多元校正-分光光度法測定混合色素實驗報告

多元校正－分光光度法同時測定混合色素一、【實驗?zāi)康摹坷梅止夤舛确y定胭脂紅、檸檬黃、日落黃三種有機色素混合液的吸光度。利用多元校正法（線性代數(shù)知識）處理數(shù)據(jù)，計算RSD和RSE、RSDt。了解矢量數(shù)據(jù)的獲取方法及其在多組分測定中的應(yīng)用。了解計算機技術(shù)及化學(xué)計量學(xué)基本方法在波譜解析中的應(yīng)用。 二、【實驗原理】1.實驗背景：食用合成色素是飲料等食品中的常用添加劑，但合成色素從合成工藝和結(jié)構(gòu)上可能具有一定的毒性。因此，色素的種類、含量分析對食品工業(yè)具有重要意義。而胭脂紅、檸檬黃、日落黃則是常見的食品著色劑。由于色素大多是有色有機物，對可見光有較強吸收，故采用分光光度法是測定色素。對于混合色素，需要將各組分分離后，才能進(jìn)行定量測定。而化學(xué)計量學(xué)方法（矩陣和線性關(guān)系）為混合色素不經(jīng)分離，利用分光光度法進(jìn)行準(zhǔn)確地同時測定提供了可能。2.實驗原理：=1\*GB3①比爾定律：當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時,其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度c及吸收層厚度b成正比.。公式：A=lg（1/T）=Kbc=2\*GB3②線性代數(shù)和矩陣：設(shè)有nc個組分同時存在，配制一組已知樣本共ns個溶液，其濃度矩陣為Cnc×ns，在nw個波長下測得吸光度矩陣Anw×ns。根據(jù)朗伯—比耳定律有：(1)其中Knw×nc為吸光度矩陣，根據(jù)最小二乘法原理可求出各組分的純物種譜，即K矩陣：(2)式（2）中t和-1分別表示該矩陣的轉(zhuǎn)置和逆。對于一個或一組未知樣，同樣在nw個相同波長下測定后，可用最小二乘法根據(jù)下式求出未知物的濃度。(3)此計算過程由計算軟件處理，最終可以獲得實際操作中所配制的混合色素的物質(zhì)組成、各色素的體積和偏差。三.【儀器與試劑】722分光光度儀（帶四個比色皿）、Agilent8453UV-VIS分光光度儀、50ml容量瓶6個、5ml移液管4支、移液槍4支胭脂紅溶液（120mg/L）、檸檬黃溶液（100mg/L）、日落黃溶液（100mg/L）、HCl溶液（0.1mol/L）、蒸餾水【實驗步驟】按照各色素所加體積之和在14-16ml，最大體積和最小體積在3倍以上，每種色素加入體積有起伏，設(shè)計三種色素加入體積表格：第一次實驗：第二次實驗：No.123456胭脂紅/ml0611284日落黃/ml4208610檸檬黃/ml1086420No.123456胭脂紅/ml024679日落黃/ml6100257檸檬黃/ml9410620清洗容量瓶，開啟儀器，洗潔精清洗比色皿。選取四組比色皿，以蒸餾水為參比，不斷清洗至比色皿兩兩吸光度相差正負(fù)0.02以內(nèi)，并以偏離最大者作為水/參比比色皿。取6個50ml容量瓶，按照表格設(shè)計配制溶液，然后加入5mlHCl，稀釋至刻度，搖勻。任意選擇幾組采用移液槍，實驗結(jié)果出來后比較移液管和移液槍的精準(zhǔn)度。做參比的比色皿裝HCl溶液或者蒸餾水，每次測定三組溶液，每三組一輪，從390nm測到540nm，記錄各組的吸光度。輸入數(shù)據(jù)，軟件處理數(shù)據(jù)。分析自己的溶液體積實際值和理論值的誤差，分析RSD和RSE，利用多元校正，分析實驗誤差原因。將溶液用Agilent8453UV-VIS分光光度儀測定，分析RSE和RSD?！緦嶒灁?shù)據(jù)和圖譜】理論實驗評價：RSD<0.5％優(yōu)秀；RSD<1.0％好；RSD<2.0％通過；RSD：2.0％-5.0％較差，需要重做；RSD>5.0％找出錯誤原因并重做。RSE一般2%以下為優(yōu)秀，3%為良好，3%-6%為可以接受，超過太多且不能找出明顯原因則需要重做.提高實驗RSD：提高實驗RSE：提高實驗去除一組：第一次實驗RSD：第一次實驗RSE：安捷倫儀器測定數(shù)據(jù)圖：由于第一次實驗未來得及測安捷倫儀器，bbs上得到一份數(shù)據(jù)（1153610），得到相應(yīng)的圖譜和RSD：0.00065，RSE：2.347、0.819、0.503。與手動儀器比較，RSD：0.00068，RSE：1.232、1.114、1.439。從數(shù)據(jù)可以看出安捷倫儀器測量波長間隔為1nm，比分光光度計更為精確，測量更為自動化，也更為簡便，時間更短。從圖譜也可以看出，安捷倫儀器從300nm測到600nm，比分光光度計測量波長范圍更廣，但對于390nm一下的短波長光，會有一個變化和拱起，所以在利用多元法時只需要從390nm開始測定到540nm即可。如果只取390nm到540nm范圍數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)安捷倫儀器和分光光度計測得的圖像基本吻合。但從實驗結(jié)果（即RSD和RSE）來看，兩者有明顯不同，RSD測量分別為0.00065和0.00068，由于讀數(shù)全自動，RSD相差不多，但對于RSE來說，則安捷倫儀器則更能精確的反映配制溶液的差異。也就是說操作和讀數(shù)相差不大時兩者RSD往往差異不大，但對于RSE來說，體積的變化更為敏感，少量溶液配制失誤RSE迅速增大，其檢測意義的重要性不能忽視。所以不能只看RSD小就可以了，RSE小，且RSDt也是一個重要的參數(shù)。取390nm-540nm波長范圍的圖像：【結(jié)果分析和討論】A平的計算：根據(jù)公式：把16×6個A取平均值后換算得到第一次實驗：A平=0.5387；第二次實驗：A平=0.5195，從而計算出RSDT：第一次實驗RSDT=9.924×10-4；第二次實驗RSDT=1.037×10-3最終數(shù)據(jù)：RSDA胭脂紅RSE檸檬黃RSE日落黃RSERSDT第一次實驗0.001492.025%4.569%6.751%9.924×10-4第二次實驗0.000580.678%1.988%3.862%1.037×10-3RSD、RSE結(jié)果分析：第二次實驗RSD=0.00058，相對于第一次實驗RSD=0.00149有進(jìn)步。原因主要是比色皿的清潔度，第一次洗了將近一個小時還是差異很大，第二次直接用超聲波洗過的、別人用過的比色皿，四個比色皿基相差本都在0左右。而且這一次讀數(shù)和旋旋鈕時更為注意，推拉桿的時候，待位置卡準(zhǔn)后，前后有兩次讀數(shù)，基本讀數(shù)波動誤差排除。而第二次實驗RSE分別為：胭脂紅0.678%、日落黃1.988%、檸檬黃3.862%，相對一第一次實驗：胭脂紅2.025%、日落黃6.751%、檸檬黃4.569%，有較大進(jìn)步，但還是檸檬黃配制溶液時偏大?？赡艿脑蚴堑诙螌嶒灮径际怯靡埔簶專鼮楸憬菥_，但可能移液槍老化，容易按到底，同時移液槍外壁的溶液誤差都會導(dǎo)致還是有較為明顯的誤差?！緦嶒烍w會】經(jīng)過兩次實驗的對比和查詢資料，尤其是登陸bbs查看往屆學(xué)長學(xué)姐的體會和總結(jié)，發(fā)現(xiàn)了很多值得注意和總結(jié)的地方?？偟膩碚f就是每一個細(xì)節(jié)都要注意，最終都可能極大的影響實驗結(jié)果。1.比色皿的清洗：比色皿間的差異越小對RSD的測量越準(zhǔn)確，所以為了達(dá)到±0.002的相對值，需要長時間清洗比色皿，不斷測試直到合格。往往為了達(dá)標(biāo)，除了水洗，還會用少量洗潔劑清洗（軟毛刷），甚至更換比色皿。第一次實驗清洗比色皿就花了1h左右，誤差仍然較大。第二次直接用前人用過的，由于已經(jīng)用超聲波清洗，四個比色皿差別基本沒有，RSD也大大降低。波長的調(diào)節(jié)和吸光度的測量：首先是儀器調(diào)零：先調(diào)節(jié)T=100,然后打開蓋子,調(diào)節(jié)左下第二個旋扭使T=0,最后換到A檔,消零。還有就是每次變換波長后都要把右上角調(diào)回T檔檢查是否為100.0（或者A=0）。在改變波長時需要注意不要旋轉(zhuǎn)幅度過大導(dǎo)致超過，這會帶來誤差，波長精確度高會大大降低RSD。移液管和移液槍等：RSE反映了體積的誤差，在后面會詳細(xì)分析可能的體積誤差原因。在這里主要說明一下移液槍和移液管的對比和使用。就誤差來說，用移液器的比較小，也比較便捷快速。在bbs上面看到學(xué)長等討論：“用移液器的比較小，用移液管的RES一般都在4%左右，大概是在使用移液管的時候視線沒有平視造成的誤差。”但移液管由自己控制，不準(zhǔn)確的原因和影響因素容易了解和修正，而使用移液槍則容易受到移液槍老化、腐蝕而導(dǎo)致體積出現(xiàn)誤差（就是沒有卡住的地方，很容易在吸取溶液的時候按到底），不可控因素大。還有可以只用一個移液槍來移取溶液：槍頭標(biāo)號后，每次使用都應(yīng)該把槍頭拿下來，再套上另外一個槍頭移取溶液，但需要注意不能在沒有拔下槍頭前把移液槍倒置和平放，否則會造成移液槍被腐蝕，不再精確。拉桿的使用：拉桿不能馬虎，稍不卡準(zhǔn)數(shù)字就跳動很大，所以萬不能貪快而隨意。可以再測定過程中拉回參比溶液，重新測定，同時注意拉到合適位置時候的聲音，另外拉到一個位置時候其實前后稍微可以活動，最后如果實在調(diào)動的話，就要看在哪個數(shù)字停留時間較長。體積的設(shè)計：體積設(shè)計要求：線性不相關(guān)（才能構(gòu)成線性方程求出特征值和秩）；要求同一種物質(zhì)在不同組別里體積有變化，最好有4倍以上的變化幅度；每一組溶液總體積應(yīng)控制在12-16ml。天氣和時間、熟練度：天氣干燥、溫度較高往往結(jié)果更精確，可能是儀器會受濕度、溫度影響而產(chǎn)生波動；發(fā)現(xiàn)第二次實驗比第一次實驗普遍操作時間縮短，結(jié)果更為精確，說明熟能生巧。防氣泡小竅門：在實驗過程中，不能有氣泡，會對吸光度有影響。但我總是有氣泡貼在比色皿內(nèi)壁，后來問學(xué)姐學(xué)會了一招：洗氣瓶尖嘴貼住內(nèi)壁讓水順著內(nèi)壁流不會有氣泡。八、【介紹RSE和RSD、cosa和線性代數(shù)與矩陣】RSE和RSD：RSD是ResidualStandardDeviation，不是相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，而是剩余標(biāo)準(zhǔn)殘差。RSD反映大家的實驗操作水平、準(zhǔn)確度、精確度，殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD越小，吸光度測量的誤差越小。RSE即RelativeStandardError，是相對標(biāo)準(zhǔn)誤差。RSE反映了大家配制溶液的精確度、準(zhǔn)確度和操作水平。RSD到可以看作儀器及操作等因素的精密度(波動范圍)的標(biāo)志，RSE恰恰與準(zhǔn)確度相對應(yīng)。公式：線性代數(shù)與矩陣：針對矩陣知識，三種物質(zhì)相當(dāng)于三個未知量X，通過一系列線性無關(guān)的配比，測定其吸光度Y，得到不同的線性組成（類似線性方程組），從而可以求出三種物質(zhì)濃度的特征解。Cosα和相關(guān)程度：（查找資料，僅是自己的看法，未經(jīng)證實）線性相關(guān)系數(shù)又稱皮氏積矩相關(guān)系數(shù)，是衡量兩個隨機變量之間線性相關(guān)程度的指標(biāo)。r取值范圍為[-1,1]，r>0表示正相關(guān)，r<0表示負(fù)相關(guān)，|r|表示了變量之間相關(guān)程度的高低。針對兩組數(shù)據(jù)組，可以求出X、Y的線性相關(guān)度。公式：但本實驗中要求各行不相關(guān)所利用的相關(guān)程度cosα不同于r。γ＝k1α+k2β。就稱γ為α，β的線性組合。滿足k1α1+k2α2+…+kmαm=0時，稱各向量線性相關(guān)。把6組溶液看做向量，要求平行組分線性不相關(guān)，即向量間兩兩不相關(guān)，即k1α≠k2β。從向量的角度，即兩個向量重疊度小，即cosα越接近0（向量間夾角接近90°），相關(guān)度越小。向量內(nèi)積公式（A、B為向量，[A,B]為向量內(nèi)積，||A||為向量的模（大?。篊osα可以看做向量間的夾角，也可以說向量的平行程度（應(yīng)用到實際中即變量或者數(shù)據(jù)的相關(guān)程度）K矩陣：通過K矩陣模板得到的K矩陣和圖像，計算公式：第二次實驗：K矩陣10.0620.4654.7111.6322.5662.9112.8524.1668.9214.5725.3672.8416.6027.0374.2718.6830.8471.9822.6937.6666.0828.7944.7154.5036.4951.9341.8244.1956.9229.2851.3755.8514.9056.2153.065.8257.6347.782.4755.3333.841.0849.9316.980.4341.875.490.58第一次實驗：K矩陣10.8317.9056.0612.9919.8363.7814.0221.3070.4316.1522.2774.6618.5123.4576.0621.0327.3274.1424.8933.5267.3631.2240.0654.9639.5447.4841.7947.2652.0427.5453.4350.9713.6857.9748.514.6559.2843.371.2455.4230.780.4250.1914.52-0.2741.384.50-0.47【軟件探索】通過軟件分析：除了最簡單直接的分析RSD和RSE之外，還可以通過其他方法和按鈕來告訴一些其他信息（以第一次實驗為例），但由于對操作界面不熟悉，以及一段時間的遺忘，一部分界面操作和認(rèn)識不熟悉。SDvssample和SDvswavelength能做出兩個圖像，但具體應(yīng)用不太清楚，其他偶爾也操作出不同的圖，但代表什么含義和作用不太明白。自己的一些分析：1.λi/λi+1出現(xiàn)的突峰和RAS&MAX（R）平線對應(yīng)的位置來來找出噪聲最大點（偏離特征值最大的點）是第幾組溶液。軟件可以直接告訴實驗最大的誤差時第幾組及多少波長位置；軟件可以給出三種純物質(zhì)的光譜圖，并和6組溶液對比；（可以得到檸檬黃吸收光譜最短，其次是日落黃，胭脂紅吸收光譜最長）3.給出RSE圖像時會給出一個配制溶液的設(shè)計值和計算值的差異來看出配制溶液過程中是否有誤差以及是何種誤差，同時從表格中可以找出配制溶液中的失誤和誤差，部分情況可以加以修正。常見失誤：少加某種溶液、重復(fù)加入溶液、所加溶液與組分不配套、溶液加混（加錯）、溶液順序加錯或者記錯、溶液加入儀器或者操作誤差等。以及在操作移液管和移液槍時的一些小的不規(guī)范引起的誤差：移液器的錯誤使用方法，就是把液體壓出的時候拇指有所轉(zhuǎn)動，完畢以后會發(fā)現(xiàn)移液器的刻度發(fā)生了0.05的變化，如果沒有及時發(fā)現(xiàn)的話，下一次吸液便會有誤差（但不影響第一次）。往往有同學(xué)將溶液吸上來以后，尖嘴處會有一段空隙，這樣的空隙的存在是會影響結(jié)果的（其生成的原因可能是吸取好以后，移液器的傾角過大所致，所以盡量使移液器保持豎直）。由于臺面高度過低，移液管的時候視線沒有平視造成的誤差。----來自實驗體會和bbs帖子4.從6組溶液的光譜圖中也可以大概看出，越平滑的曲線RSD越小，有尖峰的往往誤差大，同時可以大概看出在哪組、哪個波長處出現(xiàn)誤差；5.對于“R&N”鍵，和“detectoutlier”可以用于交叉驗證，即剔除一組看RSE或者光譜圖的變化，如果下降得厲害的說明該組分配制有問題，如果上升的厲害的說明該組分配制沒有問題；十、【思考題】從理論上講，任取三個波長測定后解聯(lián)立方程，也能獲得結(jié)果。問：多波長測定后并利用多元校正方法求解有什么優(yōu)點？答：根據(jù)實驗原理，對于三種不同物質(zhì)濃度作為三個變量，可以利用三組線性無關(guān)的混合組分來構(gòu)造一個線性方程組，從而求出三種物質(zhì)的濃度。但多元校正以多通道測量和多組分同時測定為主要特征，從多個已知組分的混合溶液得到校正測量數(shù)據(jù)，用這些多變量數(shù)據(jù)建立分析體系的校正模型，并對模型中所含參量進(jìn)行估計以獲取有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)成分的定量信息，進(jìn)而預(yù)報未知混合樣品中各組分的濃度，消除各組分測定時干擾因素的影響，提高分析方法的選擇性,該方法能夠方便地對多組分重疊光譜進(jìn)行解析和分辨。簡單的說就是多幾組溶液能夠通過構(gòu)建校正模型來減少各種誤差，使得結(jié)果更為精確，并能找出誤差的原因。根據(jù)各組分的吸收光譜，找出最大吸收波長及相應(yīng)的吸光系數(shù)。答：從K系列矩陣可以看出各組分（胭脂紅、日落黃、檸檬黃）的最大吸收波長依次為：510nm、480nm、430nm；

吸光系數(shù)依次為57.63、56.92、74.27

。這與前人和查閱資料得到的數(shù)據(jù)很接近。如果要用本實驗提供的方法，測定市售欲測定其中色素的含量，試分析在什么條件下能獲得較可靠的結(jié)果？答：根據(jù)本次實驗所加HCl，在PH為酸性條件，溶液各組分的含量較低，且不含影響吸光度的其它雜質(zhì)，即所含物質(zhì)簡單且較純的條件下，通過分光光度法才能獲得較可靠的結(jié)果

。查出有關(guān)合成色素測定的參考文獻(xiàn)并列于實驗報告中。答：如下。十一、【參考文獻(xiàn)】《分光光度計波長誤差及其校正》-李愛江劉湛軍韓建國《分析化學(xué)》-張云《分析化學(xué)原理》-吳性良孔繼烈《工程數(shù)學(xué)線性代數(shù)》-第五版-高等教育出版社《因子分析在分析化學(xué)實驗教學(xué)中的應(yīng)用》-[期刊論文]《大學(xué)化學(xué)》-2000年6期朱仲良梅雨張軍延李通化《多元校正模型用于拼色食品中混合色素的同時測定》-[期刊論文]《理化檢驗-化學(xué)分冊》ISTICPKU-2001年4期弓曉峰《多元校正分光光度法測定混合色素實驗的數(shù)據(jù)分析》--張清華朱仲良叢培盛沈明月鄧享棟相關(guān)度_百度百科相關(guān)系數(shù)_百度百科剩余標(biāo)準(zhǔn)差_百度百科相對標(biāo)準(zhǔn)偏差_百度百科朗伯—比爾定律_百度百科/view/65945.htm/view/405935.htm/view/299378.htm/view/862686.htm/p-74250353.html/view/bc2ca803581b6bd97f19ead4.html【實驗原始記錄】（第一次實驗數(shù)據(jù)上傳至bbs，第二次實驗學(xué)長有事未能及時上傳）第一次實驗數(shù)據(jù)記錄：No.123456胭脂紅024679日落黃6100257檸檬黃9410620波長/nm1234563900.6140.4240.5940.450.2810.2164000.6950.4790.6760.5190.3220.2464100.7640.5220.7470.5670.350.2664200.8080.5530.7960.610.3780.2914300.830.5730.8180.6350.4040.3214400.8380.6070.8090.6440.4380.3724500.