基因工程菌生長代謝的特點

第五節(jié)基因工程菌生長代謝的特點

菌體的生長通常用比生長速率來表示。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源控制補料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長。控制菌體的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。一、菌體的生長與能量的關系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細胞提供能量，當菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時，菌體會產(chǎn)生乙酸，導致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當提高pH，可減少乙酸的抑制作用分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長速率。采用磷酸乙酰化酶缺陷株作為宿組主細胞，阻止乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。二、菌體生長與前體供應的關系在基礎培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長率提高，蛋白合成增加。基因工程菌質(zhì)粒的表達需與宿主細胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，致工程菌生長速率降低。質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴緊反應”有關?！皣谰o反應”是當氨酰tRNA不足時,核糖體在密碼子上停留,并合成被稱為魔點的ppGpp的結(jié)果。ppGpp是一個重要的調(diào)控分子。它通過影響RNA鏈的延深過程減少轉(zhuǎn)錄。它的濃度增加會導致在合成mRNA和rRNA時RNA聚合酶在模板上的移動產(chǎn)生停頓，RNA鏈延長速度減慢，使游離的RNA聚合酶濃度降低，嚴緊控制的啟動子如rrnA等的轉(zhuǎn)錄減少。也可能ppGpp是通過干擾RNA聚合酶與PL啟動子專一識別反應。第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性

基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。質(zhì)粒不穩(wěn)定可分為：分裂不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變一、質(zhì)粒不穩(wěn)穩(wěn)定產(chǎn)生的原原因常見分裂不穩(wěn)穩(wěn)定的兩個因因素：⑴含質(zhì)粒菌產(chǎn)產(chǎn)生不含質(zhì)粒粒子代菌的頻頻率；⑵這兩種菌比比數(shù)率差異的的大小。對同一工程菌菌控制不同的的比生長數(shù)率率可改變質(zhì)粒粒的拷貝數(shù)：：低拷貝質(zhì)粒工工程菌產(chǎn)生不不含質(zhì)粒子代代菌頻率高如如增加工程菌菌質(zhì)粒拷貝數(shù)數(shù)可提高穩(wěn)定定性；高拷貝質(zhì)粒工工程菌產(chǎn)生不不含質(zhì)粒子代代菌頻率低但但對穩(wěn)定性不不利。質(zhì)粒穩(wěn)定性的的分析方法樣品不含抗性標記記抗生素平板培養(yǎng)養(yǎng)基10-12h100個菌落落含抗性標記抗抗生素平板培養(yǎng)養(yǎng)基10-12h統(tǒng)計生長菌落落數(shù)重復三次,計計算比值(穩(wěn)定性stability)二、提高質(zhì)粒粒穩(wěn)定性的方方法為了提高質(zhì)粒粒穩(wěn)定性，工工程菌培養(yǎng)采采用兩階段培培養(yǎng)法：⑴先使菌體生生長至一定密密度；⑵再誘導外源源基因的表達達由于第一階段段外源基因未未表達，減小小了重組菌與與質(zhì)粒丟失菌菌的生長速率率的差別，增增加了質(zhì)粒穩(wěn)穩(wěn)定性。在培養(yǎng)基中加加入抗菌素抑抑制質(zhì)粒丟失失菌的生長，，提高質(zhì)粒穩(wěn)穩(wěn)定性。調(diào)控環(huán)境參數(shù)數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)基基組分和溶解解氧濃度有些含質(zhì)粒菌菌對發(fā)酵環(huán)境境的改變比不不含質(zhì)粒菌反反應慢，間歇歇改變培養(yǎng)條條件以改變兩兩種菌比生長長速率，可改改善質(zhì)粒穩(wěn)定定性。通過間間歇供氧和改改變稀釋數(shù)率率，都可以提提高質(zhì)粒穩(wěn)定定性。大腸桿菌的蛋蛋白/菌體量量的比值是基基本恒定的，，因而菌體的的生長速度反反映了蛋白質(zhì)質(zhì)的合成速度度。培養(yǎng)養(yǎng)條條件件的的改改變變，，都都會會改改變變菌菌體體的的能能量量代代謝謝和和小小分分子子前前體體的的供供應應，，影影響響生生物物大大分分子子的的和和成成和和菌菌體體的的生生長長。。第七七節(jié)節(jié)基基因因工工程程菌菌中中試試基因因工工程程菌菌中中試試應應考考慮慮的的問問題題：：適適宜宜商商品品化化生生產(chǎn)產(chǎn)的的工工程程菌菌，，設設計計發(fā)發(fā)酵酵反反應應器器，，選選擇擇反反應應過過程程，，發(fā)發(fā)酵酵培培養(yǎng)養(yǎng)基基組組分分，，維維持持生生產(chǎn)產(chǎn)工工藝藝最最佳佳化化的的方方法法，，工工藝藝監(jiān)監(jiān)測測方方法法，，工工藝藝控控制制方方法法，，工工藝藝自自動動化化使使用用方方法法，，生生物物催催化化劑劑使使用用，，產(chǎn)產(chǎn)品品提提取取方方法法的的選選擇擇，，分分離離精精制制技技術(shù)術(shù)的的選選擇擇。。一工工程菌菌選擇擇用于中中試的的工程程菌需需具備備的條條件試試能用用一般般基因因重組組技術(shù)術(shù)獲得得，有有高產(chǎn)產(chǎn)潛力力，能能有工工業(yè)原原料薇薇培養(yǎng)養(yǎng)基，，生產(chǎn)產(chǎn)工期期能采采用一一般工工業(yè)生生產(chǎn)經(jīng)經(jīng)驗，，能產(chǎn)產(chǎn)生和和分泌泌蛋白白質(zhì)，，不致致病，，無毒毒性，，能安安全生生產(chǎn)，，符合合國家家衛(wèi)生生部門門有關關規(guī)定定，產(chǎn)產(chǎn)品有有特異異性，，發(fā)酵酵液粘粘度小小。二反反應器器設計計三發(fā)發(fā)酵培培養(yǎng)基基組成成培養(yǎng)基基組成成及作作用：：提供化化學元元素提供特特殊營營養(yǎng)源源提供能能源控制代代謝四工工藝最最佳化化與參參數(shù)監(jiān)監(jiān)測控控制1.工工藝最最佳化化是指最最快周周期，，最高高產(chǎn)量量，最最好質(zhì)質(zhì)量，，最低低消耗耗，最最大安安全性性，最最周全全的服服務處處理效效果，，最佳佳化速速度與與最低低失敗敗率等等的綜綜合指指標2.參參數(shù)監(jiān)監(jiān)測控控制需監(jiān)測測與控控制的的4種種參數(shù)數(shù)：A，主主要參參數(shù)：：pH,溫溫度，，溶氧氧。B，生生物量量：渾渾濁度度，細細胞組組分，，總氮氮量及及菌絲絲干重重。C，碳碳源：：糖，，有機機酸，，淀粉粉。D，產(chǎn)產(chǎn)品。。五計計算機機的應應用第八節(jié)節(jié)重重組工工程菌菌的培培養(yǎng)基因工工程菌菌的培培養(yǎng)過過程包包括:⑴通過搖瓶瓶操作基因因工程菌生生長的基礎礎條件,如如溫度、pH、培養(yǎng)養(yǎng)基各種組組分、碳氧氧比，分析析表達產(chǎn)物物的合成、、積累對受受體細胞的的影響;⑵通過培養(yǎng)罐罐操作確定培培養(yǎng)參數(shù)和控控制方案以及及順序。菌種一一級種子子搖瓶二二級級種子罐培養(yǎng)養(yǎng)擴大培養(yǎng)原料發(fā)發(fā)酵培養(yǎng)滅滅菌發(fā)發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)代代謝產(chǎn)物分分離基配制微生物工業(yè)發(fā)發(fā)酵過程簡圖圖一基因工程程菌的培養(yǎng)方方式1.分批培培養(yǎng)2.補料分分批培養(yǎng)3.連續(xù)培培養(yǎng)4.透析培培養(yǎng)5.固定化化培養(yǎng)2.補料分批批培養(yǎng)補料分批培養(yǎng)養(yǎng)是將種子接接入發(fā)酵反應應器中進行培培養(yǎng),經(jīng)過一一段時間后間間歇或連續(xù)地地補加新鮮培培養(yǎng)基，使菌菌體進一步生生長的方法。。二、基因工程程菌的培養(yǎng)工工藝基因工程菌的的發(fā)酵與傳統(tǒng)統(tǒng)的微生物發(fā)發(fā)酵不同,基基因工程菌帶帶外源基因,發(fā)酵的目的的是使外源基基因高效表達達。它不僅涉涉及宿主載體體和克隆基因因之間的相互互關系還和環(huán)環(huán)境有關。工藝要求：外外源基因既高高效表達，又又有利于產(chǎn)品品分離純化。。對發(fā)酵影響響較大的幾個個因素有：1.培培養(yǎng)基的的影響2.接接種量的的影響3.溫溫度的影影響4.溶溶氧量的的影響5.誘誘導時機機的影響響6.誘誘導表達達程序的的影響7.pH的影影響⒈培養(yǎng)基基的影響響培養(yǎng)基的的組成既既要提高高工程菌菌的生長長速率，，又要保保持工程程菌的穩(wěn)穩(wěn)定性，，使外源源基因高高效表達達。常用用的碳源源有：葡葡萄糖、、甘油、、乳糖、、甘露糖糖、果糖糖等。常常用的氮氮源有：：酵母提提取液、、蛋白胨胨、酪蛋蛋白水解解物、玉玉米漿、、氨水、、硫酸銨銨、氯化化銨等。。還有無無機鹽、、維生素素等。不同的碳碳源對菌菌體的生生長和外外源基因因表達有有較大的的影響。。使用葡葡萄糖和和甘油對對菌體比比生長速速率及呼呼吸強度度相差不不大。但但使用甘甘油菌體體得率較較大，而而使用葡葡萄糖菌菌體產(chǎn)生生的副產(chǎn)產(chǎn)品較多多。葡萄萄糖對lac啟啟動子有有阻遏作作用。乳乳糖對lac啟啟動子有有利。在氮源源中，，酪蛋蛋白水水解物物有利利于產(chǎn)產(chǎn)物的的合成成與分分泌。。色氨氨酸對對trp啟啟動子子控制制的基基因有有影響響。無機磷磷在許許多代代謝反反應中中是一一個效效應因因子，，磷濃濃度不不同，，影響響菌體體生長長。⒉接種種量的的影響響接種量量是指指移入入的種種子液液體積積和培培養(yǎng)液液體積積的比比例。。接種量量的大大小影影響發(fā)發(fā)酵的的產(chǎn)量量和發(fā)發(fā)酵周周期。。接種量量小，，菌體體延遲遲期較較長，，使菌菌齡老老化，，不利利于外外源基基因表表達。。接種量量大，，可縮縮短生生長延延遲期期，菌菌體迅迅速繁繁衍，，很快快進入入對數(shù)數(shù)生長長期，，適于于表達達外源源基因因。接種量量過高高，使使菌體體生長長過快快，代代謝物物積累累過多多，反反而會會抑制制后期期菌體體的生生長。⒊溫溫度的的影響響溫毒對對基因因表達達的調(diào)調(diào)控作作用發(fā)發(fā)生在在復制制轉(zhuǎn)錄錄翻譯譯和小小分子子調(diào)節(jié)節(jié)分子子的合合成等等水平平上。。溫度對對發(fā)酵酵過程程的影影響是是多方方面的的。它它影響響各種種酶的的反應應速度度，改改變菌菌體代代謝產(chǎn)產(chǎn)物的的反應應方向向，影影響代代謝調(diào)調(diào)控機機制。。適宜的的發(fā)酵酵溫度度是既既適合合菌體體的生生長，，又適適合代代謝產(chǎn)產(chǎn)物合合成的的溫度度。高高溫或或低溫溫都會會使發(fā)發(fā)酵異異常，，影響響終產(chǎn)產(chǎn)物的的形成成并導導致減減產(chǎn)。。溫度還還影響響蛋白白質(zhì)的的活性性和包包含體體的形形成。。⒋溶溶解氧氧的影影響對于好好氧發(fā)發(fā)酵,溶解解氧濃濃度是是重要要的參參數(shù)。。好氧微微生物物利用用溶解解于培培養(yǎng)液液中的的氧氣氣進行行呼吸吸。若能提提高溶溶氧速速度和和氧的的利用用率，，則能能提高高發(fā)酵酵產(chǎn)率率。發(fā)酵時時，隨隨DO2濃度的的下降降，細細胞生生長減減慢，，ST值下下降，，發(fā)酵酵后期期下降降幅度度更大大。外源基基因的的高效效表達達需要要大量量的能能量，，促進進細胞胞的呼呼吸作作用，，提高高對氧氧的需需求。。維持較較高的的DO2值，才才能提提高工工程菌菌的生生長，，利于于外源源蛋白白產(chǎn)物物的形形成。。采用調(diào)調(diào)節(jié)攪攪拌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速的的方法法,可可改變變培養(yǎng)養(yǎng)過程程中的的氧供供給，，提高高活菌菌產(chǎn)量量。⒌誘誘導時時機的的影響響對于λλP啟啟動子子型的的工程程菌，，使用用cI阻遏遏蛋白白的溫溫度敏敏感型型突變變株（（clts857）），在在28～300C下培培養(yǎng)時時，該該突變變體能能合成成有活活性的的阻遏遏蛋白白阻遏遏PL啟動動子的的轉(zhuǎn)錄錄；當溫溫度度升升高高420C時時，，該該阻阻遏遏蛋蛋白白失失活活，，使使啟啟動動子子啟啟動動轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄，，提提高高目目的的基基因因的的表表達達效效率率。。一一般般在在對對數(shù)數(shù)生生長長期期或或?qū)?shù)數(shù)生生長長后后期期升升溫溫誘誘導導表表達達。。在對數(shù)生生長期，，細胞快快速繁殖殖，直到到細胞密密度達到到109/個為止止，這時時菌體數(shù)數(shù)目倍增增，對營營養(yǎng)和氧氧需求量量急增，，營養(yǎng)和氧氧成了菌群群旺盛代代謝的限限制因素素。7pH的影響響pH對細細胞的正正常生長長和外源源蛋白的的高效表表達都有有影響，，所以應應根據(jù)工工程菌的的生長和和代謝情情況，對對pH進進行適當當?shù)恼{(diào)節(jié)節(jié)。如采取兩兩段培養(yǎng)養(yǎng)工藝，，培養(yǎng)前前期重點點是優(yōu)化化工程菌菌的生長長條件，，其最佳佳pH在在6.8～7.4左右右;培養(yǎng)養(yǎng)后期重重點是優(yōu)優(yōu)化外源源蛋白的的表達條條件,其其最佳pH為6.0～～6.5。總之,最最佳化的的工藝是是獲得:最快周期期、最高高產(chǎn)量、、最好質(zhì)質(zhì)量量、最低低消耗、、最大安安全性、、最周全全的廢物物處理效效果、最最佳速度度和最低低失敗率率等。三、基因因工程菌菌的培養(yǎng)養(yǎng)設備應用發(fā)酵酵罐大規(guī)規(guī)模培養(yǎng)養(yǎng)基因工工程菌。。它不同同于微生生物發(fā)酵酵，微生生物發(fā)酵酵目的是是為了獲獲得初級級或次級級代謝產(chǎn)產(chǎn)物，細細胞生長長并非主主要目標標，而基基因工程程發(fā)酵是是為了獲獲得最大大量的基基因表達達產(chǎn)物。。發(fā)酵罐的的組成有有：發(fā)酵罐罐體、、保證證高傳傳質(zhì)作作用的的攪拌拌器、、精細細的溫溫度控控制和和滅菌菌系統(tǒng)統(tǒng)、空空氣無無菌過過濾裝裝置、、殘留留氣體體處理理裝置置、參參數(shù)測測量與與控制制系統(tǒng)統(tǒng)、培培養(yǎng)液液配制制和連連續(xù)操操作系系統(tǒng)。。對發(fā)酵酵罐要要求：：提供菌菌體生生長最最適生生長條條件，，培養(yǎng)過過程不不得污污染，，保證純純菌培培養(yǎng)，，培養(yǎng)及及消毒毒過程程不得得游離離異物物，不不能干干擾細細菌代代謝活活動等等。第九節(jié)節(jié)高高密度度發(fā)酵酵利用大大腸桿桿菌表表達重重組基基因產(chǎn)產(chǎn)物與與傳統(tǒng)統(tǒng)發(fā)酵酵培養(yǎng)養(yǎng)不同同，重重組菌菌培養(yǎng)養(yǎng)有自自身的的特點點，即即目的的基因因克隆隆自啊啊質(zhì)粒粒上，，存在在分裂裂不穩(wěn)穩(wěn)定性性和結(jié)結(jié)構(gòu)不不穩(wěn)定定性；；隨著著培養(yǎng)養(yǎng)環(huán)境境的改改變，，質(zhì)粒?？截愗悢?shù)會會有增增有減減，基基因劑劑量也也會相相應變變化；；大多多數(shù)克克隆基基因的的表達達是已已知啟啟動子子控制制的，，因而而易通通過改改變環(huán)環(huán)境條條件來來調(diào)節(jié)節(jié)。高密度度發(fā)酵酵是一一個相相對概概念，，一般般指培培養(yǎng)基基中工工程菌菌的菌菌體濃濃度在在50gDCW/L以上上，理理論上上的最最高值值可達達200gDCW/L一影影響高高密度度發(fā)酵酵的因因素1.培培養(yǎng)基基2.溶溶氧濃濃度3.pH4.溫溫度5.代代謝副副產(chǎn)物物二實實現(xiàn)高高密度度發(fā)酵酵的方方法1.發(fā)發(fā)酵條條件的的改進進（1））培養(yǎng)養(yǎng)基的的選擇擇（2））建立立流加加式培培養(yǎng)的的方式式（3））提高高供氧氧能力力2.構(gòu)構(gòu)建出出產(chǎn)乙乙酸能能力低低的工工程化化宿主主菌（1））阻斷斷乙酸酸產(chǎn)生生的主主要途途徑（2））對碳碳代謝謝流進進行分分流（3））限制制進入入糖酵酵解途途徑的的碳代代謝流流（4））引入入血紅紅蛋白白基因因3.構(gòu)構(gòu)建蛋蛋白水水解酶酶活力力低的的工程程化宿宿主菌菌第十節(jié)節(jié)基基因因工程程藥物物的分分離純純化基因工工程藥藥物的的分離離、純純化非非常重重要。。表達達的產(chǎn)產(chǎn)物都都是多多肽或或蛋白白質(zhì)。。它它的制制得具具有以以下特特點：：①表達達產(chǎn)物物在初初始料料中含含量較較低；；②含有有大量量細胞胞及代代謝產(chǎn)產(chǎn)物；；③表達達產(chǎn)物物穩(wěn)定定性差差，易易失活活變性性；④表達產(chǎn)產(chǎn)物的種種類繁多多、結(jié)構(gòu)構(gòu)不一、、活性各各異；⑤對其質(zhì)質(zhì)量要求求純度高高、無菌菌、無熱熱原。一、建立立分離純純化工藝藝的根據(jù)據(jù)⒈含目的的產(chǎn)物的的起始料料的特點點基因工程程菌的發(fā)發(fā)酵產(chǎn)物物其上游游過程的的各種因因素對分分離、純純化工藝藝有影響響。包括括：①菌種的的類型及及其代謝謝特性。。②原材料料培養(yǎng)基基的來源源及其質(zhì)質(zhì)量。③生產(chǎn)工工藝及條條件。⒉物料中中雜質(zhì)的的種類和和性質(zhì)。。⒊目的產(chǎn)產(chǎn)物特性性。⒋產(chǎn)品質(zhì)質(zhì)量的要要求二、分分離純化化的基本本過程發(fā)酵液細胞分離離胞內(nèi)產(chǎn)物物胞胞外外產(chǎn)物細胞破碎固液分離濃濃縮初初步分離離高度度純化制制劑產(chǎn)產(chǎn)品包含體細細胞碎碎片分離變性復性三、分離純化化的技術(shù)分離純化的技技術(shù)要求：①技術(shù)條件溫溫和能保持產(chǎn)產(chǎn)物生物活性性。②選擇性好，，能從復雜的的混合物中有有效的將目的的產(chǎn)物分離，，達到較高的的純化倍數(shù)。。③收率要高。。④兩個技數(shù)間間能直接銜接接，不需要對物料料加以處理。。⑤純化過程要要快，滿足高高生產(chǎn)率的要求求。⒈細胞破碎與與固液分離⑴細胞收集：：離心法、、膜分離法。。⑵細胞破碎：：機械破碎法法、非機械破破碎法。⑶固液分離⒉目的產(chǎn)物的的分離純化目的產(chǎn)物含有有大量雜質(zhì)必必須進行分離離純化。蛋白質(zhì)分離純純化方法的設設計根據(jù)其分分子的理化性性質(zhì)和生物學學特性來決定定。產(chǎn)物特特性作作用用等電點決決定離子交交換種類及條條件相對分子量選選擇不同孔徑徑的介質(zhì)疏水性與與疏水、反反相介質(zhì)結(jié)合合的程度生物特異性決決定親和配基基溶解性決決定分離體體系及蛋白濃濃度穩(wěn)定性決決定工藝采采用溫度及流流程時間⒉目的產(chǎn)物的的分離純化目的產(chǎn)物含有有大量雜質(zhì)必必須進行分離離純化。蛋白質(zhì)分離純純化方法的設設計根據(jù)其分分子的理化性性質(zhì)和生物學學特性來決定定。產(chǎn)物特特性作作用用等電點決決定定離子交換種種類及條件相對分子量選選擇不同同孔徑的介質(zhì)質(zhì)疏水性與與疏疏水、反相介介質(zhì)結(jié)合的程程度生物特異性決決定親和和配基溶解性決決定定分離體系及及蛋白濃度穩(wěn)定性決決定定工藝采用溫溫度及流程時時間產(chǎn)物的特性在在分離純化中中的作用分離純化的方方法依賴色譜譜分離方法⑴離子交換層層析（ionexchangechromatographyIEC））離子交換層析析的基本原理理是通過帶電電的溶質(zhì)分子子與離子交換換劑中可交換換的離子進行行交換，從而而達到分離的的目的。它具有分辨辨率高容量量大操作容容易，該法法已成為多多肽蛋白質(zhì)質(zhì)核酸分離離純化的重重要方法。。⑵反相色譜譜（reversedphasechromatography，RPC）和疏水色譜（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）反相色譜和和疏水色譜譜是根據(jù)蛋蛋白質(zhì)疏水水性的差異異來分離純純化的。反相色譜是是利用溶質(zhì)質(zhì)分子中非非極性基團團與非極性性固定相之之間相互作作用力的大大小以及溶溶質(zhì)分子中中極性基團團與流動相相中極性分分子之間在在相反方向向作用力的的大小差異異進行分離離的。常用固定相相為硅膠烷烷基鍵合相相。流動相為低低離子強度度的酸性水水溶液，加加入能與水水互溶的乙乙腈、甲醇醇、異丙醇醇等有機溶溶劑。由于固定相相骨架疏水水性強，吸吸附的蛋白白質(zhì)需用有有機溶劑才才能洗脫下下來。疏水色譜的的原理與反反相色譜的的原理相似似，主要是是利用蛋白白質(zhì)分子表表面上的疏疏水區(qū)域和和介質(zhì)中的的疏水基團團之間的相相互作用，，無機鹽的的存在能使使相互作用用力增強。。固定相介質(zhì)質(zhì)表面的疏疏水性比反反相色譜介介質(zhì)表面的的疏水性弱弱。為有機機聚合物鍵鍵合相或大大孔硅膠鍵鍵合相。流動相為pH6～8鹽水溶液液。在高鹽濃度度時，蛋白白質(zhì)分子中中疏水性部部分與介子子的疏水基基團產(chǎn)生疏疏水性作用用而被吸附附；鹽濃度度降低時蛋蛋白質(zhì)疏水水性作用減減弱，目的的蛋白質(zhì)被被逐步洗脫脫下來，蛋蛋白質(zhì)疏水水性越強，，洗脫時間間越長。與反相色譜譜相比，疏疏水色譜回回收率較高高，蛋白質(zhì)質(zhì)變性可能能性小。⑶親和層析析（affinitychromatography，AC））親和層析是是利用固定定化配基與與目的蛋白白質(zhì)之間特特異的生物物親和力進進行吸附，，如抗體與與抗原、受受體與激素素、酶與底底物之間的的作用。配基：在親親和層析中中起可逆性性結(jié)合的特特異性物質(zhì)質(zhì)。載體：與配配基結(jié)合的的支撐物。。親和層析大大體可分三三步：①配基固定定化②吸附目的的物③樣品解吸吸⑷凝膠過濾濾凝膠過濾是是以具有大大小一定的的多孔性凝凝膠作為分分離介質(zhì)，，小分子能能進入孔內(nèi)內(nèi)，在柱中中緩慢移動動，而大分分子不能進進入孔內(nèi)，，快速移動動，利用這這種移動差差別可使大大分子與小小分子分開開。根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)的相對分分子量和蛋蛋白質(zhì)分子子的動力學學體積的大大小差異，，可以利用用凝膠過濾濾來分離純純化目的蛋蛋白。主要應用兩兩個方面：：①脫鹽和更更換緩沖液液②蛋白質(zhì)分分子的分級級分離。在產(chǎn)品的形形成階段前前用于除去去產(chǎn)物的多多聚體及降降解產(chǎn)物。。⒊非蛋白質(zhì)質(zhì)雜質(zhì)的去去除DNA、熱熱原質(zhì)和病病毒的純化化方法：⑴DNA的去除DNA在在pH4.0以上呈呈陰離子，，蛋白質(zhì)的的pI在6.0以上上,可用陰陰離子交換換劑吸附除除去。如蛋蛋白質(zhì)為強強酸性，可可選擇條件件使其吸附附在陽離子子交換劑上上，而DNA不吸附附。親和層層析和疏水水層析也有有效。⑵熱原質(zhì)的的去除熱熱原質(zhì)是腸腸桿菌科產(chǎn)產(chǎn)生的細菌菌內(nèi)毒素（（脂多糖））去除困難難。分子量量小的多肽肽或蛋白質(zhì)質(zhì)中的熱原原可用超濾濾或反滲透透，脂多糖糖是陰離子子可用陰離離子交換層層析除去，，脂多糖是是疏水性可可用疏水層層析法。⑶病毒的去除除層析或過過濾可將病毒毒去除。⒊非蛋白質(zhì)雜雜質(zhì)的去除DNA、熱原原質(zhì)和病毒的的純化方法：：⑴DNA的的去除DNA在pH4.0以上呈呈陰離子，蛋蛋白質(zhì)的pI在6.0以以上,可用陰陰離子交換劑劑吸附除去。。如蛋白質(zhì)為為強酸性，可可選擇條件使使其吸附在陽陽離子交換劑劑上，而DNA不吸附。。親和層析和和疏水層析也也有效。⑵熱原質(zhì)的去去除熱原質(zhì)質(zhì)是腸桿菌科科產(chǎn)生的細菌菌內(nèi)毒素（脂脂多糖）去除除困難。分子子量小的多肽肽或蛋白質(zhì)中中的熱原可用用超濾或反滲滲透，脂多糖糖是陰離子可可用陰離子交交換層析除去去，脂多糖是是疏水性可用用疏水層析法法。⑶病毒的去除除層析或過過濾可將病毒毒去除。四、選擇分離離純化方法的的依據(jù)⒈根據(jù)產(chǎn)物表表達形式來選選擇分泌型表達產(chǎn)產(chǎn)物的發(fā)酵液液體積很大但但濃度較低純純化前必須濃濃縮可用沉淀淀和超濾法。。產(chǎn)物在周質(zhì)表表達是介于細細胞內(nèi)可溶性性表達和分泌泌表達的一種種形式,它可可以避開可溶溶性表達蛋白白和培養(yǎng)基中中蛋白類雜質(zhì)質(zhì),在一定程程度上有利于于分離純化.為為了獲得周質(zhì)質(zhì)蛋白經(jīng)低濃度溶菌菌酶處理后,可采用滲透透壓休克的方方法來獲得。?？扇苄员磉_產(chǎn)產(chǎn)物破菌后的的細胞上清，，首選親和分分離方法，或或離子交換層層析。⒉根據(jù)分離單單元之間的銜銜接選擇應選擇不同機機制的分離單單元組成一套套分離工藝，，盡早采用高高效的分離手手段。先將最多的雜雜質(zhì)去除，將將費用最高、、最費時的分分離單元放在在最后階段，，即通常先運運用非特異、、低分辨的操操作單元（如如沉淀超濾和和吸附等），，以盡快縮小小樣品體積，，提高產(chǎn)物濃濃度，去除最最主要雜質(zhì)（（包括非蛋白白類雜質(zhì)）。。隨后采用高分分辨率的操作作單元（離子子交換層析和和親和層析））凝膠過濾放放在最后，這這樣可以提高高分離效果。。層析分離次序序的選擇同樣樣重要，合理理的組合能提提高分辨效率率，并有利于于各步驟間的的過渡。如離離子交換層析析、親和層析析、凝膠過濾濾。⒊根據(jù)分離純純化工藝的要要求來選擇分離純化工藝藝應遵循以下下原則：⑴具有良好的的穩(wěn)定性和重重復性⑵盡可能減少少組成工藝的的步驟⑶各技術(shù)步驟驟間要相互適適應和協(xié)調(diào)⑷工藝過程中中盡可能少用用試劑⑸工藝所用時時間要短⑹工藝和技術(shù)術(shù)必須高效收收率高易操作作能耗低⑺具有較高的的安全性第十一節(jié)變變性蛋白的的復性外源基因在大大腸桿菌中的的高表達常常常導致包涵體體的形成，雖雖然包涵體具具有富集目標標蛋白質(zhì)、抗抗蛋白酶、對對宿主毒性小小等優(yōu)點，但但包涵體蛋白白質(zhì)的復性率率一般都很低低。一.包涵體的的特性與形成成1.包涵體的的定義、組成成與特性：包涵體是指細細菌表達的蛋蛋白在細胞內(nèi)內(nèi)凝集，形成成無活性的固固體顆粒。一一般含含有50%以以上的重組蛋蛋白，其余為為核糖體元件件、RNA聚聚合酶、內(nèi)毒毒素、外膜蛋蛋白ompC、ompF和ompA等，環(huán)狀或或缺口的質(zhì)粒粒DNA，以以及脂體、脂脂多糖等，大大小為0.5-1um，，具有很高的的密度（約1.3mg/ml），無無定形，呈非非水溶性，只只溶于變性劑劑如尿素、鹽鹽酸胍等。NMR等新技技術(shù)的應用表表明包涵體具具有一定量的的二級結(jié)構(gòu)，，他們可能在在復性的啟動動階段中具有有一定的作用用。2包涵體的形形成：主要因為在重重組蛋白的表表達過程中缺缺乏某些蛋白白質(zhì)折疊的輔輔助因子，或或環(huán)境不適，，無法形成正正確的次級鍵鍵等原因形成成的。2.1、基因因工程菌的表表達產(chǎn)率過高高，超過了細細菌正常的代代謝水平，由由于細菌的δδ因子的蛋白白水解能力達達到飽和，使使之表達產(chǎn)物物積累起來。。研究發(fā)現(xiàn)在在低表達時很很少形成包涵涵體，表達量量越高越容易易形成包涵體體。原因可能能是合成速度度太快，以至至于沒有足夠夠的時間進行行折疊，二硫硫鍵不能正確確的配對，過過多的蛋白間間的非特異性性結(jié)合，蛋白白質(zhì)無法達到到足夠的溶解解度等。2.2、重組組蛋白的氨基基酸組成：一一般說含硫氨氨基酸越多越越易形成包涵涵體，而脯氨氨酸的含量明明顯與包涵體體的形成呈正正相關。2.3、重組組蛋白所處的的環(huán)境：發(fā)酵酵溫度高或胞胞內(nèi)pH接近近蛋白的等電電點時容易形形成包涵體。。2.4、重重組蛋白是是大腸桿菌菌的異源蛋蛋白，由于于缺乏真核核生物中翻翻譯后修飾飾所需酶類類和輔助因因子，如折折疊酶和分分子伴侶等等，致使中間體大量積累，容容易形成包涵涵體沉淀。2.5、蛋白白質(zhì)在合成之之后，于中性性pH或接近近中性pH的的環(huán)境下，其其本身固有的的溶解度對于于包涵體的形形成比較關鍵鍵，即是說，，有的表達產(chǎn)產(chǎn)率很高，如如Aspartase和和Cyanase,表達達產(chǎn)率達菌體體蛋白的30%,也不形形成包涵體，，而以可溶形形式出現(xiàn)。2.6、在細細菌分泌的某某個階段，蛋蛋白質(zhì)分子間間的離子鍵、、疏水鍵或共共價鍵等化學學作用導致了了包涵體的形形成。二.包涵體的的分離和溶解解1基因工程菌發(fā)發(fā)酵液，經(jīng)離離心濃縮后，，可用：機械械破碎、超聲聲破碎：單純純超聲破碎，，在小規(guī)模下下且菌量較少少的情況下效效果較好，由由于能量傳遞遞和局部產(chǎn)熱熱等原因，很很難用于大體體積細胞懸液液的破碎，這這樣部分未破破碎細胞與包包涵體混在一一起，給后期期純化帶來困困難。因此，，在較大規(guī)模模純化時先用用溶菌酶破碎碎細菌的細胞胞膜，再結(jié)合合超聲破碎方方法，可顯著著提高包涵體體的純度和回回收率。以及及化學方法破破碎使細菌裂裂解,然后以以5000-20000g15min離心，，可使大多數(shù)數(shù)包涵體沉淀淀，與可溶性性蛋白分離。。2洗滌：為了了除去包涵體體上粘附的雜雜質(zhì)，如膜蛋蛋白或核酸，，應用洗滌液液洗滌包涵體體，通常用低低濃度的變性性劑,過高濃濃度的尿素或或鹽酸胍會使使包涵體溶解解，如2M尿尿素在50mMTrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗滌滌。此外可以以用溫和去垢垢劑TritonX-100洗滌去去除膜碎片和和膜蛋白。3溶解：一般般用強的變性性劑如尿素（（6-8M））、鹽酸胍（（GdnHCl6M）），通過離子子間的相互作作用，打斷包包涵體蛋白質(zhì)質(zhì)分子內(nèi)和分分子間的各種種化學鍵，使使多肽伸展，，一般來講，，鹽酸胍優(yōu)于于尿素，因為為鹽酸胍是較較尿素強的變變性劑，它能能使尿素不能能溶解的包涵涵體溶解，而而且尿素分解解的異氰酸鹽鹽能導致多肽肽鏈的自由氨氨基甲?；?，，特別是在堿堿性pH值下下長期保溫時時?；蛴萌ス腹竸鏢DS、正十六六烷基三甲基基銨氯化物、、Sarkosyl等，，可以破壞蛋蛋白內(nèi)的疏水水鍵，也可溶溶解一些包涵涵體蛋白質(zhì)。。KandulaSuntha等人用TritonX-100來來溶解Zymononasmobilislevansucrase包涵涵體蛋白。另外，對于含含有半胱氨酸酸的蛋白質(zhì)，，分離的包涵涵體中通常含含有一些鏈間間形成的二硫硫鍵和鏈內(nèi)的的非活性二硫硫鍵。還需加加入還原劑，，如巰基乙醇醇、二硫基蘇蘇糖醇（DTT）、二硫硫赤蘚糖醇、、半胱氨酸。。還原劑的使使用濃度一般般是50-100mM2-BME或DTT，，也有文獻使使用5mM濃濃度。在較粗粗放的條件下下，可以使用用5ml/l的濃度。還還原劑的使用用濃度與蛋白白二硫鍵的數(shù)數(shù)目無關，而而有些沒有二二硫鍵的蛋白白加不加還原原劑無影響，，如牛生長激激素包涵體的的增溶。對于于目標蛋白沒沒有二硫鍵某某些包涵體的的增溶，有時時還原劑的使使用也是必要要的，可能由由于含二硫鍵鍵的雜蛋白影影響了包涵體體的溶解。三.包含體蛋蛋白復性方法法1包涵體蛋白白復性方法1.1稀釋釋復性和透析析復性：直接接加入水或緩緩沖液，放置置過夜，缺點點是體積增加加較大，變性性劑稀釋速度度太快，不易易控制。目前前稀釋法主要要有一次稀釋釋、分段稀釋釋和連續(xù)稀釋釋三種方式。。透析復性：：好處是不不增加體積積，通過逐逐漸降低外外透液濃度度來控制變變性劑去除除速度，有有人稱易形形成無活性性蛋白質(zhì)聚聚體，且不不適合大規(guī)規(guī)模操作，，無法應用用到生產(chǎn)規(guī)規(guī)模。1.2含含二硫鍵的的蛋白的復復性1.3封閉蛋蛋白的疏水蔟蔟促進復性1.4凝膠過過濾層析復性性1.5小分分子添加劑促促進的復性1.6分子伴伴侶或折疊酶酶促進的復性性1.7人工分分子伴侶的復復性2包涵體蛋白白復性效率復性是一個非非常復雜的過過程，除與蛋蛋白質(zhì)復性的的過程控制相相關外，還很很大程度上與與蛋白質(zhì)本身身的性質(zhì)有關關，有些蛋白白非常容易復復性，如牛胰胰RNA酶有有12對二硫硫鍵，在較寬寬松的條件下下復性效率可可以達到95%以上，而而有一些蛋白白至今沒有發(fā)發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ淦溥M行復性的的方法如IL-11，很很多蛋白的復復性效率只有有百分之零點點幾，如在純純化IL-2時以十二烷烷基硫酸鈉溶溶液中加入銅銅離子（0.05%SDS，7.5-30umol/lCuCl2）的方法法，25-37°C下反反應3小時，，再EDTA至1mmol/l終終止反應，復復性后的二聚聚體低于1%。一般說來來，蛋白質(zhì)的的復性效率在在20%左右右。2.1影響復復性效率的因因素：蛋蛋白質(zhì)的復性性濃度：正確確折疊的蛋白白質(zhì)的得率低低通常是由于于多肽鏈之間間的聚集作用用，蛋白質(zhì)的的濃度是使蛋蛋白質(zhì)聚集的的主要因素，，因而，一般般濃度控制在在0.1-1mg/ml；如果變性性蛋白加入復復性液中過快快，容易形成成絮狀沉淀，，可能是蛋白白重新凝聚的的緣故。所以以我們采用再再水浴和磁力力攪拌下，逐逐滴加入變性性蛋白，使變變性蛋白在復復性液中始終終處于低濃度度狀態(tài)。2.1.2pH和溫度：：復性緩沖液液的pH值必必須在7.0以上，這樣樣可以防止自自由硫醇的質(zhì)質(zhì)子化作用影影響正確配對對的二硫鍵的的形成，過高高或過低會降降低復性效率率，最適宜的的復性pH值值一般是8.0-9.0。[12]此外，影響響復性效率率的因素還還有，變性性劑的起始始濃度和去去除速度、、氧化還原原電勢、離離子強度、、共溶劑和和其他添加加劑的存在在與否等。。2.3復性性效果的檢檢測：根據(jù)具體的的蛋白性質(zhì)質(zhì)和需要，，可以從生生化、免疫疫、物理性性質(zhì)等方面面對蛋白質(zhì)質(zhì)的復性效效率進行檢檢測。2.3.1、凝膠電電泳：一般般可以用非非變性的聚聚丙烯酰胺胺凝膠電泳泳可以檢測測變性和天天然狀態(tài)的的蛋白質(zhì)，，或用非還還原的聚丙丙烯酰胺電電泳檢測有有二硫鍵的的蛋白復性性后二硫鍵鍵的配對情情況。2.3.2、光譜學學方法：可可以用紫外外差光譜、、熒光光譜譜、圓二色色性光譜（（CD）等等，利用兩兩種狀態(tài)下下的光譜學學特征進行行復性情況況的檢測，，但一般只只用于復性性研究中的的過程檢測測。2.3.3、色譜方方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由由于兩種狀狀態(tài)的蛋白白色譜行為為不同。2.3.4、生物學學活性及比比活測定：：一般用細細胞方法或或生化方法法進行測定定，較好的的反映了復復性蛋白的的活性，值值得注意的的是，不同同的測活方方法測得的的結(jié)果不同同，而且常常常不能完完全反映體體內(nèi)活性。。2.3.5、黏度和和濁度測定定：復性后后的蛋白溶溶解度增加加，變性狀狀態(tài)時由于于疏水殘基基暴露，一一般水溶性性很差，大大多形成可可見的沉淀淀析出。2.3.6、免疫學學方法：如如ELISA、WESTERN等，特特別是對結(jié)結(jié)構(gòu)決定簇簇的抗體檢檢驗，比較較真實的反反映了蛋白白質(zhì)的折疊疊狀態(tài)。第十二節(jié)基基因工工程藥物的的

質(zhì)量控控制是利用活細細胞作為表表達系統(tǒng)，，產(chǎn)物的分分子量較大大，并有復復雜的結(jié)構(gòu)構(gòu)，還參與與生理功能能的調(diào)節(jié)，，用量極微微，任何質(zhì)質(zhì)和量的偏偏差都可貽貽誤病情造造成嚴重危危害。宿主細胞中中表達的外外源基因，，在轉(zhuǎn)錄翻翻譯精制工工藝放大過過程中都可可能發(fā)生變變化，故從從原料以及及制備全過過程都必須須嚴格控制制條件和鑒鑒定質(zhì)量。。一、醫(yī)藥藥生物技術(shù)術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量量保證的一一般性要點點1.產(chǎn)品安安全性評價價2.產(chǎn)品本本身的結(jié)構(gòu)構(gòu)3.嚴格控控制條件二、生物物材料的質(zhì)質(zhì)量控制原材料的質(zhì)質(zhì)量控制是是確保編碼碼藥品的DNA序列列的正確性性，重組微微生物來自自單一克隆隆，所用質(zhì)質(zhì)粒純而穩(wěn)穩(wěn)定，以保保證產(chǎn)品質(zhì)質(zhì)量的安全全性和一致致性。根據(jù)質(zhì)量控控制要求應應了解以下下特性：⒈明確目的的基因的來來源、克隆隆經(jīng)過，并并以限制性性內(nèi)切酶酶酶切圖譜和和核苷酸序序列予以確確證；⒉應提供表表達載體的的名稱、結(jié)結(jié)構(gòu)、遺傳傳特性及各各組成部分分（如復制制子、啟動動子）的來來源與功能能，構(gòu)建中中所用位點點的酶切圖圖譜，抗生生素抗性標標記物；⒊應提供供宿主細胞胞的名稱、、來源、傳傳代歷史、、檢定結(jié)果果及其生物物學特性；；三、培養(yǎng)養(yǎng)過程的的質(zhì)量控控制在工程菌菌的貯存存中，要要求種子子克隆純純而穩(wěn)定定；在培養(yǎng)過過程中，，要求工工程菌所所含的質(zhì)質(zhì)粒穩(wěn)定定，始終終無突變變；在重復生生產(chǎn)發(fā)酵酵中，工工程菌表表達穩(wěn)定定；始終能排排除外源源微生物物污染。。生產(chǎn)基因因工程產(chǎn)產(chǎn)品應有有種子批批系統(tǒng)，，并證明明種子批批不含有有致癌因因子，無無細菌、、病毒、、真菌和和支原體體等污染染，并由由原始種種子批建建立生產(chǎn)產(chǎn)用工作作細胞庫庫。原始種子子批須確確證克隆隆基因DNA序序列，詳詳細敘述述種子批批來源、、方式、、保存及及預計使使用期，，保存與與復蘇時時宿主載載體表達達系統(tǒng)的的穩(wěn)定性性。對生產(chǎn)種種子，應應詳細敘敘述細胞胞生長與與產(chǎn)品生生成的方方法和材材料，并并控制微微生物污污染；提提供培養(yǎng)養(yǎng)生產(chǎn)濃濃度與產(chǎn)產(chǎn)量恒定定性數(shù)據(jù)據(jù)，依據(jù)據(jù)宿主細細胞-載載體系統(tǒng)統(tǒng)穩(wěn)定性性，確定定最高允允許傳種種代數(shù)；；在培養(yǎng)過過程中，，應測定定被表達達基因分分子的完完整性及及宿主細細胞長期期培養(yǎng)后后的基因因型特征征；依宿宿主細胞胞-載體體穩(wěn)定性性與產(chǎn)品品恒定性性，規(guī)定定持續(xù)培培養(yǎng)時間間，并定定期評價價細胞系系統(tǒng)和產(chǎn)產(chǎn)品。培養(yǎng)周期期結(jié)束時時，應監(jiān)監(jiān)測宿主主細胞-載體系系統(tǒng)的特特性，如如質(zhì)?？娇截悢?shù)、、宿主細細胞中表表達載體體存留程程度，含含插入基基因載體體的酶切切圖譜等等。四、純化化過程的的質(zhì)量控控制產(chǎn)品要有有足夠的的生理和和生物學學試驗數(shù)數(shù)據(jù)，確確證提純純物分子子批間保保持一致致性；外外源蛋白白質(zhì)、DNA與與熱源質(zhì)質(zhì)控制在在規(guī)定限限度以下下。在精制過過程中能能清除宿宿主細胞胞蛋白質(zhì)質(zhì)、核酸酸、糖類類、病毒毒、培養(yǎng)養(yǎng)基成分分及精制制工序本本身引入入的化學學物質(zhì)，，并有檢檢測方法法。四、目標產(chǎn)品品的質(zhì)量控制制基因工程藥物物的質(zhì)量控制制主要包括以以下幾項要求求:產(chǎn)品的鑒鑒別、純度、、活性、安全全性、穩(wěn)定性性和一致性。。它需要利用用生物化學、、免疫學、微微生物學、細細胞生物學和和分子生物學學等多學科的的理論與技術(shù)術(shù)所建立的鑒鑒定方法。五、目標產(chǎn)品品的質(zhì)量控制制基因工程藥物物質(zhì)量控制主主要包括：產(chǎn)產(chǎn)品的鑒別，，純度，活性性，安全性，，穩(wěn)定性和一一致性1.生物活性性測定需通過動物體體內(nèi)試驗和通通過細胞培養(yǎng)養(yǎng)進行體外效價價測定。2.理化性質(zhì)質(zhì)鑒定1）非特異性性鑒別2）特異性鑒鑒別3）相對分子子質(zhì)量測定凝膠過濾法、、SD-SPAGE法4）等電點測測定5）肽圖分析析肽圖分析是用用酶法或化學學法降解目的的蛋白質(zhì),對對生成的肽段段進行分離分分析。它是檢檢測蛋白質(zhì)一一級結(jié)構(gòu)最有有效的方法，，該技術(shù)靈敏敏高效是對基基因工程藥物物的分子結(jié)構(gòu)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定定性進行評價價和驗證的首首選方法。常常用HPLC、毛細管電電泳。6）氨基酸組組成分析50個氨基酸酸較理想7）部分氨基基酸序列分析析N端15個氨氨基酸可作為為重組蛋白質(zhì)質(zhì)和多肽的重重要鑒定指標標。8）蛋蛋白質(zhì)質(zhì)二硫硫鍵分分析測定方方法有有:對氯汞汞苯甲甲酸法法等5，5’-二硫硫基雙雙-2-硝硝基苯苯甲酸酸法3.重重組組蛋白白質(zhì)濃濃度測測定和和相對對分子子量的的測定定蛋白質(zhì)質(zhì)濃度度測定定方法法有:福林林-酚酚法、、雙縮縮脲法法4.純純度度分析析蛋白質(zhì)質(zhì)含量量測定定SDS、、等電電聚焦焦、各各種HPLC、、毛毛細管管電泳泳5.雜雜質(zhì)檢檢測①蛋白白類雜雜質(zhì)殘殘留宿宿主細細胞蛋蛋白采采用免免疫分分析的的方法法②非蛋蛋白類類雜質(zhì)質(zhì)②非蛋蛋白類類雜質(zhì)質(zhì)非蛋白類類雜質(zhì)主主要有:病毒、細細菌等微微生物、、熱原、、內(nèi)毒素、、致敏源源及DNA。常用檢測測方法：：雜質(zhì)和污污染物檢檢測方方法法內(nèi)毒素鱟鱟試試劑、家家兔熱原原法宿主細胞胞蛋白免免疫疫分析、、SDS、、CE其它蛋白白雜質(zhì)免免疫疫分析、、SDS、、HPLC、、CE殘余DNADNA雜雜交、紫紫外光譜譜、蛋白白結(jié)合蛋白變異異肽肽譜、、HPLC、IEF、CE甲酰蛋氨氨酸肽肽譜、HPLC、IEF、、CE蛋氨酸氧氧化肽肽譜、HPLC、質(zhì)質(zhì)譜、氨氨基酸分分析產(chǎn)物變性性或聚和和脫氨基基SDS、、IEF、HPLC、、CE、、質(zhì)譜、、凝膠過濾濾雜質(zhì)和污污染物檢檢測方方法法單克隆抗抗體SDS、免疫疫分析氨基酸取取代氨氨基基酸分析析、肽譜譜、質(zhì)譜譜、CE微生物微微生物學檢檢查支原體微微生物學檢檢查病毒微微生物學學檢查6.穩(wěn)定性性考查是藥品有效效性安全性性的重要指指標，是藥藥品貯藏條條件和使用用期限的主主要依據(jù)。。7.產(chǎn)品一一致性的保保證六、產(chǎn)品的的保存⒈液態(tài)保存存⑴低溫保存存⑵在穩(wěn)定的的下保存⑶高濃度保保存⑷加保護劑劑保存⒉固態(tài)保存存第十三節(jié)基基因工程程藥物制造造實例干擾素（interferon，IFN）是人人體細胞分分泌的一種種活性蛋白白質(zhì)，具有有廣泛的抗抗病毒抗腫腫瘤和免疫疫調(diào)節(jié)活性性，是人體體防御系統(tǒng)統(tǒng)的重要組組成部分。。根據(jù)分子子結(jié)構(gòu)和抗抗原性的差差異分為αα、β、γγ、ω等4個類型。。α型干擾擾素在分為為α1bαα2aαα2b等等亞型。一、基因工工程菌的組組建誘生的白細細胞提提取全RNA通通過過寡dT-纖維素柱柱蔗蔗糖密密度梯度獲得寡A的的mRNA離離心提取取12s的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA雙雙鏈鏈cDNA接上dT或dG尾尾pBR322質(zhì)粒pBR322質(zhì)粒加加上dA或或dC退火獲的雜交交質(zhì)粒轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌擴擴增雜交質(zhì)質(zhì)粒篩選抗青霉素素但對氨芐用用雜交翻譯法法挑選青霉素敏感細細菌克隆含含干擾擾素cDNA克隆將干擾素cDNA克隆入入表達載體在大腸桿菌中中進行高效效表達二、、基基因因工工程程干干擾擾素素的的制制備備啟開開種種子子制制備備種種子子液液發(fā)發(fā)酵酵培培養(yǎng)養(yǎng)粗粗提提精提提半半成成品品制制備備半半成成品品檢檢定定分分裝裝凍干干成成品品檢檢定定成成品品包包裝裝α2b干干擾擾素素生生產(chǎn)產(chǎn)過過程程1.發(fā)發(fā)酵酵工程程菌菌：：SW-IFNαα-2b/E.coliDH5αα，，質(zhì)質(zhì)粒粒用用啟啟動動子子，，含含氨氨芐芐青青霉霉素素抗抗性性基基因因。。培培養(yǎng)養(yǎng)基基含含1%蛋蛋白白凍凍0.5%酵酵母母提提取取物物0.5%NACl。。搖搖床床培培養(yǎng)養(yǎng)30C，，10h，，發(fā)發(fā)酵酵種種子子。。15L發(fā)發(fā)酵酵罐罐培培養(yǎng)養(yǎng)，，30C，，8h。。然然后后42C，，3h。。離離心心去去上上清清。。ooo2.產(chǎn)品品的提取取與純化化濕菌超聲聲破碎，，離心，，上清超超濾濃縮縮，SephadexG50分分離。。經(jīng)SDS檢檢查。在經(jīng)DE-52柱純化化。三、質(zhì)量量控制標標和要求求⒈半成品品檢定⑴干擾素素效價測測定⑵蛋白質(zhì)質(zhì)含量測測定⑶比活活性⑷純度度測定定⑸相對對分子子量測測定⑹殘余余外源源性DNA含量量測定定⑺殘余余血清清igG含含量測測定⑻殘余余抗生生素活活性測測定⑼紫外外光譜譜掃描描⑽肽圖圖測定定⑾等電電點測測定⑿除菌菌半成成品干干擾素素效價價測定定、無無菌試試驗、、熱原原試驗驗。⒉成品品檢定定⑴物理理性狀狀⑵鑒別別試驗驗⑶水分分測定定⑷無菌菌試驗驗⑸熱原原試驗驗⑹干