衛(wèi)生分析化學(xué)-分子熒光法

1分子熒光法

2第一節(jié)概論物質(zhì)分子的能級包括一系列電子能級。每個(gè)電子能級包含多個(gè)振動(dòng)能級。每個(gè)振動(dòng)能級包含多個(gè)轉(zhuǎn)動(dòng)能級。通常情況下，大多數(shù)分子處于處于電子能級的基態(tài)，當(dāng)分子收到激發(fā)，吸收能量，就會(huì)發(fā)生能級躍遷，至激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，將很快釋放出能量，躍遷回基態(tài)。3若激發(fā)態(tài)分子以光輻射的形式釋放能量的形式回到基態(tài)，這時(shí)的發(fā)射光稱為熒光。外界提供能量的方式有多種，如光照、加熱、化學(xué)反應(yīng)及生物代謝等。通過光照激發(fā)產(chǎn)生的熒光稱為光致熒光。一旦外界能源消失，則熒光也隨之消失。根據(jù)激發(fā)光的波長不同，熒光可分為Ｘ射線熒光、紫外可見熒光和紅外熒光等。根據(jù)發(fā)射熒光的粒子不同，熒光又可分為分子熒光和原子熒光。4

由于不同的物質(zhì)其組成與結(jié)構(gòu)不同，所吸收光的波長和發(fā)射光的波長也不同，利用這個(gè)特性可以進(jìn)行物質(zhì)的定性鑒別。如果該物質(zhì)的濃度不同，它所發(fā)射的熒光強(qiáng)度就不同，測量物質(zhì)的熒光強(qiáng)度可對其進(jìn)行定量測定。5

熒光分析法（fluorescenceanalysis）就是利用物質(zhì)的熒光特征和強(qiáng)度，對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。

其特點(diǎn)是靈敏度高、選擇性好、樣品用量少和操作簡便。它的靈敏度通常比分光光度法高2～3個(gè)數(shù)量級。在衛(wèi)生檢驗(yàn)、環(huán)境及食品分析、藥物分析、生化和臨床檢驗(yàn)等方面有著廣泛的應(yīng)用。

第二節(jié)熒光分析法的基本原理一、分子熒光的發(fā)生過程

多數(shù)分子含偶數(shù)個(gè)電子，在基態(tài)時(shí)，電子成對地填充在能量較低的各軌道中。根據(jù)保利（Pauli）不相容原理，一個(gè)給定軌道中的兩個(gè)電子必定具有相反的自旋，總自旋量子數(shù)等于各電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和，即基態(tài)沒有凈自旋。當(dāng)分子處在外磁場中時(shí)，分子能級不會(huì)發(fā)生分裂，這種狀態(tài)稱為單（重）線態(tài)。當(dāng)分子受光激發(fā)時(shí)，通常一個(gè)電子可形成兩種激發(fā)態(tài)：激發(fā)單線態(tài)（S）和激發(fā)三線態(tài)（T）。78

分子吸收能量后，從基態(tài)最低振動(dòng)能級躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)或更高電子激發(fā)態(tài)的不同振動(dòng)能級（這一過程速度很快，大約10-15s），成為激發(fā)單重態(tài)分子。激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，可以通過以下幾種途徑釋放能量返回基態(tài)。9101.振動(dòng)馳豫這一過程只能發(fā)生在同一電子能級內(nèi)，即分子通過碰撞以熱的形式損失部分能量，從較高振動(dòng)能級下降到該電子能級的最低振動(dòng)能級上。由于這一部分能量以熱的形式釋放，而不是以光輻射形式發(fā)出，故振動(dòng)馳豫屬于無輻射躍遷。112.內(nèi)轉(zhuǎn)換即激發(fā)態(tài)分子將多余的能量轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?，從較高電子能級降至較低的電子能級。內(nèi)轉(zhuǎn)換也屬于無輻射躍遷。123.熒光

較高激發(fā)態(tài)分子經(jīng)無輻射躍遷降至第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級后，仍不穩(wěn)定，停留較短時(shí)間后（約10-8s，稱作熒光壽命），以光輻射形式放出能量，回到基態(tài)各振動(dòng)能級，這時(shí)所發(fā)射的光稱為熒光。134.系間竄躍（體系間跨越）有些物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子通過振動(dòng)馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級后，有可能經(jīng)過另一個(gè)無輻射躍遷轉(zhuǎn)移至激發(fā)三重態(tài)，這一過程伴隨著自旋方向的改變，稱為系間竄躍。對于大多數(shù)物質(zhì)，系間竄躍是禁阻的。如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，由于自旋軌道的強(qiáng)偶合作用，電子自旋方向可以改變，系間竄躍就變得容易了。

145.磷光經(jīng)系間竄躍的分子再通過振動(dòng)馳豫降至激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級，停留一段時(shí)間（10-4～10s，稱作磷光壽命），然后以光輻射形式放出能量返回到基態(tài)各振動(dòng)能級，這時(shí)發(fā)出的光稱為磷光（phosphorescence）。由于激發(fā)三重態(tài)能量比激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級能量低，故磷光輻射的能量比熒光更小，即磷光的波長比熒光更長。156.外轉(zhuǎn)換激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子間相互作用，并以熱的形式損失部分能量的過程稱為外轉(zhuǎn)換。外轉(zhuǎn)換使熒光強(qiáng)度減弱或消失，導(dǎo)致熒光猝滅。16二、激發(fā)光譜和熒光光譜（一）熒光的檢測

光源發(fā)出的紫外可見光通過激發(fā)單色器分出不同波長的激發(fā)光，照射到樣品溶液上，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。樣品發(fā)出的熒光為寬帶光譜，需通過發(fā)射單色器分光后再進(jìn)入檢測器，檢測不同發(fā)射波長下的熒光強(qiáng)度F。由于激發(fā)光不可能完全被吸收，可透過溶液，為了防止透射光對熒光測定的干擾，常在與激發(fā)光垂直的方向檢測熒光。

17（二）激發(fā)光譜與熒光光譜的形成

任何熒光物質(zhì)，都具有兩種特征光譜，即激發(fā)光譜(excitationspectrum)和熒光發(fā)射光譜(fluorescenceemissionspectrum)。

181.激發(fā)光譜保持熒光發(fā)射波長不變（即固定發(fā)射單色器），依次改變激發(fā)光波長（即調(diào)節(jié)激發(fā)單色器），測定不同波長的激發(fā)光激發(fā)下得到的熒光強(qiáng)度F（即激發(fā)光波長掃描）。然后以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)作圖，就可得到該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。19

激發(fā)光譜上熒光強(qiáng)度最大值所對應(yīng)的波長就是最大激發(fā)波長，是激發(fā)熒光最靈敏的波長。物質(zhì)的激發(fā)光譜與它的吸收光譜相似，所不同的是縱坐標(biāo)。202.熒光光譜熒光光譜，又稱發(fā)射光譜。保持激發(fā)光波長不變（即固定激發(fā)單色器），依次改變熒光發(fā)射波長，測定樣品在不同波長處發(fā)射的熒光強(qiáng)度F（即發(fā)射光波長掃描）。以發(fā)射波長為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)作圖，得到熒光發(fā)射光譜。熒光發(fā)射光譜上熒光強(qiáng)度最大值所對應(yīng)的波長就是最大發(fā)射波長。2122（三）熒光光譜與激發(fā)光譜的關(guān)系

熒光光譜形狀與激發(fā)光波長無關(guān)

由于熒光是分子從第一電子激發(fā)態(tài)（單線態(tài)）的最低振動(dòng)能級返回到基態(tài)的各振動(dòng)能級時(shí)釋放的光輻射，與分子被激發(fā)至哪一個(gè)電子激發(fā)態(tài)無關(guān)。232.熒光光譜比激發(fā)光譜波長為長

由于分子吸收激發(fā)光被激發(fā)至較高激發(fā)態(tài)后，先經(jīng)無輻射躍遷（振動(dòng)馳豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換）損失掉一部分能量，到達(dá)第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級，再由此發(fā)出熒光。因此，熒光發(fā)射能量比激發(fā)光能量低，熒光光譜波長比激發(fā)光波長長。243.熒光光譜與激發(fā)光譜鏡像對稱對于大多數(shù)有機(jī)分子（尤其是高度對稱的），其熒光光譜與激發(fā)光譜（較長波長區(qū)）呈鏡像對稱關(guān)系。25解釋：能級結(jié)構(gòu)相似性熒光光譜為第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級而形成，即其形狀與基態(tài)振動(dòng)能級分布有關(guān)。激發(fā)光譜（較長波長區(qū)）是由基態(tài)最低振動(dòng)能級躍遷到第一電子激發(fā)單重態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級而形成，即其形狀與第一電子激發(fā)單重態(tài)的振動(dòng)能級分布有關(guān)。由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的振動(dòng)能級分布具有相似性，因而呈鏡像對稱。26三、影響熒光產(chǎn)生及熒光強(qiáng)度的因素（一）物質(zhì)產(chǎn)生熒光的必要條件

一種物質(zhì)能否發(fā)熒光以及熒光強(qiáng)度的高低，與它的分子結(jié)構(gòu)及所處的環(huán)境密切相關(guān)。能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)都應(yīng)同時(shí)具備兩個(gè)條件：物質(zhì)分子必須有強(qiáng)的紫外吸收（有～*躍遷）；2.物質(zhì)具有較高的熒光效率（fluorescenceefficiency）。熒光效率也稱熒光量子產(chǎn)率，用f

表示。

27

可見，凡是使kF增加，使其它去活化常數(shù)降低的因素均可增加熒光量子產(chǎn)率。通常，kF由分子結(jié)構(gòu)決定（內(nèi)因），而其它參數(shù)則由化學(xué)環(huán)境和結(jié)構(gòu)共同決定。1≥≥0。吸光物質(zhì)不一定是熒光物質(zhì)，因?yàn)樵诩ぐl(fā)態(tài)分子釋放激發(fā)能過程中除熒光發(fā)射外，有無輻射躍遷過程與之競爭。因此，熒光效率與熒光發(fā)射過程的速率及無輻射過程的速率有關(guān)。

kF為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，其他為各種無輻射（去活化）過程的速率常數(shù)。

28（二）影響熒光及其強(qiáng)度的因素躍遷類型：物質(zhì)必須在紫外可見區(qū)有強(qiáng)吸收和高熒光效率才能產(chǎn)生熒光。具有—*躍遷的分子才有強(qiáng)吸收?！?躍遷的大。共軛效應(yīng)：大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，具有共軛的～*躍遷。共軛程度愈大，熒光效率也愈大，且最大激發(fā)和發(fā)射波長都向長波長方向移動(dòng)，如苯、萘、蒽三種物質(zhì)。（P54表4-1）剛性平面結(jié)構(gòu)：降低分子振動(dòng)，減少了分子與溶劑或其它分子的相互作用，當(dāng)熒光分子共軛程度相同時(shí)，分子的剛性和共平面性越大，熒光效率越大。如熒光素和酚酞。（P54圖）1.分子結(jié)構(gòu)與熒光2930

有些物質(zhì)本身不發(fā)熒光或熒光較弱，但和金屬離子形成配合物后，如果剛性和共平面性增加，就可以發(fā)熒光或增強(qiáng)熒光。如8-羥基喹啉是弱熒光物質(zhì)，與Mg2+、Al3+

等金屬離子形成的配合物的熒光增強(qiáng)，利用這一特點(diǎn)可以間接測定金屬離子。

31取代基團(tuán)對分子熒光的影響

熒光分子上的各種取代基對分子的熒光光譜和熒光強(qiáng)度都有很大影響。給電子取代基如—NH2、—OH、—OCH3、—CN、—NHR、—NR2等，能增加分子的π電子共軛程度，使熒光效率提高。而-COOH、—NO2、—C=O、—F、—Cl等吸電子取代基，可減弱分子π電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。還有一類取代基則對熒光的影響不明顯，如—R、—SO3H、—NH3等。32溫度

溫度對被測溶液的熒光強(qiáng)度有明顯的影響。當(dāng)溫度升高時(shí)，介質(zhì)粘度減小，分子運(yùn)動(dòng)加快，分子間碰撞幾率增加，從而使分子無輻射躍遷增加，熒光效率降低。故降低溫度有利于提高熒光效率及熒光強(qiáng)度。

2.影響熒光強(qiáng)度的外部因素33

由于熒光儀器光源的光強(qiáng)度大、溫度較高，容易引起溶液溫度升高，加之分析過程中室溫可能發(fā)生變化，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度改變。另外，有些熒光物質(zhì)的溶液在激發(fā)光較長時(shí)間的照射下，還會(huì)發(fā)生光分解，使熒光強(qiáng)度下降。因此，試樣不應(yīng)長時(shí)間受光照射，只在測定熒光強(qiáng)度時(shí)才打開光閘，其余時(shí)間應(yīng)關(guān)閉。在較高檔的熒光分光光度計(jì)中，樣品室四周設(shè)有冷卻水套或配有恒溫裝置，以使溶液的溫度在測定過程中保持恒定。34溶劑

同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中，其熒光光譜的位置和熒光強(qiáng)度可能會(huì)有一定的差別，尤其是那些分子中含有極性取代基的熒光物質(zhì)，它們的熒光光譜易受溶劑的影響。

溶劑的影響可以分為一般溶劑效應(yīng)和特殊溶劑效應(yīng)。

一般溶劑效應(yīng)是指溶劑極性的影響。通常情況下，隨著溶劑極性增大，～*躍遷所需的能量差E減小，躍遷幾率增加，從而使熒光波長長移，熒光強(qiáng)度增大。

35特殊溶劑效應(yīng)是指溶劑與熒光物質(zhì)形成化合物，或溶劑使熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)改變，使熒光峰的波長和熒光強(qiáng)度都發(fā)生較大變化。如在萘胺的乙醇溶液中加入鹽酸，隨著溶液中鹽酸濃度的增加，萘胺的-NH2基逐漸被-NH3+Cl-基所代替，而-NH3+Cl-基對萘環(huán)特征頻率的影響小于-NH2，因此溶液的熒光光譜趨近于萘的熒光光譜。

36pH值：溶液的酸度（pH值）對熒光物質(zhì)的影響可以分兩個(gè)方面：(1)若熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，溶液pH值改變，物質(zhì)分子和其離子間的平衡也隨之發(fā)生變化，而不同形體具有其各自特定的熒光光譜和熒光效率。例如苯胺

37(2)對于金屬離子與有機(jī)試劑生成的熒光配合物，溶液pH值的改變會(huì)影響配合物的組成，從而影響它們的熒光性質(zhì)。例如Ga3+離子與鄰-二羥基偶氮苯，在pH3～4的溶液中形成1:1配合物，能產(chǎn)生熒光。而在pH6～7的溶液中，則形成12的配合物，不產(chǎn)生熒光。

總之，溶液pH值對熒光物質(zhì)的熒光光譜、熒光效率及熒光強(qiáng)度均有影響。需通過條件實(shí)驗(yàn)找出pH與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，確定最適宜的pH范圍，以提高分析的靈敏度和準(zhǔn)確度。

38熒光猝滅/熄滅

由于熒光物質(zhì)分子間或與其它物質(zhì)相互作用，引起熒光強(qiáng)度顯著下降的現(xiàn)象叫做熒光熄滅（quenching）或猝滅。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等。

39造成熒光熄滅的原因有多種：（1）碰撞猝滅：激發(fā)態(tài)熒光分子和熄滅劑分子碰撞，將能量轉(zhuǎn)移到熄滅劑而使熒光熄滅；（2）靜態(tài)猝滅：熒光分子與熄滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的配合物；（3）轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅：熒光物質(zhì)分子中引入重原子后，易發(fā)生系間竄越而轉(zhuǎn)變?yōu)槿貞B(tài)；（4）熒光物質(zhì)的自熄滅：當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時(shí)，激發(fā)態(tài)分子和基態(tài)分子發(fā)生碰撞，產(chǎn)生熒光自熄滅現(xiàn)象。溶液濃度越高，自熄滅現(xiàn)象越嚴(yán)重；（5）內(nèi)濾作用：被測溶液中的其它物質(zhì)吸收熒光物質(zhì)的激發(fā)光或發(fā)射光；（6）溶液中溶解的氧分子能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅。

40

熒光熄滅是熒光分析的不利因素。但是如果一個(gè)熒光物質(zhì)在加入某種熄滅劑后，熒光強(qiáng)度的減小和熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系，則可以利用這一性質(zhì)建立熄滅劑的熒光分析法，稱為熒光熄滅法。熒光熄滅法比直接熒光法更靈敏、更有選擇性。例如鋁-桑色素配合物的熒光強(qiáng)度因微量氟離子的存在而引起熒光熄滅，利用這種性質(zhì)可測定樣品中微量氟離子的含量，這時(shí)溶液的熒光強(qiáng)度和氟離子濃度成反比。

41

散射光（scatteringlight）

當(dāng)一束光照射在被測溶液上，其中一部分光被吸收后發(fā)出熒光，一部分光透過溶液，還有一小部分光則由于光子與溶劑分子的相互碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同方向散射，稱為散射光。

42瑞利（Reyleigh）散射光光子和物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量的交換，只是光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變，其波長和激發(fā)光相同，這種散射光稱為瑞利散射光。它的強(qiáng)度與波長的四次方成反比，即波長越短，瑞利散射光越強(qiáng)。但因瑞利散射光波長與激發(fā)光波長相同，只要選擇適當(dāng)?shù)臒晒鉁y定波長或選用濾光片即可消除其影響。

43拉曼（Raman）散射光光子和溶劑分子發(fā)生非彈性碰撞，在運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變的同時(shí)，光子與溶劑分子還發(fā)生能量的交換，使光子能量減小或者增加，光的波長增長或變短，這兩種散射光均稱為拉曼（散射）光。其中波長較長的拉曼光因其波長與物質(zhì)的熒光波長相接近,故對測定的干擾較大。

由于拉曼光波長隨激發(fā)光波長的改變而改變,而熒光物質(zhì)的熒光波長與激發(fā)光波長無關(guān),故通過選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長，就可以將二者區(qū)分開。

44320nm320nm448nm350nm448nm350nm400nm360nm激發(fā)320nm硫酸奎寧激發(fā)350nm硫酸奎寧散射光譜散射光譜第三節(jié)熒光分析方法一、定性分析熒光物質(zhì)的特征光譜包括激發(fā)光譜和熒光光譜，因此用它鑒定物質(zhì)比吸收光譜可靠。461.熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系分光光度法是測定物質(zhì)對光的吸收程度，測量的是透射光；但是，在透射光方向觀察熒光是不適宜的，一般是在與透射光垂直的方向觀察熒光。測定熒光強(qiáng)度時(shí)，要選擇兩個(gè)不同的波長：一個(gè)是物質(zhì)吸收的光，即激發(fā)光的波長；另一個(gè)是被激發(fā)物質(zhì)發(fā)射的光，即熒光的波長。二、定量分析47

溶液的熒光強(qiáng)度與該溶液對光的吸收程度以及溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率有關(guān)。根據(jù)Beer定律所以48

由于溶液的熒光強(qiáng)度與溶液對光的吸收程度及熒光效率成正比，即4950當(dāng)abc≤0.05（即溶液很?。r(shí)，對于一定的熒光物質(zhì)，當(dāng)測定條件固定時(shí)，

即對一定的熒光物質(zhì)的稀溶液（abc≤0.05），在一定的溫度下，當(dāng)激發(fā)光的波長、強(qiáng)度和液層厚度都固定后，其熒光強(qiáng)度與該溶液的濃度成正比。這是熒光分析定量的基礎(chǔ)。512.定量分析方法熒光強(qiáng)度是相對值的測定（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法FcFxcx52（2）直接比較法如果熒光物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線過零點(diǎn)，且線性良好，可用直接比較法測定。第四節(jié)儀器儀器類型很多，基本結(jié)構(gòu)相似，一般包括五部分：激發(fā)光源單色器（2個(gè)）樣品池（通常用石英制成）檢測器記錄顯示部分一、儀器的構(gòu)造及原理54二、儀器類型

1.光電熒光計(jì)用濾光片作單色器（激發(fā)濾光片和熒光濾光片），溴鎢燈或高壓汞燈作光源，光電管為檢測器。2.熒光分光光度計(jì)用氙燈作光源、光柵作單色器，光電倍增管為檢測器?？蛇B續(xù)掃描激發(fā)光譜和熒光光譜。第五節(jié)熒光分析法的新技術(shù)一、膠束增敏熒光分析（micellarsensitizefluorometry）膠束溶液是一定濃度的表面活性劑溶液。表面活性劑是一種