基因工程第二章DNA重組技術(shù)

*1第二章DNA重組技術(shù)*2主要內(nèi)容DNA的結(jié)構(gòu)天然DNA的制備限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA的切割.PCR擴(kuò)增特定DNA片段凝膠電泳檢測(cè)DNADNA片段的連接重組*3第一節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)一、DNA組成Nucleicacidispolynucleotide,

NucleotidesarethebuildingblocksofNucleicAcidDNA.首尾*4Pentose

five-carbonsugar

2-Deoxyribose2｀－脫氧核糖1、核苷酸Phosphate、pentose、base(堿基)Hydroxylgroup羥基Hydrogen氫*5Thymine胸腺嘧啶TCytosine胞嘧啶CGuanine鳥(niǎo)嘌呤

GAdenine腺嘌呤AFourBasesinDNAPyrimidines嘧啶Purines嘌呤*6H2O堿基五碳糖核苷鍵核苷602*7H2OH2ObasePhosphatePentose核苷鍵Phosphateesterbond核苷酸NucleotideGlycosidicbond*88種核苷酸

M-單(D-二。T－三）；P-磷酸RNA的名稱為某（單、二、三）苷酸，DNA在某（單、二、三）前加脫氧兩字。如AMP稱腺苷—磷酸(或腺苷酸），dAMP稱為脫氧腺苷—磷酸（脫氧腺苷酸）。稀有核苷酸與上類似；腺嘌呤A鳥(niǎo)嘌呤G胞嘧啶C尿嘧啶U胸腺嘧啶TRNAAMPGMPCMPUMP未發(fā)現(xiàn)DNAdAMPdGMPdCMP未發(fā)現(xiàn)dTMP*92、DNADNA中核苷酸通過(guò)3’,5’-磷酸二脂鍵連接*10headtail脫H2O脂鍵相連3`5`3`，5`-磷酸二酯鍵3’,5’-phosphodiesterbond*11二、DNAstructure*121、B型DNA雙螺旋MostDNAhavedoublehelixstructure(1).兩條鏈反向、平行、右手螺旋有大溝和小小溝5`3`5`3`*13(2).磷酸、戊糖糖在外側(cè)，，堿基在內(nèi)內(nèi)，鏈間堿堿基形成氫氫鍵。*14（3）.兩堿基對(duì)間間距0.34nm,螺距3.4nm.*15經(jīng)常用堿基基對(duì)數(shù)來(lái)表表示DNA長(zhǎng)度(4).堿基互補(bǔ)配配對(duì)原則：：A=TC=G*162、DNA序列在DNA中，兩鏈間間的堿基是是互補(bǔ)的知道其中一一條鏈的序序列后，另另一鏈也可可推測(cè)出來(lái)來(lái)。因此DNA序列一般只只用其中一一鏈序列由由5`向3`書(shū)寫(xiě)5`TCTC3`3`AGAG5`5`TCTC3`*173、DNA變性DNA變性：DNA雙鏈打開(kāi)變變異無(wú)規(guī)則則的單鏈的的過(guò)程。粘度度下下降降，，沉沉降降速速度度增增加加，，浮浮力力上上升升，，紫紫外外吸吸收收增增加加.變性性因因素素：加加熱熱,改變變?nèi)苋芤阂簆H、加加有有機(jī)機(jī)試試劑劑*18。計(jì)算算公公式式：（G+C)%=(Tm-63.0)××2.44解鏈鏈溫溫度度（（Tm）使50%DNA變性性的的溫溫度度.經(jīng)常常在在70-85C間，，隨隨G/C含量量的的升升高高而而升升高高.*194、DNA復(fù)性性變性性因因素素去去除除后后，，變變性性DNA又恢恢復(fù)復(fù)成成雙雙螺螺旋旋結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)的的過(guò)過(guò)程程。。溫度下降降過(guò)快，，DNA不能復(fù)性性。變性復(fù)性*205分子雜交交具有一定定互補(bǔ)序序列的核核苷酸單單鏈在液液相或固固相中按按堿基互互補(bǔ)配對(duì)對(duì)原則締締合成異異質(zhì)雙鏈鏈過(guò)程叫叫核酸分分子雜交交只要有一一定程度度的互補(bǔ)補(bǔ)順序就就可以形形成雜交交雙鏈。。*21DNA與DNA間的雜交交全部互補(bǔ)補(bǔ)時(shí)部分互補(bǔ)補(bǔ)時(shí)變性復(fù)性*22DNA與RNA間的雜交交全部互補(bǔ)補(bǔ)時(shí)部分互補(bǔ)補(bǔ)時(shí)變性復(fù)性*236DNA的形狀線性DNA：真核生物物的染色色體ＤＮＮＡ部分原核核生物染染色體ＤＤＮＡ部分病毒毒ＤＮＡＡ．*24環(huán)狀ＤＮＮＡ真核生物物線粒體體ＤＮＡＡ葉綠體ＤＤＮＡ部分原核核生物染染色體ＤＤＮＡ質(zhì)粒ＤＮＮＡ部分病毒毒ＤＮＡＡ．*25chloroplastmitochondriaThecircularDNAcanbesupercoiled環(huán)狀DNA以超螺旋旋形式存存在環(huán)狀DNA*26。*27負(fù)超螺旋：：形成超螺螺旋時(shí)，旋旋轉(zhuǎn)方向與與DNA雙螺旋方向向相反，旋旋轉(zhuǎn)結(jié)果使使DNA分子內(nèi)部張張力減小，，稱為松旋旋效應(yīng)。在在自然條件件下共價(jià)封封閉環(huán)狀DNA呈負(fù)超螺旋旋結(jié)構(gòu)。正超螺旋：：與負(fù)超螺螺旋相反，，形成超螺螺旋時(shí)的旋旋轉(zhuǎn)方向與與DNA雙螺旋方向向相同，結(jié)結(jié)果加大了了DNA分子內(nèi)部張張力，有緊緊旋效應(yīng)。。*287DNA的復(fù)制半保留復(fù)制制（原核、、真核）Semiconservationreplication*29親代DNA分子第一子代分分子親代DNA分子第一子代分分子*30DNA復(fù)制過(guò)程復(fù)制起始位位點(diǎn)雙鏈打打開(kāi)引物酶合成成RNA引物，DNA聚合酶延長(zhǎng)長(zhǎng)引物.前導(dǎo)鏈連續(xù)續(xù)延伸,滯后鏈通過(guò)過(guò)岡奇片段段以不連續(xù)續(xù)方式延伸伸。在新合成的的DNA鏈中將RNA引物剪去，，以DNA替代通過(guò)DNA連接酶將切切口封閉。。*31BubblesBubbles復(fù)制泡:細(xì)菌、病毒毒、線粒體體：?jiǎn)螐?fù)制制子真核：多個(gè)個(gè)復(fù)制子，，雙向等速速?gòu)?fù)制*32*338DNA的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄的過(guò)程程：起始（（啟動(dòng)子）），延長(zhǎng)，，終止轉(zhuǎn)錄后的加加工：剪切切，拼接及及修飾.*34(1)啟動(dòng)子：DNA上RNA聚合酶識(shí)別別、結(jié)合和和促使轉(zhuǎn)錄錄的一段核核苷酸序列列Inpromoterregions,thereisa––10regionwhichsequenceis““TATAAT””andiscalled““pribnowbox”or“TATAbox””.Thereisa––35regionwhichsequenceis““TTGACA””.Thesequencesofthetworegionsareveryconservative.*35promoter基因編碼區(qū)區(qū)5'|-35||10|AAUGUGA|T|3'TTGACATATAATAGGAGGStartsite+1轉(zhuǎn)錄區(qū)terminationsequence-35region-10regionSD序列initiationcodonstopcoden*36(2)轉(zhuǎn)錄區(qū)promoter基因編碼區(qū)區(qū)5'|-35||10|--AAUGUGA|T|--3'TTGACATATAATAGGAGGStartsite+1轉(zhuǎn)錄區(qū)區(qū)terminationsequence-35region-10regionSD序列initiationcodonstopcoden*37轉(zhuǎn)錄起起始位位點(diǎn)（起錄錄點(diǎn)））:轉(zhuǎn)錄在在特定定的位位點(diǎn)開(kāi)開(kāi)始,經(jīng)常發(fā)發(fā)生在在A上.SD序列在起錄錄點(diǎn)下下游有有：AGGAGG序列，，對(duì)應(yīng)應(yīng)的mRNA序列也也是AGGAGG，可與與核糖糖體中中的rRNA序列TCCTCC互補(bǔ)結(jié)結(jié)合，，起始始翻譯譯。*38基因編編碼區(qū)區(qū):從起始始密碼碼子到到終止止密碼碼子間間，含含有遺遺傳信信息的的的DNA序列。。原核生生物一一個(gè)啟啟動(dòng)子子和一一個(gè)終終止子子間有有多個(gè)個(gè)基因因編碼碼區(qū)，，每個(gè)個(gè)基因因編碼碼區(qū)均均有各各自的的起始始密碼碼子和和終止止密碼碼子。。真核核生生物物只只有有一一個(gè)個(gè)基基因因編編碼碼區(qū)區(qū)。。promoter基因因編編碼碼區(qū)區(qū)基基因因編編碼碼區(qū)區(qū)5'|-35||10|--AAUGUGAAUGUGA|T|3'TTGACATATAATAGGAGGStartsite+1Transcriptionregionterminationsequence-35region-10regionSD序列列initiationcodestopcode間隔隔區(qū)區(qū)*39終止止子子：：terminationsequenceDNA模板板上上的的終終止止信信號(hào)號(hào)是是由由于于DNA特殊殊的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)而而起起作作用用，，此處處DNA多存在著著反向重重復(fù)順序序。此區(qū)域容容易形成成發(fā)夾形形結(jié)構(gòu)，，有助于于轉(zhuǎn)錄的的終止。。*40RNApolymerase中的δ亞基識(shí)識(shí)別啟動(dòng)動(dòng)子區(qū)，，并使RNA聚合酶結(jié)結(jié)合.DNA在起始位位點(diǎn)解旋旋成單鏈鏈RNApolymerase開(kāi)始轉(zhuǎn)錄錄.δ亞基脫離離，RNA開(kāi)始延長(zhǎng)長(zhǎng).RNA延長(zhǎng)并從從DNA中脫離在終止子子處終止止.（3）轉(zhuǎn)錄錄的過(guò)程程*41終止子*42轉(zhuǎn)錄后的的RNA加工真核生物物RNA轉(zhuǎn)錄的初初級(jí)產(chǎn)物物需經(jīng)過(guò)過(guò)”加帽帽

“””加尾””“剪切切”“拼拼接”等等一系列列變化才才能生成成具有生生物活性性的RNA分子。這這一過(guò)程程稱為轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄后的的RNA加工(RNAprocessing)。*435`加帽子3`加尾巴粗品RNA剪切拼接*448翻譯以mRNA為模板，，按照mRNA分子上的的三個(gè)核核苷酸決決定一種種氨基酸酸的規(guī)則則（三聯(lián)聯(lián)體密碼碼）合成成具有特特定氨基基酸順序序的蛋白白質(zhì)稱為為翻譯。。*45一、天然DNA的來(lái)源與與用途來(lái)源：從從不同生生物的不不同部位位分離染色體DNA(ChromosomeDNA)病毒DNA(VirusDNA)質(zhì)粒DNA(PlasmidDNA)線粒體DNA(MitochondriaDNA)葉綠體DNA(ChloroplastDNA)第二節(jié)天天然DNA的提取*46染色體DNA特征:巨大,含有大量量遺傳信信息(geneticinformation).用途:分離目的的基因和和基因表表達(dá)調(diào)控控因子*47VirusDNA可在宿主細(xì)胞胞內(nèi)復(fù)制,可體外包裝.可用作轉(zhuǎn)基因因載體或分離離目的基因.頭部尾部尾絲-頭部尾部尾絲VirusDNA*48環(huán)狀，游離與與細(xì)胞質(zhì)中，，可自我復(fù)制制。1~幾百kb主要用作基因因克隆載體，，也可分離目目的基因。質(zhì)粒DNAPlasmidDNA*49真核生物(eukaryote)有,基因與呼吸作作用和光合作作用相關(guān).用途:分離目的基因因或作載體.線粒體DNA和葉綠體DNA真核生物(eukaryote)有,基因與呼吸作作用和光合作作用相關(guān).用途:分離目的基因因或作載體.線粒體DNA和葉綠體DNA*50二、天然DNA的提取*511、準(zhǔn)備生物材料料1、準(zhǔn)備生物材料料選用DNA最易提取，含含量最多的組組織。大腸桿菌培養(yǎng)養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)長(zhǎng)后期。植物選用幼嫩嫩植株，暗培培養(yǎng)1-2天或黃化苗。。*52方法:細(xì)菌(Bacteria)：用溶菌酶(lysozyme)處理,NaOH和SDS處理超聲波(ultrasonic)處理動(dòng)植物:粉碎、搗碎、、研磨2、裂解細(xì)胞-KeystepofDNAextraction*53提取總DNA(ExtractionoftotalDNA)：裂解液中加酚酚/氯仿/異戊醇等有機(jī)機(jī)溶劑，分除除蛋白質(zhì)，在在含DNA水相加入乙醇醇或異丙醇使使其沉淀，離離心獲得DNA。提取線粒體DNA或葉綠體DNA：先分離完成成細(xì)胞器，加加DNase去除其他DNA，再提。提質(zhì)粒DNA：先調(diào)pH值至12.6，再調(diào)至中性性，使質(zhì)粒復(fù)復(fù)性后從沉淀淀中釋放出來(lái)來(lái)。3、分離與抽提提提取總DNA(ExtractionoftotalDNA)：裂解液中加酚酚/氯仿/異戊醇等有機(jī)機(jī)溶劑，分除除蛋白質(zhì)，在在含DNA水相加入乙醇醇或異丙醇使使其沉淀，離離心獲得DNA。提取取線線粒粒體體DNA或葉葉綠綠體體DNA：先先分分離離完完成成細(xì)細(xì)胞胞器器，，加加DNase去除除其其他他DNA，再再提提。。提質(zhì)質(zhì)粒粒DNA：先先調(diào)調(diào)pH值至至12.6，再再調(diào)調(diào)至至中中性性，，使使質(zhì)質(zhì)粒粒復(fù)復(fù)性性后后從從沉沉淀淀中中釋釋放放出出來(lái)來(lái)。。3、分分離離與與抽抽提提*54大腸腸桿桿菌菌質(zhì)質(zhì)粒粒DNA的提提取取ExtractionofplasmidDNAfromE.coli.大腸腸桿桿菌菌質(zhì)質(zhì)粒粒DNA的提提取取ExtractionofplasmidDNAfromE.coli.1、細(xì)細(xì)菌菌的的培培養(yǎng)養(yǎng)培養(yǎng)養(yǎng)基基（（Culturemedium）:LB,含有抗生生素（bacteriophage）培養(yǎng)至對(duì)對(duì)生長(zhǎng)后后期。離離心收集集菌體。。不宜用用高速長(zhǎng)長(zhǎng)時(shí)間。。*55solutionⅠ:葡萄糖,59mmol/L;Tris-HClpH8.025mmol/L,EDTApH8.010mmol/LsolutionⅡⅡ:NaOH0.2mol/L;SDS1%solutionⅢⅢ:5mol/L醋酸鉀60mL;冰醋酸11.5mL;ddH2O28.5mL2、細(xì)胞裂裂解離心沉淀淀的菌體體加入100uL溶液I，振蕩，，冰上5min，加入200uL溶液II，混勻。。3、DNA的抽提冰上5min，加入150uL溶液III,振蕩10s，冰上5min，離心后取取上清液，，加入2倍體積的乙乙醇沉淀DNA，再離心取取沉淀.*56植物DNA的提取氯化銫法、、CTAB法。具具體步步驟可可參考考分子子生物物學(xué)實(shí)實(shí)驗(yàn)指指南類類工具具書(shū)。。*57本試劑劑盒采采用經(jīng)經(jīng)典的的SDS堿裂解解法裂裂解細(xì)細(xì)胞，，離心心吸附附柱內(nèi)內(nèi)的硅硅膠膜膜在高高鹽低低pH值狀態(tài)態(tài)下選選擇性性地結(jié)結(jié)合溶溶液中中的質(zhì)質(zhì)粒DNA，再通通過(guò)去去蛋白白液和和漂洗洗液將將雜質(zhì)質(zhì)和其其它細(xì)細(xì)菌成成分去去除，，最后后低鹽鹽，高高pH值的洗洗脫緩緩沖液液將純純凈質(zhì)質(zhì)粒DNA從硅膠膠膜上上洗脫脫?！捎眠M(jìn)進(jìn)口硅硅膠膜膜，吸吸附量量大，，產(chǎn)率率高，，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果果可重重復(fù)性性好。?！cZymo公司的的產(chǎn)品品相同同，溶溶液中中添加加了進(jìn)進(jìn)口作作用指指示劑劑，使使每一一步作作用程程度一一目了了然。?！恍枰褂糜糜卸径镜谋奖椒樱?，氯仿仿等試試劑，，也不不需要要乙醇醇沉淀淀?！焖佟?、方便便，從從1～5ml大腸桿桿菌LB（LuriaBertani）培養(yǎng)養(yǎng)液中中，可可快速速提取取15-40ug純凈的的高拷拷貝質(zhì)質(zhì)粒DNA，提取取率達(dá)達(dá)85～90%?！@得的的質(zhì)粒粒產(chǎn)量量高，，超螺螺旋比比例高高、純純度好好。直直接接可以以用于于酶切切、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化、、PCR、體外外轉(zhuǎn)錄錄、測(cè)測(cè)序等等各種種分子子生物物學(xué)實(shí)實(shí)驗(yàn)。。質(zhì)粒DNA小量提提取試試劑盒盒（離心心柱型型）*58利用納納米技技術(shù)合合成的的磁性性納米米復(fù)合合材料料（磁磁珠）），結(jié)結(jié)合磁磁性分分離技技術(shù)和和DNA提取技技術(shù)，，一步步實(shí)現(xiàn)現(xiàn)DNA的提取取和純純化，，從而而獲得得高質(zhì)質(zhì)量的的DNA。本試試劑盒盒無(wú)需需特殊殊的設(shè)設(shè)備，，而且且完全全避免免了與與一些些有毒毒試劑劑的接接觸（（如酚酚、氯氯仿等等），，純化化的DNA可以廣廣泛應(yīng)應(yīng)用于于如PCR，測(cè)序序和雜雜交等等下游游分子子生物物學(xué)實(shí)實(shí)驗(yàn)。。除了了樣本本處理理過(guò)程程，均均無(wú)需需離心心，適適合于于自動(dòng)動(dòng)化儀儀器使使用。。DNA提取取的的具具體體過(guò)過(guò)程程為為：：消消化化后后的的組組織織溶溶液液和和收收集集的的細(xì)細(xì)胞胞在在裂裂解解液液的的作作用用下下，，DNA特異異性性的的結(jié)結(jié)合合在在磁磁珠珠上上，，結(jié)結(jié)合合了了DNA的磁磁珠珠在在外外加加磁磁場(chǎng)場(chǎng)的的作作用用下下從從溶溶液液中中分分離離，，再再通通過(guò)過(guò)2-3次的的洗洗滌滌過(guò)過(guò)程程將將蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)等等殘殘留留的的雜雜質(zhì)質(zhì)去去除除，，最最后后在在洗洗脫脫液液的的作作用用下下DNA從磁磁珠珠上上被被洗洗下下來(lái)來(lái)，，從從而而獲獲得得基基因因組組DNA。磁性性組組織織基基因因組組DNA提取取試試劑劑盒盒*59基因因組組DNA提取取系系列列(血液液DNA提取取試試劑劑盒盒)產(chǎn)品品簡(jiǎn)簡(jiǎn)介介H.Q.&.Q.血液液DNA提取取試試劑劑盒盒為為您您提提供供了了一一個(gè)個(gè)快快捷捷而而簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單的的從從100ul-1ml新鮮鮮、、冷冷凍凍和和抗抗凝凝全全血血中中分分離離基基因因組組DNA的方方法法，，這這一一方方法法同同樣樣適適用用于于從從鼠鼠尾尾小小段段、、血血液液、、石石蠟蠟包包埋埋組組織織、、血血清清、、血血漿漿中中提提取取基基因因組組DNA。這這一一試試劑劑盒盒可可以以在在40min之內(nèi)內(nèi)同同時(shí)時(shí)處處理理單單個(gè)個(gè)或或多多個(gè)個(gè)的的樣樣品品。。通通常常一一次次單單獨(dú)獨(dú)的的實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)可可處處理理最最多多1ml的全血。這這一過(guò)程無(wú)無(wú)須用到苯苯酚/氯仿抽提，，而且那些些較耗時(shí)的的步驟，像像：氯化銫銫梯度離心心、異丙醇醇或乙醇沉沉淀等，都都被摒除了了。

用H.Q.&.Q.血液DNA提取方法提提純得到的的DNA可直接用于于各種下游游應(yīng)用，如如PCR、Southern雜交及限制制性酶切等等。應(yīng)用JYZ-1-1/JYZ-1-2系列均提供供OB蛋白酶，該該試劑盒能能從全血、、純的白細(xì)細(xì)胞或培養(yǎng)養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)細(xì)胞中分離離出DNA。若從干燥燥的血樣中中分離DNA可使用H.Q.&.Q.組織DNA提取試劑盒盒。結(jié)合能力每個(gè)Mu-Pu基因組DNA分離柱可結(jié)結(jié)合大約30μgDNA。我們建議議不要一次次使用大于于1ml全血或250μl培養(yǎng)的動(dòng)物物細(xì)胞。*60三、DNA的純化1、離子交換換層析法:在低鹽濃度度下DNA可與樹(shù)脂或或羥基磷灰灰石的鈣離離子相互作作用而結(jié)合合，隨后用用濃度梯度度的NaCl或磷酸鹽洗洗脫回收DNA即可純化之之。*61resinDNAForDNAbinding,theDNAsolutionisappliedtoIonExchangeratfixedpHandlow[salt]--++++Cl-Cl-Na+Na+--ForelutionofDNAfromIonExchanger,ahigh[salt]isappliedtocolumn*622、DNA中EB的去除EB（ethidiumbromide）：溴化化乙錠，，EB可影響DNA的切割,對(duì)人有中中等毒性性，可誘誘變成癌癌癥.正丁醇抽抽提法：DNA樣品溶液液中加入入用溶解解DNA的緩沖溶溶液飽和和的正丁丁醇，輕輕輕混合合，分相相后，棄棄上相正正丁醇，，反復(fù)重重復(fù)至上上相正丁丁醇無(wú)桔桔紅色為為止。*633、DNA的濃縮：：乙醇沉淀淀法：DNA中加2倍體積的的乙醇，，使DNA沉淀，離離心收即即可。*64第三節(jié)節(jié)限制酶酶及其其對(duì)DNA的切割割一、限限制酶酶（Restrictionendonucleases）已開(kāi)發(fā)發(fā)上百百種，，公司司有賣(mài)賣(mài).功能:能識(shí)別別特定定的核核酸序序列而而將核核酸切切斷。。*651、定義一類能識(shí)別雙雙鏈DNA中特殊核苷酸酸序列，并使使每條鏈的一一個(gè)磷酸二酯酯鍵斷開(kāi)的內(nèi)內(nèi)脫氧核糖核核酸酶。主要存在于細(xì)細(xì)菌中。用于于防止外源DNA入侵*662、分類I型、II型、III型?；蚬こ讨袘?yīng)應(yīng)用的是II型，可識(shí)別特特殊序列進(jìn)行行有規(guī)律切割割。*673、命名一般以提取這這類酶的生物物屬名和種名名的第1、2個(gè)字母及菌株株的代號(hào)來(lái)命命名。如：HaemophilusinfluenzaeRd菌中提取的第第三個(gè)酶可命命名為HindIII*68二、作用機(jī)理理底物：DNA可識(shí)別一定的的核苷酸序列列使兩條鏈上特特定位置的磷磷酸二酯鍵斷斷開(kāi)，產(chǎn)生具具有3`-OH基團(tuán)和5`-P基因的片段。。*69REbasebaseHHHHHHHH*705’……ATCGCGATGAATTCGCGAT……3’3’……TAGCGCTACTTAAGCGCTA……5EcoRⅠ5’……ATCGCGATGAATTCGCGAT……3’

3’……TAGCGCTACTTAAGCGCTA……5`OHOHPP3`5`3`5`*71三.識(shí)別序列recognitionsequences共同特點(diǎn)：具有旋轉(zhuǎn)對(duì)稱稱性，或二重重互補(bǔ)對(duì)稱性性GAATTCCTTAAGGGATCCCCTAGGAAGCTTTTCGAA*72如：序列有6個(gè)核苷酸對(duì)，出現(xiàn)概率為1/4，即1/4096。6對(duì)于一條長(zhǎng)DNA鏈中的酶識(shí)別別序列可利用用電腦分析。。識(shí)別序列長(zhǎng)為n個(gè)bp，它出現(xiàn)的概率：為1/4。n*73四、酶切切割方式有兩兩種其一，兩條鏈鏈上斷開(kāi)的位位置是交錯(cuò)的的對(duì)稱地分布布在識(shí)別序列列中心位置兩兩側(cè)，產(chǎn)生粘粘性末端。其二，兩條鏈鏈斷開(kāi)的位置置在識(shí)別序列列的對(duì)稱中心心產(chǎn)生平末端端。*745’……ATCGCGATGAATTCGCGAT……3’

3’……TAGCGCTACTTAAGCGCTA……5OHOHPP粘性末端同尾酶：來(lái)源源各異，識(shí)別別序列相似，，切割后產(chǎn)生生的粘性末端端完全相同。。5’……ATCGCGATGAATTCGCGAT……3’

3’……TAGCGCTACTTAAGCGCTA……5OHOHPP平末端*75五、酶酶切反反應(yīng)系系統(tǒng)1、底物物DNADNA的純度：乙醇醇、EDTA、SDS、酚等等DNA的分子構(gòu)構(gòu)型：線形形>環(huán)狀識(shí)別序序列的的側(cè)面序序列：如僅僅含GAATTC的不會(huì)會(huì)被EcoRI切，該該序列列兩側(cè)側(cè)延長(zhǎng)長(zhǎng)1到幾個(gè)個(gè)核苷苷酸后后才行行。DNA甲基化化：識(shí)別別序列列被甲甲基化化，會(huì)會(huì)影響響酶切切效率率。*762、酶的的用量量酶的活活性越越高用用量越越少底物DNA適合，，用量量少。。3、反應(yīng)應(yīng)的緩緩沖溶溶液（（buffer）buffer最適合合酶的的活性性最強(qiáng)強(qiáng)。4、反應(yīng)應(yīng)溫度度37℃℃*77六、REStar活性某些酶酶在特特定條條件下下，可可在不不是原原來(lái)的的識(shí)別別序列列處切切割DNA，這種種現(xiàn)象象稱為為Star活性。排除方方法：：降低反反應(yīng)系系統(tǒng)中中甘油油含量量、控控制在在pH中性和和高鹽鹽濃度度下進(jìn)進(jìn)行反反應(yīng)。。*78DNA的片段段化：：DNA酶切成成可用用于連連接重重組的的DNA片段的的過(guò)程程。1、單酶酶切最常用用，只只用一一種酶酶進(jìn)行行切割割。13uLddH2O2uLbuffer搖勻，，離心心，室室溫1-3h，65℃104uLDNA分鐘1uL酶七、DNA的片段化*792、雙酶切兩種酶切割割同一種DNA分子。產(chǎn)生生兩個(gè)不同同的末端。。先后分別切切割：原則則是先低后后高。同時(shí)切割：：反應(yīng)條件件相近，有有共同的buffer。BamHIDNAEcoRI810bpEcoRIBamHI*803、部分酶切切對(duì)DNA分子的全部部識(shí)別序列列進(jìn)行不完完全的切割割。原因:DNA純度低、甲甲基化、酶酶量不足、、溫度不適適、時(shí)間不不夠等。BamHIBamHIDNAEcoRI750bp810bp*81八、DNA的限制性圖譜譜DNA分子上每種種限制性內(nèi)內(nèi)切酶的識(shí)識(shí)別序列分分布圖，稱稱限制性圖圖譜（restrictionmap）或稱物理理圖譜(physicalmap)。*82第四節(jié)特特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增*83一、概述述在短時(shí)間內(nèi)內(nèi)擴(kuò)增特定定DNA片段該片段可能能是大量DNA混合物中的的一段:e.g.aspecificexonofahumangene.模擬細(xì)胞內(nèi)內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程，，在數(shù)小時(shí)時(shí)內(nèi)可獲得得大量拷貝貝的DNA片段，步驟驟簡(jiǎn)便，結(jié)結(jié)果可靠。。*84PCR功能強(qiáng)大PCR可在2小時(shí)內(nèi)獲得得足夠多的的DNA片段。模板不需很很純、如煮煮沸的細(xì)菌菌。PCR獲得的DNA可切割、連連接、測(cè)序序。PCR可擴(kuò)增單DNA模板,e.g.fromasinglecell。*85PCR的發(fā)明PCR（PolymeraseChainReaction）技術(shù)是1983年由美國(guó)CETUS公司的KarryMullis博士發(fā)明的的，它是分分子生物學(xué)學(xué)在技術(shù)上上的一次革革命.*8660-70年代有科學(xué)學(xué)家Khorana提出“經(jīng)過(guò)DNA變性，與合合適引物雜雜交，用DNA聚合酶延伸伸引物，并并不斷重復(fù)復(fù)該過(guò)程便便可克隆tRNA基因”。核酸體外擴(kuò)擴(kuò)增最早設(shè)設(shè)想遺忘:很難人工合合成寡核苷苷酸引物；；當(dāng)時(shí)很難進(jìn)進(jìn)行測(cè)序.DidHeReallyInventPCR?*87發(fā)明過(guò)程Mullis在《偶然想出的的聚合酶鏈鏈反應(yīng)》一文中寫(xiě)到到:這種簡(jiǎn)單得得令人驚奇奇，可以無(wú)無(wú)限量地拷拷貝DNA片段的方法法是在不可可想象的情情況下，即即駕車(chē)行駛駛在月色下下的加利福福尼亞山間間公路上時(shí)時(shí)想出來(lái)的的。發(fā)展過(guò)過(guò)程：：開(kāi)始使使用大大腸桿桿菌DNA聚合酶酶Klenow片段，，該酶酶不耐耐熱，，每次次加熱熱變性性DNA后都要要重新新補(bǔ)加加。耗耗時(shí)、、費(fèi)力力、易易出錯(cuò)錯(cuò)。耐耐熱DNA聚合酶酶的應(yīng)應(yīng)用使使得自自動(dòng)化化.*88二、PCR的原理理類似于于DNA的體內(nèi)內(nèi)復(fù)制制。首先待待擴(kuò)增增DNA模板加加熱變變性解解鏈，，隨之將將反應(yīng)應(yīng)混合合物冷冷卻至至某一一溫度度，這這一溫溫度可可使引引物與與它的的靶序序列發(fā)發(fā)生退退火，，再將溫溫度升升高使使退火火引物物在DNA聚合酶酶作用用下得得以延延伸。。這種熱熱變性性-退火-延伸的的過(guò)程程就是是一個(gè)個(gè)PCR循環(huán)，，PCR就是在在合適適條件件下的的這種種循環(huán)環(huán)的不不斷重重復(fù)。。*89DNA加熱變變性成成單鏈鏈引物退退火與與DNA結(jié)合DNA聚合酶酶延伸伸引物物上三步步重復(fù)復(fù)30次基本方方案*90PCR反應(yīng)體體系的的成分分：模板DNA緩沖溶溶液（（Tris,銨離子子（和和/或鉀離離子）），鎂鎂離子子，牛牛血清清白蛋蛋白））核苷酸酸dNTPs(dATP,dTTP,dGTP,dCTP的混合合物)引物DNA聚合酶酶（常常用Taq酶）*91PCR反應(yīng)系系統(tǒng)成成份引物AB核苷酸酸TaqDNA聚合酶酶Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+緩沖溶溶液目標(biāo)DNA5’3’3’5’*92變性目標(biāo)DNA95oC5’3’3’5’5’3’3’5’*93退火~55oC5’’5’’AB引物物AB5’’3’’3’’5’’*94延伸伸72oC5’’5’’TaqDNA聚合合酶酶3’’5’’5’’3’’*95Thebasicprotocol--extension72oC5’’5’’5’’3’’3’’5’’3’’3’’第一一個(gè)個(gè)循循環(huán)環(huán)結(jié)結(jié)束束第二二個(gè)個(gè)循循環(huán)環(huán)開(kāi)開(kāi)始始*965’’5’’5’’3’’3’’5’’3’’3’’95oC5’’5’’3’’3’’5’’3’’變性性5’’3’’*975’’5’’5’’3’’3’’5’’3’’3’’5’’5’’5’’5’’55oC退火火*985’’5’’5’’3’’3’’5’’3’3’5’5’5’5’72oCextension*995’5’5’3’3’5’3’3’5’5’5’5’72oC延伸第二個(gè)循環(huán)環(huán)結(jié)束*1005’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’95oC變性第三個(gè)循環(huán)環(huán)開(kāi)始*1015’5’3’5’5’3’3’5’5’5’5’55oC退火*1025’5’3’5’5’3’3’5’5’5’5’72oC延伸3’*1035’5’3’5’5’3’3’5’5’5’5’5’3’372oC延伸目標(biāo)DNA目標(biāo)DNA第三個(gè)循環(huán)環(huán)結(jié)束*1045’3’5’94oC變性第四個(gè)循環(huán)環(huán)3’40oC退火72oC延伸*105每循環(huán)一次次，目的DNA片段增加一一倍30次循環(huán)后可可達(dá)109條230=1,073,741,824動(dòng)畫(huà)33*106常規(guī)PCR：一對(duì)引物物，擴(kuò)增一一條DNA片段。多重PCR（Multiplex-PCR）：多對(duì)引引物，同時(shí)時(shí)擴(kuò)增多條條DNA片段。*107PCR操作過(guò)程：：（1）引物物（primer）的設(shè)計(jì)與與合成：：根據(jù)已已知的基基因序列列，設(shè)計(jì)計(jì)合成用用于擴(kuò)增增特異性性基因片片段的寡寡聚核苷苷酸引物物。（2）模板板（template）DNA的提取。。（3）PCR擴(kuò)增：取取一定量量的DNA提取物，，加入過(guò)過(guò)量引物物，TaqDNA聚合酶，，dNTP，PCR反應(yīng)緩沖沖液，Mg離子，PCR儀（ThermalCyclers）上擴(kuò)增。。（4）結(jié)果分分析：采采用瓊脂脂糖凝膠膠電泳分分析擴(kuò)增增結(jié)果。。*108PCR儀熱循環(huán)儀儀該儀器可可實(shí)現(xiàn)PCR程序中各各步驟間間溫度的的迅速升升降可自動(dòng)化化控制，，輸入各各步驟的的溫度、、時(shí)間等等參數(shù)后后自動(dòng)完完成反應(yīng)應(yīng)程序。。*109三、、PCR反應(yīng)應(yīng)成成分分及及功功能能（一一））、、DNA聚合合酶酶的的選選擇擇1.KlenowDNA聚合合酶酶:缺點(diǎn)點(diǎn):①受熱熱失失活活；；②產(chǎn)產(chǎn)物物混混合合其其他他DNA分子子；；③產(chǎn)產(chǎn)物物混混合合大大量量雜雜蛋蛋白白④擴(kuò)擴(kuò)增增DNA小于于400bp.*1102、TaqDNApolymerase1969年，，美美國(guó)國(guó)黃黃石石國(guó)國(guó)家家公公園園溫溫泉泉中中分分已克克隆隆了了該該酶酶基基因因，，表表達(dá)達(dá)蛋蛋白白已已成成功功純純化化，，其其分分子子量量為為94kD①、活活性性：：在幾幾種種水水棲棲熱熱菌菌中中活活性性最最高高，，200000U/mg②、離離子子需需要要：：對(duì)對(duì)Mg2+，單單價(jià)價(jià)離離子子（（K+或NH4+）的的性性質(zhì)質(zhì)和和濃濃度度較較敏敏感感。。適適當(dāng)當(dāng)濃濃度度的的KCl可使使合合成成率率增增加加50％～～60％，，*111③、忠實(shí)實(shí)性有5‘→→3’’聚合酶酶活性，，無(wú)3‘→→5’’外切酶酶活性性。沒(méi)有校校正單核苷苷酸錯(cuò)錯(cuò)配功能致命弱弱點(diǎn)。。一般出出錯(cuò)率率為2×10-4核苷酸酸/循環(huán)，，利用用PCR克隆、、測(cè)序序時(shí)尤尤應(yīng)注注意。。如何避避免錯(cuò)錯(cuò)配？？使用有有校對(duì)對(duì)功能能的酶酶。*112抑制劑劑尿素、、乙醇醇、DMSO、DMF、甲酰酰胺、、SDS及許多多其他他化學(xué)學(xué)藥劑劑。內(nèi)源DNA:不同來(lái)來(lái)源的的酶可可能由由于制制備過(guò)過(guò)程中中殘留留的原原細(xì)菌菌DNA或PCR產(chǎn)物的的污染而而含有有不明明來(lái)源源的DNA。在使用用擴(kuò)增增保守守序列列的通通用引引物時(shí)時(shí)，會(huì)會(huì)在無(wú)無(wú)模板板對(duì)照照管出出現(xiàn)擴(kuò)擴(kuò)增帶帶。保存:在-20℃至少6個(gè)月。。*1133PwoDNApolymerase有5‘→3’聚合酶酶活性性和3‘→5’外切酶酶活性性，有校正正單核核苷酸酸錯(cuò)配配功能能，準(zhǔn)準(zhǔn)確度度比Taq酶高10倍?？蓴U(kuò)增增DNA片段的的長(zhǎng)度度5kb。產(chǎn)物為為平末末端DNA片段，，可直直接進(jìn)進(jìn)行連連接。。*1144TthDNA聚合酶酶有5‘→→3’’聚合酶酶活性性，無(wú)無(wú)3‘→→5’’外切酶酶活性性，在有Mn離子時(shí)時(shí)有反反轉(zhuǎn)錄錄酶活活力，，有Mg離子時(shí)時(shí)可進(jìn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。。該酶可可用于于RT-PCR可擴(kuò)增增DNA片段的的長(zhǎng)度度1kb*115（二））、模模板DNATemplateDNAdsDNA，ssDNA,DNA的來(lái)源源：根據(jù)研研究對(duì)對(duì)象不不同DNA來(lái)源不不同：：動(dòng)物可提取取血液或特定定組織織中的的DNA植物可取葉片，，芽等組織織。真菌、、細(xì)菌菌直接接提取取菌體體DNA對(duì)于RNA樣品，首先先需要反轉(zhuǎn)錄錄成cDNA才能進(jìn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA遠(yuǎn)比RNA穩(wěn)定。*116（三））、引引物物（primes）1、設(shè)計(jì)計(jì)時(shí)應(yīng)應(yīng)注意意事項(xiàng)項(xiàng)(最重要要)(1)、長(zhǎng)度度:20～27bp(2)、G+C含量：：40-60%，ATCG隨機(jī)分分布*117Iftherearecomplementarysequencesbetweentwoprimers.ThetwoprimersareComplementaryat3‘‘end5‘3‘5‘3‘Primerdimer引物二二聚體體ThetwoprimersareComplementaryat5‘‘end5‘3‘5‘3‘ThetwoendsofoneprimerarecomplementaryPrimercyclizeinternalcomplementarity(3)、引物物內(nèi)和和引物物間無(wú)無(wú)互互補(bǔ)序序列*1185’5’3’3’5’5’72oCextension3`endcannotbemodified5`endcouldbemodified(4)、引物物的3`端：不不能修修飾(5)、引物物的5‘端：決決定產(chǎn)產(chǎn)物長(zhǎng)長(zhǎng)度，，可以以修飾飾，加加上限限制性性酶切切位點(diǎn)點(diǎn)。*1195`enddeterminethelengthofthePCRproduct.*120(6)、序列的特特異性利用已知序序列設(shè)計(jì)引引物，擴(kuò)增增未知DNA片段時(shí)，已已知序列在在引物區(qū)的的序列同源源性應(yīng)盡可可能大，小小于70%就可能出現(xiàn)現(xiàn)非特異性性擴(kuò)增。*1215’3’5’3’5’3’5’3’ATCGAATGTGGCATATCGAATGTGGCATATCGAATGTGGCATATCGAATGTGGCAT里氏木霉霉CBH2基因綠色木霉霉CBH2基因李氏木霉霉CBH2基因康氏木霉霉CBH2基因TGGAATCGTCGAAACCTAAAACCGT??AA?C?*1222、PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度度不同的DNA聚合酶不不同,最長(zhǎng)可達(dá)達(dá)10Kb,一般在2kb以內(nèi)。3、保存凍干引物物于-20℃℃可保存1-2年，液體體狀態(tài)于于-20℃℃可保存6個(gè)月。一一般均在在-20℃℃保存4、反應(yīng)引引物終濃濃度0.2-1μmol/L。濃度過(guò)高高易形成成引物二二聚體，，濃度過(guò)過(guò)低，降降低PCR的產(chǎn)率.*123*1244、PCR反應(yīng)體系系的其他他成分（1）緩沖沖溶液10-50mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8,20℃）（2）Mg2+：為提高TaqDNA聚合酶的的活性含量：低低:低活性，，高:非特異性性擴(kuò)增*125（3）dNTPs（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）貯備dNTPs液：1mol/LNaOH調(diào)pH至中性。。貯備濃度度為10mmol/L，終濃度度為20-200umol/L，分裝-20℃℃保存。4種dNTP濃度應(yīng)相相同。*1265、PCR循環(huán)的溫溫度與時(shí)時(shí)間預(yù)變性94℃10min變性94℃30s退火40-60℃30s延伸70-75℃2min延伸70-75℃10min循環(huán):25-30次*127（六）、、PCR的擴(kuò)增平平臺(tái)期平臺(tái)期：：PCR過(guò)程經(jīng)過(guò)過(guò)一定次次數(shù)的循循環(huán)后，，待擴(kuò)增增的DNA片段不再再以指數(shù)數(shù)關(guān)系累累積，而而進(jìn)入線線性關(guān)系系累積。。進(jìn)入平臺(tái)臺(tái)期的原原因：模板DNA過(guò)量引物或dNTP的量不足足。DNA聚合酶中中途失活活。*128四.PCR的優(yōu)化*1291、變性溫溫度和時(shí)時(shí)間變性不完完全——失敗。一般94℃基因的G和C多，可提提高變性性溫度.過(guò)高或時(shí)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)長(zhǎng)，酶活活性會(huì)損損失。*1302、退火(annealing)溫度與時(shí)時(shí)間通常37-55℃、30s~2min。引物G、C含量高、、長(zhǎng)度度長(zhǎng)并與與模板完完全配對(duì)對(duì)時(shí)，可可提高溫溫度。溫度越高高，產(chǎn)物物特異性性越高。。*131溫度應(yīng)通通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)確定.每次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)溫度遞遞增(減)2℃.可使用梯梯并PCR儀.*1323、延伸的的溫度與與時(shí)間常用72℃.時(shí)間：對(duì)對(duì)低濃度度的、序序列長(zhǎng)的的DNA片段，可可延長(zhǎng)時(shí)時(shí)間。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)長(zhǎng)，非特特異性增增加。一一般在擴(kuò)擴(kuò)增后，，需一步步較長(zhǎng)時(shí)時(shí)間的延延伸反應(yīng)應(yīng)。4循環(huán)次數(shù)數(shù):25-30個(gè)足夠夠。循環(huán)過(guò)過(guò)多，，非特特異性性增加加*1335Mg2+濃度[Mg2+]低，產(chǎn)物少少.[Mg2+]高，非特異異性高。*134強(qiáng)大擴(kuò)增能能力，檢測(cè)測(cè)敏感極微量的污污染便可導(dǎo)導(dǎo)致假陽(yáng)性性。五、PCR污染及其對(duì)對(duì)策*1351污染源①、點(diǎn)樣器和加加樣器②、離心機(jī)機(jī)③、微解剖剖刀④、濃縮用具⑤、電泳裝裝置等等。*1362污染的預(yù)防防(1)隔離不同操操作區(qū)：前處理、后后處理在不不同隔離工工作臺(tái)或房房間進(jìn)行。。(2)分裝試劑：去離子水、、緩沖液、、吸頭、離離心管等均均應(yīng)高壓滅滅菌。引物不能高壓，，用滅菌的去去離子水在在無(wú)菌條件件下配制。試劑均應(yīng)在在無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)區(qū)制備、分分裝與貯存存。*137(3)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操操作:①戴一次性手手套操作。。②避免反應(yīng)應(yīng)液的飛濺濺。③用一次性性移液器或或吸頭。(4)結(jié)果的重演演:反復(fù)驗(yàn)證*138六.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的的分析法1凝膠電泳分分析法瓊脂糖凝膠膠、聚丙烯酰胺胺凝膠電泳泳鑒定產(chǎn)物大大小，還可可以純化擴(kuò)擴(kuò)增產(chǎn)物。。2點(diǎn)雜交當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物物是多條帶帶時(shí)，用點(diǎn)點(diǎn)雜交更合合適3序列測(cè)定最準(zhǔn)*1394其他：微孔板夾心心雜交法、、PCR-ELISA法、顏色互補(bǔ)分分析法、單一核苷酸酸引物延伸伸法PCR-OLA*140第五節(jié)凝凝膠電電泳分析析DNA片段AnalysisofDNAfragmentbygelelectrophoresis一、核酸酸電泳的的原理：：核酸是兼兼性離子子，具有有等電點(diǎn)點(diǎn)(DNA4~4.5，RNA2~2.5)。在中性性或堿性性緩沖系系統(tǒng)中帶帶負(fù)電。電泳：在外電場(chǎng)場(chǎng)作用下下，由于于離子所所帶電荷荷大小和和性質(zhì)不不同，其其泳動(dòng)方方向和速速率也不不同，從從而達(dá)到到分離的的目的。。*141OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

兼性離子子帶正電荷荷離子帶負(fù)電荷荷離子Base-H+Base-HH+Base-H++HHH+

+

+

+

HBase-H+Base-HH+Base-H++*1422、電泳泳遷移率率與DNA的構(gòu)型和和大小相相關(guān)。大小相同同：超螺旋結(jié)結(jié)構(gòu)最快快，環(huán)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)次之，，線性結(jié)構(gòu)構(gòu)最慢。。構(gòu)型相同同：越小越快快。*143凝膠固體-DNA不會(huì)丟失失固體-提供阻力力*1443、DNA可以被染染色觀察察可見(jiàn)光下下DNA無(wú)色。DNA被EB染色后，，紫外光光照射可可發(fā)光，，可以檢檢測(cè)和分分析。*14512實(shí)例例*146二、電泳泳方法：：1、Agarosegelelectrophoresis瓊脂糖凝凝膠電泳泳(分離范圍圍:70bp-80kb）2、Polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)聚丙烯酰酰胺凝膠膠電泳(分離范圍圍:6bp-1kb)*1471、瓊脂糖糖凝膠電電泳*148（1）、緩沖沖溶液（（Buffer）一種溶液液可同時(shí)時(shí)用于電電泳和凝凝膠制備備。常用：TAE（Tris-乙酸-EDTA）TBE（Tris-硼酸-EDTA），較粘粘稠，*149(2)、凝膠中