將細(xì)菌初步分為革蘭染色陽性菌和革蘭染色陰性菌，在臨床上具有非常重要的意義.革蘭染色(Gramstain)72目的：1、掌握細(xì)菌涂片的制備及革蘭染色的方法2、熟悉革蘭染色的原理和臨床意義目的：1、掌握細(xì)菌涂片的制備及革蘭染色的方法731、通透性學(xué)說2、等電點(diǎn)學(xué)說3、化學(xué)學(xué)說原理：1、通透性學(xué)說原理：74

通透性學(xué)說G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，脂質(zhì)含量少，乙醇不易脫除染料。G-菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄且交聯(lián)度低，含大量脂質(zhì)，乙醇易脫除染料。通透性學(xué)說G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚且75

等電點(diǎn)學(xué)說G+菌等電點(diǎn)（pI2~3）G-菌等電點(diǎn)（pI4~5）

在相同pH條件下G+菌所帶負(fù)電荷比G-菌多，所以與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合較牢固，不易脫色。等電點(diǎn)學(xué)說G+菌等電點(diǎn)（pI2~3）76化學(xué)學(xué)說G+菌菌體內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫等染料牢固結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不易被乙醇脫色G-菌菌體內(nèi)含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色化學(xué)學(xué)說G+菌菌體內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫等染77

器材和試劑：

1、菌種

金黃色色葡萄球菌大腸桿菌

2、試劑革蘭染色液

初染液結(jié)晶紫媒染液盧戈氏碘液脫色液95%乙醇復(fù)染液稀釋石碳酸復(fù)紅

3、其它

接種環(huán)載玻片染色盤洗液瓶酒精燈等

78沖洗染色完成之后，在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果方法與步驟

1、細(xì)菌涂片的制備

涂片干燥固定

2、染色

初染（結(jié)晶紫）媒染（盧戈氏碘液）脫色（95%乙醇）復(fù)染（稀釋石碳酸復(fù)紅）

吸水紙吸干

1min1min30s30s沖洗沖洗沖洗沖洗染色完成之后，在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果方法79一一半半G+菌G-菌結(jié)晶紫盧戈氏碘液95%乙醇石碳酸復(fù)紅初染

媒染

脫色復(fù)染結(jié)果一一半半G80圖一圖二圖一圖二81無菌操作（接種環(huán)滅菌和取菌）涂片的厚度要適中染色的時間控制，一一半半沖洗的方法，不要對著涂片區(qū)沖洗觀察后將玻片放入玻片缸中注意事項(xiàng)無菌操作（接種環(huán)滅菌和取菌）注意事項(xiàng)82

意義1.鑒別細(xì)菌2.研究與致病性的關(guān)系3.指導(dǎo)臨床用藥G+G-G+致病外毒素G-致病內(nèi)毒素G+青霉素、頭孢菌素等G-鏈霉素、慶大霉素等意義1.鑒別細(xì)菌2.研究與致病性的3.指導(dǎo)臨床用藥G+G83細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)（示教）

（二毛莢一胞）從細(xì)胞質(zhì)的基礎(chǔ)顆粒長出，伸到細(xì)胞外面的細(xì)長呈波狀彎曲的絲狀物。功能：鞭毛運(yùn)動可鑒定、