2013分子生物學-3 -3 .質粒及基因工程

病毒基因組核基因組原核生物基因組真核生物基因組線粒體DNA核外遺傳物質葉粒體DNA質粒DNA非獨立的基因組：轉位因子—能在基因組DNA中移動的DNA序列，不能獨立存在，需插入核或核外DNA中。DNAdetective探針1.RFLP2.SSR/STR3.SNP應用：正常樣本的差異鑒定病理樣本的變化DNA條形碼（DNAbarcode）是指生物體內能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段。2003年，加拿大動物學家PaulHebert最早提出對物種進行快速準確鑒定。及物種間親緣關系，修改已有的分類學結論等。CO1基因位于細胞線粒體中，只能從母體中遺傳，線粒體DNA積聚突變的速度比核DNA快10倍。DNAbarcodingPotentialefficacyofmitochondrialgenesforanimalDNAbarcoding:acasestudyusingeutherianmammals.LuoA,etal.BMCGenomics.2011Jan28;12:84.植物條形碼rbcL+matK+ITSComparativeanalysisofalargedatasetindicatesthatinternaltranscribedspacer(ITS)shouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants.LiDZ,etal.PNAS.2011Dec6;108(49):19641-6.Dr.&Prof.De-ZhuLi(李德銖)Dr.&Prof.PaulHebert核外遺傳物質的結構及功能

多數(shù)質粒是雙鏈超螺旋共價閉合環(huán)狀cccDNA，（covalentlyclosedandcircular）質粒DNAPlasmid

1.存在于原核生物、真菌和少數(shù)植物細胞中，是一種核外遺傳物質，但不是細胞生存所必需的；2.質粒DNA含有少量編碼蛋白的基因，這些基因對宿主細胞的生存影響不大，但能改變細胞的某些性狀，如抗性、降解有機物的酶等3.有自己的復制起始序列，獨立于核DNA進行復制；（有獨立的復制系統(tǒng)）質粒是分子生物學中最常見的克隆載體Vector,Vehicle

質粒的特性1.質粒具有可轉移性，如F質粒；2.可整合性；（整合、重組DNA的交換）3.拷貝數(shù)；嚴緊型（一個或幾個）據(jù)細胞中質粒的多少松弛型（十~幾十）4.質粒DNA的不相容性patibility在同一個宿主細胞中，不能同時存在兩種同一不相容群的質粒（同一類型、同一復制系統(tǒng)的不同質粒不能同時存在于同一細胞中，但兩種不同類型的質?？纱嬖谟谕患毎?。）復制時間/效率

幾種常見的質粒1.細菌質粒F—質粒（又稱F-因子或性質粒sexplasmid）高頻重組質粒，具可轉移性和整合性，拷貝數(shù)低；R—質粒抗性質粒，含抗藥、分解有毒物質等的基因；Col質粒（大腸桿菌素因子）含有編碼控制大腸桿菌素合成的基因，（一種可以使不帶Col質粒的細菌菌株致死的蛋白）F質粒（1）F+菌株（2）F-菌株（3）Hfr菌株（4）F’菌株Rplasmid

2.酵母質粒2u質粒雙鏈環(huán)狀DNA，周長2um，6318bp3u質粒環(huán)狀DNA，周長3um線狀殺傷質粒RNA質粒，線狀，能分泌一種殺傷因子，對其他酵母有殺傷作用，以保護自身。3.真菌質粒有線狀，也有環(huán)狀，有的能整合到線粒體中，有的與菌絲的衰老有關。4.植物中的質粒類似于真菌，有線狀，也有環(huán)狀，有的能整合到線粒體中。載體和受體的選擇l-DNA

幾種載體的最大裝載量質?？妓官|粒15kb25kb45kbBAC300kbYAC400kb質粒DNA在分子生物學中的應用基因克隆（gene；酶；受體；載體）,DNA擴增（松弛型質粒）測序、表達RestrictionenzymerestrictionendonucleaseenzymethatcutsDNAstrandsatspecificsitesII型限制性核酸內切酶的基本特性識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點回文詩靜思伊久阻歸期，久阻歸期憶別離；憶別離時聞漏轉，時聞漏轉靜思伊。采蓮人在綠楊津，在綠楊津一闋新；一闋新歌聲漱玉，歌聲漱玉采蓮人。賞花歸去馬如飛，去馬如飛酒力微；酒力微醒時已暮，醒時已暮賞花歸。

《思妻詩》宋李禺枯眼望遙山隔水，往來曾見幾心知？壺空怕酌一杯酒，筆下難成和韻詩。途路陽人離別久，訊音無雁寄回遲。孤燈夜守長寥寂，

夫憶妻兮父憶兒。《思夫詩》

兒憶父兮妻憶夫，

寂寥長守夜燈孤。遲回寄雁無音訊，久別離人陽路途。詩韻和成難下筆，酒杯一酌怕空壺。知心幾見曾往來，水隔山遙望眼枯。5’3’LigaseenzymeusedtojointwopiecesofDNA轉化方法磷酸鈣共沉淀法電擊轉化法脂質體介導法顯微注射法病毒轉染法基因克隆clone在多細胞的高等生物個體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotictwins）便是屬于同一克隆。在細胞水平上，克隆一詞是指由同一個祖細胞（progenitorcell）分裂而來的一群帶有完全相同遺傳物質的子細胞。在分子生物學上，人們把將外源DNA插入具有復制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復制這種過程稱為克隆。

Expressiontheappearanceofatraitdirectedbyagenetraitacharacteristicresultingfromgeneexpression基因文庫的基本概念基因庫與基因文庫基因庫（genepool）

特定生物體全基因組的集合（天然存在）基因文庫（genelibraryorgenebank）

從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式基因組文庫（含有全部基因）

存在（人工構建）。根據(jù)構建方法的不同，基因文庫分為：cDNA文庫（含有全部蛋白質編碼的結構基因）

基因組DNA文庫構建把某種生物的基因組DNA切成適當大小，分別與載體組合，導入微生物細胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克?。ɡ碚撋厦總€序列至少有一個代表），這樣的克隆片段的總匯，稱為基因組DNA文庫?；蛭膸鞓嫿ǖ幕緫?zhàn)略用鳥槍法構建基因組文庫，材料來自染色體DNA用cDNA法構建cDNA文庫，材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的mRNA種類不同,因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細胞的界定.很顯然，cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫基因文庫的構建程序基因組DNA的制備

基因組DNA的切割超聲波處理限制性內切酶部分酶切shotgunmarriageashotgunmarriage（或ashotgunwedding）這個表達源于二、三百年前的美國。Ashotgunmarriage的定義是：oneorbothpartiesareforcedintomarriageduetoanunplannedpregnancy（奉子成婚）。圖5-13用Sau3A限制性核酸內切酶消化真核生物基因組DNA并利用噬菌體載體構建基因組文庫的過程圖示。

染色體走讀法（chromosomewalking）排序走讀的起點克隆片段真核生物基因組DNA龐大，有大量重復序列，很難直接分離得到靶基因片段。而cDNA來自反轉錄的mRNA，無冗余序列，通過篩選cDNA文庫，可較快地分離到相關基因。cDNA文庫的構建細胞中的總RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一個典型的動物細胞約含10-5μgRNA，其中：80%-85%為rRNA15%-20%為tRNA及sRNAmRNA約占總RNA的1%-5%rRNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，特別是28S和18S特征性條帶是電泳鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。圖5-14PolyATtractmRNA的分離純化過程簡圖。RNA的濃度和純度可以通過測定其OD260和OD280來判斷。OD260為1時相當于濃度為40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之間，表示所提取的RNA純度較好，如果樣品中有蛋白質或酚污染，則OD260/OD280的比值將明顯低于1.8。由于RNA分子敏感脆弱，在自然狀態(tài)下難以被擴增，為了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般將其反轉錄成穩(wěn)定的DNA雙螺旋（cDNA，complementaryDNA），再插入到可以自我復制的載體中。cDNA文庫的構建cDNA的長度一般在0.5-8kb之間，質粒載體和噬菌體類載體都能滿足要求。cDNA文庫常用Uni-zapXR（一種λ噬菌粒載體）做載體，它具備噬菌體的高效性和質粒載體系統(tǒng)利用藍白斑篩選的便利，可容納0-10kbDNA插入片段，含有pBluescript載體的全部序列。重組后可通過體內剪切反應（InVivoExcision）將cDNA插入片段轉移到質粒系統(tǒng)中進行篩選、克隆和序列分析。

基因文庫的篩選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選的方法有很多種，如核酸雜交法，PCR篩選法和免疫篩選法等。1、核酸雜交法：核酸雜交法以其廣泛的適用性和快速性成為基因文庫篩選中最常用的一種方法，用放射性標記的特異DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選。將待篩選菌落轉移到硝酸纖維素膜上，適當溫育。同時保留原來的菌落平板作對照。取出已經長有菌落的膜，用堿液處理，使菌落發(fā)生裂解，DNA隨之變性。用蛋白酶K處理硝酸纖維素膜去除蛋白質，形成菌落DNA的印跡。80℃烘烤濾膜，將DNA固定在膜上。將濾膜與放射性標記的DNA或RNA探針雜交，通過放射性自顯影