基因重組與基因工程和

第十四章

基因重組與基因工程姚真真生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室Generecombination&Geneengineering中心法則

逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄

RNA翻譯

蛋白質(zhì)復(fù)制DNA生物體環(huán)境

基因的表達(dá)調(diào)控適應(yīng)環(huán)境了解中心法則

對(duì)天然的DNA進(jìn)行改造為人類服務(wù)基因工程即DNA重組技術(shù)。在分子水平上進(jìn)行遺傳操作，按設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，從供體中提取或人工合成目的基因，使其與載體構(gòu)建成重組DNA，再轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞。目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，獲得新的遺傳性狀。

基因工程蘇云金芽胞桿菌（BT）毒素蛋白基因

熒光蛋白酶基因轉(zhuǎn)胃安素番茄高鋅西洋番茄轉(zhuǎn)蝦青素胡蘿卜痢疾疫苗土豆乳汁中分泌人凝血因子的轉(zhuǎn)基因山羊

乳汁中分泌人蛋白因子的轉(zhuǎn)基因豬主要內(nèi)容DNA重組重組DNA技術(shù)重組DNA與醫(yī)學(xué)的關(guān)系不同同DNA之之間間發(fā)發(fā)生生共共價(jià)價(jià)連連接接形形成成新新的的DNA分分子子。?；蛞蛞埔苿?dòng)動(dòng)和和重重組組是是生生物物界界普普遍遍現(xiàn)現(xiàn)象象，，是是生生物物進(jìn)進(jìn)化化的的動(dòng)動(dòng)力力，，DNA重重組組具具有有重重要要的的生生物物學(xué)學(xué)意意義義DNA重重組概念念第一節(jié)DNA重組組DNA重重組的類類型位點(diǎn)特異異性重組組（site-specificrecombination））接合(conjugation)轉(zhuǎn)化(tranformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)同源重組組（homologousrecombination）轉(zhuǎn)座重組組（transpositionrecombination）細(xì)菌的基基因轉(zhuǎn)移移與重組組一、細(xì)菌菌的基因因轉(zhuǎn)移與與重組接合(conjugation)轉(zhuǎn)化(tranformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)（一）接接合作用用(conjugation)指通過細(xì)細(xì)胞的直接接觸(如如菌毛)，遺遺傳信息息從供體體細(xì)胞單向轉(zhuǎn)移移到受體細(xì)細(xì)胞的過過程。接合轉(zhuǎn)移F因子染色體DNA性鞭毛Griffith肺肺炎球菌菌轉(zhuǎn)化實(shí)實(shí)驗(yàn)（二）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化（transformation）相關(guān)概念念：轉(zhuǎn)化：細(xì)胞從周周圍介質(zhì)質(zhì)中吸收收裸露的DNA,而獲獲得新的的遺傳表表型。感受態(tài)細(xì)細(xì)胞（competentcell）:具有攝取取周圍介介質(zhì)中游游離DNA分子能力力的細(xì)菌菌細(xì)胞。。轉(zhuǎn)化化過過程程：：DNA片斷細(xì)菌攝取DNA片斷重組細(xì)菌性狀改變（三三））轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)（（transduction））通過過病病毒毒（（噬噬菌菌體體））介介導(dǎo)導(dǎo)發(fā)發(fā)生生在在供供體體細(xì)細(xì)胞胞與與受受體體細(xì)細(xì)胞胞之之間間的的DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移和和重重組組過過程程。。溶菌感染重組感染細(xì)菌噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)溶菌菌途途徑徑溶原原途途徑徑噬菌菌體體感感染染宿宿主主后后的的兩兩種種結(jié)結(jié)局局cI基因因cro基因因溶原原狀狀態(tài)態(tài)cI基因因cro基因因溶菌菌狀狀態(tài)態(tài)噬菌菌體體感感染染宿宿主主菌菌后后的的兩兩種種狀狀態(tài)態(tài)是是由由噬噬菌菌體體的的cI和和cro兩兩個(gè)個(gè)基基因因編編碼碼調(diào)調(diào)控控蛋蛋白白控控制制的的，，溶溶原原狀狀態(tài)態(tài)，，cI表表達(dá)達(dá)；；溶溶菌菌狀狀態(tài)態(tài)，，cro表表達(dá)達(dá)。。除除了了控控制制其其他他基基因因表表達(dá)達(dá)外外，，cI和和cro兩兩個(gè)個(gè)基基因因編編碼碼調(diào)調(diào)控控蛋蛋白白是是互互為為阻阻遏遏蛋蛋白白。。結(jié)合合協(xié)協(xié)同同cI基因因cro基因因溶原原狀狀態(tài)態(tài)cI基因因cro基因因溶菌菌狀狀態(tài)態(tài)思考考：：當(dāng)含含噬噬菌菌體體的的細(xì)細(xì)菌菌用用紫紫外外線線輕輕度度照照射射后后，，cI蛋蛋白白被被降降解解,接接下下去去會(huì)會(huì)發(fā)發(fā)生生什什么么？？停停止止照照射射后后會(huì)會(huì)怎怎樣樣？？為為什什么么會(huì)會(huì)進(jìn)進(jìn)化化成成這這種種機(jī)機(jī)制制？？結(jié)合合協(xié)協(xié)同同二、、同同源源重重組組（homologousrecombination））不需要要特異異DNA序序列，，而是是依賴賴兩分分子之之間序序列的的相同同或相相似性性而進(jìn)進(jìn)行的的重組組。同源序序列愈愈長(zhǎng)，，同源源重組組率愈愈高，，反之之，則則不易易發(fā)生生重組組。概念同源重重組意意義同源重重組發(fā)發(fā)生在在任何何生物物中。。細(xì)菌如如果通通過接接合或或轉(zhuǎn)化化獲得得的外外源DNA與宿宿主DNA充分分同源源，那那末外外源DNA就可可以整整合進(jìn)進(jìn)宿主主的染染色體體。同源重重組也也是DNA損傷傷修復(fù)復(fù)的重重要機(jī)機(jī)制ElectronmicrographofaHollidayJunctionHollidayJunction(A)ThestructureofaHollidayjunctionboundbyCrerecombinase(gray),abacteriophageprotein.(B)AschematicviewofaHollidayjunction.5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′分支遷移(recA)5′3′5′3′5′3′5′3′

內(nèi)切酶(recBCD)5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′5′

內(nèi)切酶(recBCD)5′3′3′3′DNA侵?jǐn)_(recA)3′5′5′3′5′3′5′3′

DNA連接酶Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′E.coli的同源源重組組過程程：5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′3′5′5′5′5′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)5′5′5′5′3′3′3′3′5′3′5′5′5′3′3′3′DNA連接酶3′5′5′5′5′3′3′3′拼接重組體DNA連接酶5′5′5′5′3′3′3′3′片段重組體Holliday模模型同同源重重組步步驟①兩個(gè)個(gè)同源源染色色體DNA排列列整齊齊②一個(gè)個(gè)DNA的的一條條鏈斷斷裂、、并與與另一一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)應(yīng)的鏈鏈連接接，形形成Holliday中中間體體③通過過分支支移動(dòng)動(dòng)產(chǎn)生生異源源雙鏈鏈DNA④Holliday中間間體切切開并并修復(fù)復(fù)，形形成兩兩個(gè)雙雙鏈重重組體體DNA，，分別別為：：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)片段重重組體體（見模模型圖圖右邊產(chǎn)物物）：：切開的的鏈與與原來來斷裂裂的是是同一一條鏈鏈，重重組體體含有有一段段異源源雙鏈鏈區(qū)，，其兩兩側(cè)來來自同同一親親本DNA。5′5′5′5′3′3′3′3′片段重組體拼接重重組體體（見模模型圖圖左邊產(chǎn)物物）：：切開的的鏈并并非原原來斷斷裂的的鏈，，重組組體異異源雙雙鏈區(qū)區(qū)的兩兩側(cè)來來自不不同親親本DNA。3′5′5′5′5′3′3′3′拼接重組體位點(diǎn)特特異性性重組組：由整合合酶催催化，，在兩兩個(gè)DNA位點(diǎn)點(diǎn)特異異的短短序列列之間間發(fā)生生的切切割和和連接接反應(yīng)應(yīng):噬噬菌體體DNA整整合細(xì)菌特特異位位點(diǎn)重重組免疫球球蛋白白基因因的重重排三、位位點(diǎn)特特異性性重組組（一））λ噬噬菌體體DNA的的整合合λ噬菌菌體的的整合合酶識(shí)識(shí)別噬噬菌體體和宿宿主染染色體體的特特異靶靶位點(diǎn)點(diǎn)發(fā)生生選擇擇性整整合；；反轉(zhuǎn)錄錄病毒毒整合合酶可可特異異地識(shí)識(shí)別、、整合合反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病病毒cDNA的的長(zhǎng)末端重復(fù)序序列(longterminalrepeat,LTR)。attPattBE.coliDNAInt,IHFInt,IHF,XisDNA噬菌體DNA的整合和切切除att:attachmentsite,Int:integrase,IHF:integrationhostfactor,Xis:excisionasePOP′BOB′BOP′POB′attLattR整合切除hix為反向重復(fù)序序列，它們之之間的H片段段可在Hin控制下進(jìn)行行特異位點(diǎn)重重組(倒位)。H片段上有兩兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)動(dòng)hin基因表達(dá)，另另一正向時(shí)驅(qū)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白白基因。（二）細(xì)菌的的特異位點(diǎn)重重組沙門氏菌H片片段特異位點(diǎn)重組組(倒位)決定鞭鞭毛相轉(zhuǎn)變DNAH片段

h1H2與阻遏基因mRNAHin重組酶H2鞭毛素阻遏蛋白(a)

hinh2阻遏基因rh1啟動(dòng)序列hinmRNAPPhixhix

hinh2阻遏基因rh1H片段倒位

h1hinmRNAH1mRNAHin重組酶H1鞭毛素(b)

hinPP沙門氏菌H片片段特異位點(diǎn)重組組(倒位)決定鞭鞭毛相轉(zhuǎn)變（二）細(xì)菌的的特異位點(diǎn)重重組（三）、免疫疫球蛋白基因因的重排免疫球蛋白(Ig)，由由兩條輕鏈(L鏈)和兩兩條重鏈(H鏈)組成，，分別由三個(gè)個(gè)獨(dú)立的基因因族編碼，其其中兩個(gè)編碼碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼碼重鏈。輕鏈的基因片片段：重鏈的基因片片段：LVJCLV

D

JCTheorganizationofmouseimmunoglobulingenesegments.Theorganizationingermlinecellsisshownontheleft,andtherearrangedorganizationcharacteristicofmatureBlymphocytesisshowntotherightofthearrows.Therearrangedstatesshownarebutsingleexamplesofthemanypossibilitiesforeachgenefamily.Consensuselementsarelocatedaboveandbelowgermlinevariable-regiongenesthatrecombinetoformgenesencodingimmuno-globulinchains.Theseconsensuselementsarecomplementaryandarearrangedinaheptamer-nonamer,12-bpto23-bpspacerpattern.-Chain-ChainH-Chain231223122312CACAGTGACAAAAACCACAAAAAACCCACAGTG此重排排的重重組酶酶基因因rag(recombinationactivatinggene)共共有兩兩個(gè)，，分別別產(chǎn)生生蛋白白質(zhì)RAG1和和RAG2。RAG1識(shí)識(shí)別別九核核苷酸酸序列列，RAG2加加入入復(fù)合合物，，切割割七核核苷酸酸序列列位點(diǎn)點(diǎn)等CACAGTGACAAAAACCGTGTCACTGTTTTTGG7核核苷酸酸序列列12/23間間隔序序列9核苷苷酸序序列重組信信號(hào)序序列（（RSS））重排機(jī)機(jī)制：：重鏈(IgH)基因因的V-D-J重排排和輕輕鏈(IgL)基因因的V-J重排排均發(fā)發(fā)生在在特異異位點(diǎn)點(diǎn)上。。在V片段段的下下游，，J片片段的的上游游以及及D片片段的的兩側(cè)側(cè)均存存在保保守的的重組組信號(hào)號(hào)序列列(recombinationsignalsequence,RSS)。V片段J片段RSSRSS間插DNAOHHOVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯酯反應(yīng)單鏈切開轉(zhuǎn)移核苷酸酸修復(fù)、連接接免疫球蛋白白基因重排排過程-OH親核核攻擊四轉(zhuǎn)座座重組（transposition）由插入序列列和轉(zhuǎn)座子子介導(dǎo)的基基因轉(zhuǎn)移或或重排。許多數(shù)細(xì)菌菌基因組含含有幾十個(gè)個(gè)拷貝的能能轉(zhuǎn)座DNA片段，，片段長(zhǎng)度度從幾百到到幾萬(wàn)個(gè)bp,是遺遺傳多樣性性的一個(gè)重重要來源。。轉(zhuǎn)座重組分分類：插入序列(insertionsequence，IS)轉(zhuǎn)座:由轉(zhuǎn)座酶（（transposase））、一個(gè)分分離的反向向重復(fù)序（（invertedrepests）列和側(cè)側(cè)翼二個(gè)正正向重復(fù)序序列（directrepeats）組成。。發(fā)生形式：：保守性轉(zhuǎn)座座(conservativetransposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座座(duplicativetransposition)轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）轉(zhuǎn)座：：除了有插入入序列的結(jié)結(jié)構(gòu)外，，還帶有抗抗性或其他他標(biāo)記基因因。轉(zhuǎn)座序列結(jié)結(jié)構(gòu)反向重復(fù)序序列反向重復(fù)序序列轉(zhuǎn)座酶基因因IS轉(zhuǎn)座酶基因因ampR反向重復(fù)序序列Tn3轉(zhuǎn)座酶基因因tetRTn10IS細(xì)菌中的三三種轉(zhuǎn)座子子類型插入序列的的復(fù)制性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一一個(gè)染色體體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移移到另一位位點(diǎn)的分散散重復(fù)序列列。轉(zhuǎn)座子組成成：反向重復(fù)序序列轉(zhuǎn)座酶編碼碼基因抗生素抗性性等有用的的基因IRIRTransposaseGene有用基因轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座座由轉(zhuǎn)座子介介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座座Exonshufflingbytransposition.(a)TranspositionofanexonflankedbyhomologousDNAtransposonsintoanintrononasecondgene.transposasecanrecognizeandcleavetheDNAattheendsofthetransposoninvertedrepeats.Ingene1,ifthetransposasecleavesattheleftendofthetransposonontheleftandattherightendofthetransposonontheright,itcantransposealltheinterveningDNA,includingtheexonfromgene1,toanewsiteinanintronofgene2.Thenetresultisaninsertionoftheexonfromgene1intogene2.轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座座---外外顯子重組組（混編））外顯子混編編（Exonshuffling）：產(chǎn)產(chǎn)生許多新新功能的蛋蛋白質(zhì)外顯子混編編是生物進(jìn)進(jìn)化的一個(gè)個(gè)重要過程程，得益于于真核生物物DNA編編碼序列的的組織方式式：斷裂基基因含有長(zhǎng)長(zhǎng)長(zhǎng)的內(nèi)含含子，含有有許多的重重復(fù)序列，，并處于外外顯子的兩兩側(cè)。因此此，內(nèi)含子子的存在提提供了外顯顯子混編的的基礎(chǔ)。有有人提出人人基因組編編碼的約6萬(wàn)種蛋白白質(zhì)是從幾幾千個(gè)獨(dú)立立的外顯子子混編而來來。第二節(jié)節(jié)重重組組DNA技技術(shù)重組DNA技術(shù)術(shù)相關(guān)關(guān)概念念及意意義重組DNA技術(shù)術(shù)的原原理及及過程程重組DNA技術(shù)術(shù)與醫(yī)醫(yī)學(xué)關(guān)關(guān)系一、重重組DNA技術(shù)術(shù)相關(guān)關(guān)概念念及意意義（一））有關(guān)關(guān)DNA克克隆的的相關(guān)關(guān)概念念克?。ǎ╟lone））:通通過無無性繁繁殖過過程所所產(chǎn)生生的與與親代代完全全相同同的子子代群群體，，這一一群體體可以以是分分子、、細(xì)胞胞、動(dòng)動(dòng)物或或植物物等。。獲取取這一一群體體的過過程稱稱為克隆化化（cloning）DNA克隆隆(DNAcloning)：是是按按人類類的意意愿，，在體體外對(duì)對(duì)DNA分分子進(jìn)進(jìn)行重重組，，再將將重組組分子子導(dǎo)入入受體體細(xì)胞胞，使使其在在細(xì)胞胞中擴(kuò)擴(kuò)增和和繁殖殖，以以獲得得該DNA分子子的大大量拷拷貝。。又稱稱分子克克?。ǎ╩olecularcloning)，，基因因克隆?。╣enecloning））、重重組DNA(recombinantDNA)。重組DNA技術(shù)術(shù)(recombinantDNAtechnology)：是指實(shí)實(shí)現(xiàn)基基因（（或DNA）克克隆所所采用用的方方法及及技術(shù)術(shù)路線線等。。又稱稱基因因工程程（geneengineering）），遺遺傳工工程（geneticengineering））等。（二）重組DNA技術(shù)的的意義填平了物種間間不可逾越的的鴻溝；縮短進(jìn)化時(shí)間間；對(duì)生物定向改改造；基因結(jié)構(gòu)、結(jié)結(jié)構(gòu)功能及調(diào)調(diào)控研究的基基礎(chǔ)；疾病診治二、重組DNA技術(shù)的原原理及過程基本過程：分切接轉(zhuǎn)篩（一）工具酶酶工具酶：系指能用于DNA和RNA分子的切割，連接接，聚合，反反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)關(guān)的酶系統(tǒng)稱為工具酶酶。常用的工工具酶限制性內(nèi)切核核酸酶(restrictionendonucleases)DNA連接酶(DNAligase)DNA聚合酶I(DNApolymeraseI)多核苷酸激酶酶(polynucleotidekinase)反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)DNA末端轉(zhuǎn)移酶(DNAterminaltransferase)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)在DNA分子內(nèi)部的特特異性的堿基基序列內(nèi)部進(jìn)進(jìn)行切割將兩條以上的的線性DNA分子或片段催催化形成磷磷酸二酯鍵連連接成一個(gè)整整體催化DNA切切口平移反反應(yīng)，制備高高比活探針；；DNA末端標(biāo)記記，合成cDNA的第二二鏈催化將把一個(gè)個(gè)磷酸分子加加到多核苷酸酸鏈的5’－OH末端上以RNA為模板合成互互補(bǔ)的cDNA鏈線性雙鏈或或單鏈DNA分子的3’－－OH末端加上同聚物尾尾去除DNA,RNA,dNTP的5’末端的磷酸基團(tuán)工具酶酶主要要功功能能1、限限制性性核酸酸內(nèi)切切酶（（restrictionendonuclease）定義：是一一類能能識(shí)別別和切切割雙雙鏈DNA分子子中特特定堿堿基序序列的的核酸酸水解解酶。。分類I型型：復(fù)復(fù)合功功能酶酶－內(nèi)內(nèi)切(識(shí)別別位點(diǎn)點(diǎn)周圍圍400-700bp)、、甲基基化、、ATP酶酶和DNA解旋旋；III型：：內(nèi)切切(識(shí)識(shí)別位位點(diǎn)周周圍25-30bp)、、甲基基化II型型：：識(shí)別別和切切割雙雙鏈DNA的特特異順順序(識(shí)別別位點(diǎn)點(diǎn)內(nèi))命名：：根據(jù)據(jù)酶的的微生生物學(xué)學(xué)名命命名：：如：Escherichiacoli,R株中幾幾種限限制酶酶：EcoRI，EcoRII，，EcoRV第一字字母（（大寫寫，斜斜體）），示示該酶酶微生生物屬名；第二、、三字字母（（小寫寫，斜斜體）），示示該酶酶微生生物種名；第四字字母（（大寫寫，斜斜體）），示示該酶酶微生生物株或型型；如一種種菌株株中有有多種種限制制性內(nèi)內(nèi)切酶酶，用用羅馬馬數(shù)字字表示示發(fā)現(xiàn)現(xiàn)分離離的先先后順順序。。II型型限制制性內(nèi)內(nèi)切酶酶的作作用特特點(diǎn)識(shí)別序序列４４～６６個(gè)堿堿基，，4個(gè)個(gè)核苷苷酸序序列，，則每每４４（２５５６））個(gè)堿堿基出出現(xiàn)一一個(gè)靶靶序列列；6個(gè)核核苷酸酸序列列出現(xiàn)現(xiàn)的間間隔是是4kb,8個(gè)核核苷酸酸序列列則是是65kb。?；匚慕Y(jié)結(jié)構(gòu)（（palindrome）三種不同的切切口：平末(bluntend)端、５’－突出粘粘性末端(cohensiveendorstick)３３’－－突出粘性末末端限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶三種切切口產(chǎn)生5′突出出粘性末端（（stickyend):以EcoRI為為例：5′---GAATTC---3′5′---GPOHAATTC---3′3′---CTTAAG---5′EcoRI3′---CTTAAOHPG---5′′產(chǎn)生3′突出出粘性末端:以PstI為例：5′---CTGCAG---3′5′---CTGCApOHG---3′′3′---GACGTC---5′PstI3′---GOHpACGTC---5′產(chǎn)生平末端（（bluntend):以NruI為例例：5′---TCGCGA---3′5′---TCGpOHCGA---3′3′---AGCGCT---5′NruI3′---AGCOHpGCT---5′II型限制性性內(nèi)切酶的用用途：DNA克隆DNA雜交與與序列分析改建質(zhì)粒構(gòu)建基因組圖圖譜和文庫(kù)限制與修飾系系統(tǒng)（restriction–modification，R-M系統(tǒng)））：甲基化酶與相相關(guān)的II型型限制性內(nèi)切切酶組成，它它們識(shí)別相同同序列，發(fā)揮揮不同功能。。如：EcoRIrestrictionendonuclease和EcoRImethylaserestriction–modification(a)EcoRI,arestrictionenzymefromE.coli,makesstaggeredcutsatthespecific6-bpinvertedrepeatsequenceshown.Thiscleavageyieldsfragmentswithsingle-stranded,complementary““sticky”ends.Manyotherrestrictionenzymesalsoproducefragmentswithstickyends.(b)Bacterialcellswithrestrictionendonucleasesalsocontaincorrespondingmodificationenzymesthatmethylatebasesintherestriction-recognitionsite.Forexample,E.colicellscontainingtheEcoRIrestrictionenzymealsocontainEcoRImethylase,amodificationenzymethatcatalyzesadditionofamethylgrouptotwoadeninesintheEcoRIrecognitionsequence.ThemethylatedrestrictionsiteisnotcleavedbyEcoRI,assuringthatacellmakingthisrestrictionenzymedoesnotdestroyitsownDNA.2、DNA聚合酶（（DNApolymerases））能合成DNA的酶稱稱DNA聚聚合酶。常常用的酶：：大腸桿菌DNA聚合合酶Ⅰ及其其大片斷（（Klenow片段段）TaqDNA聚合合酶反（逆）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶末端脫氧核核糖核酶轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶（末末端轉(zhuǎn)移酶酶）(1)大大腸桿菌DNA聚合合酶Ⅰ5’3’外切切酶5’3’聚合合酶3’5’外外切酶枯草桿菌蛋蛋白酶Klenow片段段作用特點(diǎn)：：多功能酶：：5′→3′′DNA聚聚合酶活性性3′→5′′外切酶活活性5′→3′′外切酶活活性主要用途:催化DNA切口平平移反應(yīng)，，制備高比比活探針；；DNA測(cè)序、合合成cDNA第二鏈鏈，及DNA末端標(biāo)標(biāo)記（Klenow片段）5’5’5’5’5’5’DNA酶IDNA聚合合酶I（全全酶）利用大腸桿桿菌DNA聚合酶I進(jìn)行切口平平移法Mg2+dATPdCTPdGTPα-32PdTTPT*T*T*T*T*T*5’5’5’5’5’5’5’5’限制性內(nèi)切切酶Klenow片段段α-32PdNTP變性3’末端32P標(biāo)記的單單鏈DNA探針利用Klenow片片斷進(jìn)行3’端標(biāo)記記5’末端突突出的DNA（2）TaqDNA聚合酶酶1988年年saiki在嗜熱熱水生菌(thermusaquaticus)分離離出耐熱的依賴于DNA的DNA聚合合酶，MW=65kD，主要要應(yīng)用于聚聚合酶鏈反反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）中對(duì)DNA分子子的特定序序列進(jìn)行體體外擴(kuò)增（3）反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)亦稱依賴于于RNA的的DNA聚聚合酶（RDDP)催化以RNA為模板板的DNA聚合反應(yīng)應(yīng)，以mRNA為模模板，催化化合成出互互補(bǔ)的DNA，稱為為cDNA(com-plementaryDNA)。主主要用于cDNA文文庫(kù)的構(gòu)建建。3′→→5′′外切切酶活活性（（又稱稱RNA酶酶H活活性）），特特異性性降解解RNA-DNA雜雜交分分子中中的RNA部分分（4）末端端脫氧氧核糖糖核酸酸轉(zhuǎn)移移酶（（末末端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶酶,terminaltransferase）催化作作用：：在二價(jià)價(jià)陽(yáng)離離子存存在下下，它它催化化dNTP加到到DNA分分子的的3′′羥基基端。。用途：：用于給給載體體或cDNA加加上互互補(bǔ)的的多聚聚體尾尾巴，，造成成便于于重組組的人人工粘粘性末末端；；用于DNA片斷斷3′′-末末端標(biāo)標(biāo)記。。AAAA·······An3’mRNAAAAA·······An3’mRNATTTT5’cDNATTTT5’GGGGGGGGTTTT5’’5’’CCCCAAAAOligo(dT)引引物物反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶dNTPOligo(dC)引引物物TaqDNA聚聚合合物物（（或或Klenow片片段段））dNTP去除除mRNA鏈鏈加oligo(dG)末端端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移酶酶cDNA雙雙鏈鏈全長(zhǎng)長(zhǎng)雙雙鏈鏈cDNA的的合合成成5’’5’’3’’3’’3’’3’’3、、DNA連連接接酶酶(ligase)催化化兩兩個(gè)個(gè)獨(dú)獨(dú)立立DNA片片段段的的5′′磷磷酸酸基基與與3′′羥羥基基之之間間形形成成磷磷酸酸二二酯酯鍵鍵，，使使DNA片片段段拼拼接接起起來來T4連接酶酶：粘性末端端和平末端端；大腸桿菌連連接酶：粘性末端端4、多核苷苷酸激酶（（polynucleotidekinase）寡核苷酸探探針標(biāo)記；；用于連接接反應(yīng)，使使缺少５５’端磷酸酸的DNA片段合成成接頭磷酸酸化NNNNNHOAd-P-P-P53NNNNNP53+Ad-P-P+[-32P]ATPADP寡核苷酸片片段32P標(biāo)記的寡核苷酸片片段多核苷酸激激酶（二）基因因載體（vector）載體（vector）：攜帶目的DNA片段段進(jìn)入宿主主細(xì)胞進(jìn)行行擴(kuò)增和/或表達(dá)的的一類DNA分子。。載體特征：：自主復(fù)制即即有復(fù)制制原點(diǎn)（必必需）酶切位點(diǎn)（（必需）大小適合篩選標(biāo)記:如抗藥藥性、營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)標(biāo)記、-半乳糖苷苷酶顯色反反應(yīng)等拷貝數(shù)高載體類型：來源:質(zhì)粒；噬菌菌體；病毒毒,酵母母人工染色色體功能:克隆載型體體和表達(dá)型型載體受體細(xì)胞:原核細(xì)胞載載體、真核核細(xì)胞載體體和穿梭載載體（shuttlevector）質(zhì)粒（plasmid）：細(xì)菌染色體體外小型雙雙鏈環(huán)狀DNA。質(zhì)粒復(fù)制的的類型：嚴(yán)緊型：1-5拷貝貝，與細(xì)菌菌復(fù)制密切切相關(guān)松弛型：10-200拷貝以以上常用載體：pBR322：4.36kb；人工工構(gòu)建；Tetr和Ampr；多克隆位點(diǎn)點(diǎn)，松弛型pUC系列質(zhì)質(zhì)粒：pBR322和和M13噬菌菌體改建,2.674kb；Ampr；藍(lán)白斑篩選選（lacZ'，-肽）；高拷貝貝（500-700）1、質(zhì)粒載體體用途：保存與擴(kuò)增<2kb的的目的基因構(gòu)建cDNA文庫(kù)測(cè)序制備探針復(fù)制點(diǎn)：ori篩選標(biāo)記：ampr,tetr克隆位點(diǎn)：多個(gè)單一限限制性內(nèi)切酶酶位點(diǎn)2、噬菌體載載體（（bacterieophagevector）基因組特點(diǎn)：50kb雙鏈鏈DNA分子子，末端12bp為互補(bǔ)補(bǔ)單鏈（cos位點(diǎn)，又又稱粘端）兩個(gè)啟動(dòng)子：：PR和PL編碼基因：包包裝蛋白，裂裂解功能蛋白白等生長(zhǎng)方式：溶菌性生長(zhǎng)（（組裝噬菌體體）溶源性生長(zhǎng)（（整合入細(xì)菌菌DNA內(nèi)））λ噬菌體載體（（BacteriophageLambda）cosTACGGGGCGGCGACCTCGCGATGCCCCGCCGCTGGAGCGCCos序列及及酶切割位點(diǎn)點(diǎn)載體種類：插入載體（insertionvector）：外外源性DNA直接插入酶酶切位點(diǎn)（EcoRⅠ））容量：幾個(gè)kb代表載體：λgt10；；λgt11用途：構(gòu)建cDNA文庫(kù)庫(kù)替代載體（substitutionvector））：外源性DNA替代載載體中央部分分酶切位點(diǎn)：EcoRⅠ；；BamHⅠⅠ；SalⅠⅠ容量：9-22kb代表載體：EMBL4用途：構(gòu)建基基因組文庫(kù)coscoscoscoscoscoscIEcoRIEcoRIlacZE,B,SE,B,Sgt10gt11EMBL4噬菌體插入入載體和替代代載體示意圖圖3、柯斯質(zhì)粒粒載體（cosmid）基因組組成：：質(zhì)粒與噬菌體體的cos位位點(diǎn)聯(lián)合構(gòu)成成、4-6kb、質(zhì)粒粒復(fù)制起始位位點(diǎn)、酶切位位點(diǎn)、抗藥性性基因；容量：29-45kb代表載體：pGEM-3Zf（-））工作方式：具有噬菌體樣樣的包裝和感感染，又具有有質(zhì)粒樣的復(fù)復(fù)制用途：基因組文庫(kù)（三）目的基基因（targetgene））1、目的基因因的用途研究該基因的的全貌與內(nèi)涵涵：結(jié)構(gòu)、功功能、調(diào)控尋找異常基因因異常點(diǎn)，探探索疾病的機(jī)機(jī)理與治療研究生物種系系進(jìn)化與相關(guān)關(guān)同源性基因工程重組組表達(dá)改造某些基因因，以改良品品種基因治療2、獲得目的的基因的方法法原核目的基因因獲得：直接分離真核目的基因因獲得：基因組文庫(kù)篩篩選cDNA文庫(kù)庫(kù)篩選人工合成PCR合成DNA文庫(kù)概概念DNA文庫(kù)（（DNAlibrary）：通過重組、克克隆方法保存存在宿主細(xì)胞胞中的各種重重組DNA分分子的集合體體。分分兩類：：基因組文庫(kù)(genomiclibrary)：將某種生物細(xì)細(xì)胞的基因組組DNA切割割成一定大小小的片段后，，分別與合適適的載體重組組并導(dǎo)入宿主主細(xì)胞內(nèi)克隆隆保存。這種種保存在宿主主細(xì)胞內(nèi)的整整個(gè)基因組DNA片段集集合體稱~。。cDNA文庫(kù)庫(kù)(cDNAlibrary)：：將分離純化獲獲得某種真核核細(xì)胞中的全全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并并通過重組、、克隆方法保保存在宿主細(xì)細(xì)胞中。這種種保存在宿主主細(xì)胞內(nèi)的cDNA集合合體稱~。用聚合酶鏈反反應(yīng)（PCR）方法獲取取目的基因3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’第一次循環(huán)：：變性（95oC）退火延伸（72oC）第二次循環(huán)3’5’5’3’3’5’5’3’第三次次循環(huán)環(huán)25~30次循循環(huán)后后模板板DNA含含量可可以擴(kuò)擴(kuò)大100萬(wàn)百百倍以以上PCR原理理模板DNA引物引物用聚合合酶鏈鏈反應(yīng)應(yīng)（PCR）方方法獲獲取目目的基基因一對(duì)引引物分分別含含有BamHI和和HindIII位位點(diǎn)點(diǎn)，PCR產(chǎn)物物經(jīng)雙雙酶切切后，，可定定向插插入載載體。。（四））外源源基因因與載載體的的連接接作用酶酶：DNA連接接酶連接方式：：粘性末端連連接平末端同聚物加尾尾連接人工接頭人工接頭連連接法BamHI接頭連接酶BamHI切割連接酶+BamHI切割割的pBR322（五）重組組DNA導(dǎo)導(dǎo)入受體菌菌1、重組子子導(dǎo)入受體體菌的方式式：轉(zhuǎn)化（transformation）：特指將質(zhì)粒粒DNA或或以它為載載體構(gòu)建的的重組子導(dǎo)導(dǎo)入細(xì)菌的的過程。轉(zhuǎn)染（transfection）：：病毒及其重重組子導(dǎo)入入受體細(xì)胞胞。2、導(dǎo)入方方法氯化鈣法感受態(tài)：細(xì)菌處于容容易吸收外外源DNA的狀態(tài)稱稱感受態(tài)制備條件：：冰浴、低滲滲CaCl2（0.1mol/L））轉(zhuǎn)化反應(yīng)：：冰浴30分分短暫熱休克（42℃）轉(zhuǎn)化效率：：105-106/μgDNA;環(huán)環(huán)狀DNA高于線狀狀DNA1000倍電穿孔法：：電穿孔儀（六）重組組子的篩選選與鑒定1、陽(yáng)性菌菌落篩選：：抗藥性標(biāo)志志：ampr、tetr、neor插入抗抗性失失活互補(bǔ)篩篩選：：藍(lán)白白斑篩篩選（（α-互互補(bǔ)））、營(yíng)營(yíng)養(yǎng)缺缺陷互互補(bǔ)分子雜交：：原位雜交交、southern雜交2、插入外外源性DNA的鑒定定：酶切（目的的片段長(zhǎng)度度）PCR測(cè)序3、表達(dá)蛋蛋白的鑒定定：免疫學(xué)、生生物學(xué)活性性抗藥性篩選選多克隆位點(diǎn)點(diǎn)啟動(dòng)子裂開的N端端裂開的N端端外源DNA半半乳糖苷酶酶N端端編碼序列列pUC182686bppUC182686bp染色體重組體pUC18細(xì)菌在含X-gal和乳糖操縱縱子誘導(dǎo)劑劑的瓊脂上上培養(yǎng)細(xì)菌在含X-gal和乳糖操縱縱子誘導(dǎo)劑劑的瓊脂上上培養(yǎng)pUC18含重組體pUC18的白色菌菌落藍(lán)色菌落含載體pUC18的的藍(lán)色菌落落半乳糖糖苷酶C端編碼碼序列轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化利用互補(bǔ)原原理篩選（（蘭白斑篩篩選）重組組子pUC18amprampr藍(lán)白斑篩選選重組質(zhì)粒粒原位雜交RadioactiveprobewillhybridizewithitscomplementaryDNAWashfilter,prepareautoradiographandcomparewithmasterplatePlacenitrocellulosefilterinsealableplasticbagwithsolutionoflabeledDNAprobeSouthernblot免疫學(xué)方法法篩選重組組子DNA重重組技術(shù)實(shí)實(shí)例：基基因因文庫(kù)構(gòu)建建與篩選人基因組文文庫(kù)構(gòu)建ConstructionofagenomiclibraryofhumanDNAinabacteriophagelvector.人基因組DNA用限限制性內(nèi)切切酶（Sau3A）部分消消化產(chǎn)生約約20-kb帶粘性性末端的部部分重疊的的隨機(jī)片段段；載體消化：：噬菌體DNA用BamH1消化，，去掉中間間的可置換換片段，并并產(chǎn)生左右右兩個(gè)帶粘粘性末端的的片段基因組片段段與噬菌菌體DNA拼接成重重組DNA體外裝配有有活性的噬噬菌體，并并感染大腸腸桿菌菌種培養(yǎng)、、篩選、擴(kuò)擴(kuò)增保存InfectE.coliIndividualclonesProductionofoverlappingrestrictionfragmentsbypartialdigestionofhumangenomicDNAwithSau3A.Thisrestrictionendonucleaserecognizesthe4-bpsequenceGATCandproducesfragmentswithsingle-strandedstickyendswiththissequenceonthe5’endofeachstrand.AhypotheticalregionofhumangenomicDNAshowingtheSau3Arecognitionsites(red)isshownatthetop.PartialdigestionofthisregionofDNAwouldyieldavarietyofoverlappingfragments(blue)≈20kblong.UseofsuchoverlappingfragmentsincreasestheprobabilitythatallsequencesinthegenomicDNAwillberepresentedinallibrar