葉綠體的熒光染色與觀察

山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2015年5月18日姓名班級(jí)13級(jí)生命基地班學(xué)號(hào)同組者：科目細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)題目葉綠體的分離與熒光觀察第II.實(shí)驗(yàn)分析普通光學(xué)顯微鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。另外還有一些其他組織碎片，可能是在離心時(shí)，和葉綠體差不多大小的細(xì)胞核破碎物一同被離心下來(lái)；熒光顯微鏡下未經(jīng)吖啶橙染色的葉綠體，自發(fā)出火紅色熒光，呈斑狀點(diǎn)狀分布在視野中，背景為黑色；葉綠體經(jīng)激發(fā)光波照射后，自發(fā)熒光呈現(xiàn)火紅色，懸液其他組分無(wú)自發(fā)熒光反應(yīng)，且葉綠體在其懸液中呈現(xiàn)點(diǎn)狀均勻分布，故觀察到斑狀分布的火紅色熒光效果。經(jīng)吖啶橙染色后在熒光顯微鏡下觀察，葉綠體呈橙黃色，葉綠體懸液中混有的細(xì)胞核碎片中的核酸經(jīng)丫啶橙染色熒光反應(yīng)呈現(xiàn)綠色；因載玻片材質(zhì)問(wèn)題，在熒光顯微鏡下也發(fā)出熒光，在一定程度上影響了實(shí)驗(yàn)觀察，因此在制作熒光顯微標(biāo)本時(shí)最好使用無(wú)熒光載玻片和無(wú)熒光蓋玻片，這樣背景呈黑色，葉綠體為橙黃色，細(xì)胞核碎片為綠色，效果會(huì)更加明顯?！咀⒁馐马?xiàng)】1.應(yīng)選取新鮮嫩綠的菠菜葉，去葉梗及其粗脈，用組織搗碎機(jī)進(jìn)行破碎；2.差速離心時(shí)要控制好離心的速度和時(shí)間，否則會(huì)影響葉綠體的分離，可能最終會(huì)無(wú)法觀察到葉綠體；

3.差速離心只能得到80%純度的葉綠體，要想獲得更純的葉綠體，可以用密度梯度離心法；

4.差速離心分離出的葉綠體中含有部分細(xì)胞核碎片，在熒光顯微鏡下觀察時(shí)注意區(qū)分；5．注意熒光顯微鏡的操作方法和注意事項(xiàng)，切勿損壞儀器。

6.離心結(jié)束后，用0.35%的氯化鈉溶液懸浮，要保證充分混勻，避免沉淀堆積，影響對(duì)單個(gè)葉綠體的形態(tài)觀察；7.制片時(shí)，注意所取的懸液應(yīng)適量，保證視野的葉綠體的數(shù)量適宜；8.要得到完整的、有活性的葉綠體，須在低溫下迅速提取，涂片后立即觀察；9.利用熒光顯微鏡對(duì)可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行觀察，會(huì)受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等，因此在進(jìn)行熒光觀察時(shí)應(yīng)抓緊時(shí)間，必要時(shí)應(yīng)先拍照，后觀察；1