雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件

4、雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制（以大腸桿菌為例）

雙鏈的解開

RNA引物的合成

DNA鏈的延伸切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段4、雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制1(1)雙鏈的解開一些概念：

DNA的復(fù)制有特定的起始位點(diǎn)，叫做復(fù)制原點(diǎn)。常用ori(或o）表示。許多生物的復(fù)制原點(diǎn)都是富含A、T的區(qū)段。大腸桿菌染色體DNA以及真核生物的細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀，只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，而真核生物染色體DNA是線性雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點(diǎn)。從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)復(fù)制單位，叫復(fù)制子（基因組獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位）。(1)雙鏈的解開一些概念：2復(fù)制原點(diǎn)由DnaA蛋白識(shí)別，在原點(diǎn)由DnaB蛋白（解螺旋酶）將雙螺旋解開成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補(bǔ)鏈(DNA雙鏈的解開還需DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Π、SSB),在原點(diǎn)處形成一個(gè)眼狀結(jié)構(gòu)，叫復(fù)制眼。

DNA復(fù)制進(jìn)行時(shí)，在眼的兩側(cè)出現(xiàn)兩個(gè)叉子狀的生長點(diǎn)(growthpoint)，叫復(fù)制叉。在復(fù)制叉上分布著各種與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白因子，它們構(gòu)成的復(fù)合物稱為復(fù)制體（replisome）復(fù)制叉復(fù)制叉復(fù)制原點(diǎn)由DnaA蛋白識(shí)別，在原點(diǎn)由DnaB蛋白（解螺旋酶3復(fù)制叉起點(diǎn)復(fù)制叉延伸延伸起點(diǎn)領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈隨后鏈隨后鏈3’5’3’5’DNA的雙向復(fù)制復(fù)制叉起點(diǎn)復(fù)制叉延伸延伸起點(diǎn)領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈隨后鏈隨后鏈3’5’4（2）RNA引物的合成

引發(fā)體在復(fù)制叉上移動(dòng)，沿模板鏈5’3’的方向移動(dòng)，與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相同，識(shí)別合成的起始位點(diǎn)，DnaB蛋白活化引物合成酶。引發(fā)RNA引物的合成。領(lǐng)頭鏈先引發(fā)開始合成，以原來一條DNA單鏈為模板（3’5’),按5’3’的方向合成一段RNA引物鏈。領(lǐng)頭鏈開始合成后，隨后鏈也開始合成其引物。引物長度約為幾個(gè)至10個(gè)核苷酸，在引物的5’端含3個(gè)磷酸殘基（引物酶的底物是核苷三磷酸），3’端為游離的羥基。RNA引物的合成稱為“引發(fā)”。引發(fā)是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，已經(jīng)證明大腸桿菌、枯草桿菌和淋巴細(xì)胞等DNA的復(fù)制的引發(fā)需要一種稱為“引物體”（primosome)的RNA合成系統(tǒng)。引物體是由引物合成酶和另外的幾種蛋白質(zhì)共同組成的。它可以沿模板鏈向分叉的方向前進(jìn)，并斷斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成后隨鏈的引物RNA短鏈。引物RNA一般只含少數(shù)核苷酸殘基（原核生物約為100個(gè)核苷酸，真核生物約為10個(gè)核苷酸左右）。（2）RNA引物的合成引發(fā)體在復(fù)制5（3）DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種脫氧核糖核苷5’-三磷酸為底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時(shí)進(jìn)行領(lǐng)頭鏈和隨后鏈的合成。兩條鏈方向相反。

領(lǐng)頭鏈隨后鏈岡崎片段半不連續(xù)復(fù)制岡崎模型（3）DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種脫氧核糖6在DNA聚合酶Ⅲ的作用下，在引物的3’-端逐個(gè)添加與模板堿基順序互補(bǔ)的脫氧核苷酸單位以完成岡崎片段或完整鏈的合成。然后通過DNA聚合酶Ⅰ的5’至3’的外切酶活性將RNA引物上的核苷酸單位逐個(gè)除去。每個(gè)核苷酸單位被切除后立即被與模板鏈相應(yīng)位置堿基互補(bǔ)的脫氧核苷酸補(bǔ)上。這后一反應(yīng)是利用前面的岡崎片段作為引物通過DNA聚合酶Ⅰ的聚合酶活性完成的。在DNA聚合酶Ⅲ的作用下，在引物的3’-端逐個(gè)添加與模板堿基7領(lǐng)頭鏈—在DNA復(fù)制時(shí)，合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致并連續(xù)合成的鏈。隨后鏈—在DNA復(fù)制時(shí)，合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈。半不連續(xù)復(fù)制—在DNA復(fù)制時(shí)，領(lǐng)頭鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的,而隨后鏈的合成是不連續(xù)的，這種復(fù)制方式稱為半不連續(xù)復(fù)制。發(fā)現(xiàn)（1968）：同位素實(shí)驗(yàn)，3HdT

短時(shí)間內(nèi)為DNA小片段一段時(shí)間后檢測到DNA大片段。當(dāng)用DNA連接酶的變異株時(shí)，檢測到大量DNA片段的積累?！C明DNA復(fù)制中有小片段合成。測定DNA小片段，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于合成DNA的一半。由于U替代dT，被尿嘧啶-N-糖基酶切除。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突變植株中，檢測到一半3H標(biāo)記出現(xiàn)在小片段（岡崎片段）中。領(lǐng)頭鏈—在DNA復(fù)制時(shí)，合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致并連續(xù)8岡崎片段在DNA復(fù)制過程中，領(lǐng)頭鏈能連續(xù)合成，而隨后鏈只能是斷續(xù)的合成53的多個(gè)短片段，這些不連續(xù)的小片段以其發(fā)現(xiàn)者的名字命名為岡崎片段。岡崎片段：真核生物中100-200個(gè)核苷酸（核小體的DNA單位）。原核生物中1000-2000個(gè)核苷酸（相當(dāng)于一個(gè)順反子）。岡崎片段9

1968年岡崎等用3H脫氧胸苷摻入噬菌體感染的大腸桿菌，然后分離標(biāo)記的DNA產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)首先合成的是較短是DNA片段，接著出現(xiàn)較大的分子。一般把這些DNA片段稱為岡崎片段。進(jìn)一步研究證明，岡崎片段在細(xì)菌和真核生物中普遍存在。細(xì)菌的岡崎片段較長，約有1000-2000個(gè)核苷酸；真核生物的較短，約為100-200個(gè)核苷酸。岡崎等最初做的實(shí)驗(yàn)不能判斷DNA鏈的不連續(xù)合成只發(fā)生在一條鏈上，還是兩條鏈都如此。后來進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)證明，在DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)的，另一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的。也就是說，聚合酶沿復(fù)制叉移動(dòng)時(shí)，模板鏈為3’至5‘的一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，而模板鏈為5’至3‘的一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的。人們就將這種復(fù)制方式稱為半不連續(xù)復(fù)制。

由于DNA復(fù)制酶系不易從DNA模板上解離下來，因此前導(dǎo)鏈的合成總是連續(xù)的。但由于很多因素可影響到前導(dǎo)鏈的連續(xù)性，例如模板鏈的損傷、復(fù)制因子和底物的供應(yīng)不足等，都會(huì)引起前導(dǎo)鏈復(fù)制中斷并從另一新點(diǎn)起始。1968年岡崎等用3H脫氧胸苷摻入噬菌體感染的大10（4）切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段（復(fù)制終止）

當(dāng)新形成的岡崎片段延長至一定長度，其3’-OH端遇到上一個(gè)岡崎片段時(shí)即停止合成。復(fù)制叉移動(dòng)到終止區(qū)即停止復(fù)制（大腸桿菌有一個(gè)終止區(qū)）。這時(shí)會(huì)發(fā)生一系列變化：在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填補(bǔ)上；在DNA連接酶作用下，連接相鄰的DNA鏈；修復(fù)摻入DNA鏈的錯(cuò)配堿基；以修復(fù)方式填補(bǔ)終止區(qū)50-100bp的空缺。這樣以兩條親代DNA鏈為模板，各自形成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。結(jié)果是形成了兩個(gè)DNA雙股螺旋分子。（4）切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段11

連接是DNA連接酶的作用：各岡崎片段通過DNA連接酶相互連接最終形成后隨鏈。DNA連接酶催化一個(gè)DNA鏈的5’-磷酸根與另一個(gè)DNA鏈的3’-羥基形成磷酸二酯鍵，但是這兩個(gè)鏈必須都與同一個(gè)互補(bǔ)鏈結(jié)合，而且兩個(gè)鏈必須是相臨的，反應(yīng)需要能量。

12DNA復(fù)制體的結(jié)構(gòu)：DNA合成的生點(diǎn)，即復(fù)制叉上，分布著各種各樣于復(fù)制有關(guān)的酶和輔助因子，它們?cè)贒NA鏈上形成離散的復(fù)合體，彼此配合，進(jìn)行高度精確的復(fù)制，這異結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制體（replisome)。這種復(fù)制體于細(xì)胞內(nèi)存在的一般游離體（例如核糖體)不同，復(fù)制體只是于復(fù)制叉DNA特殊結(jié)構(gòu)相結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物。就現(xiàn)在所知，涉及DNA復(fù)制過程的酶和蛋白質(zhì)因子共有30多種。右圖為復(fù)制體的最主要成分和復(fù)制的過程示意圖解。圖中DNA復(fù)制叉上進(jìn)行的基本過程包括：雙鏈的解開；RNA引物的合成；DNA倆的延長；切除RNA引物，添補(bǔ)缺口，連接相臨的DNA片段；切除和修復(fù)摻入DNA鏈的脫氧尿苷酸和錯(cuò)配堿基。DNA復(fù)制體的結(jié)構(gòu)：DNA合成的生點(diǎn)，即復(fù)制叉上，分布13雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件14雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件155、真核DNA的復(fù)制：真核細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，有關(guān)DNA復(fù)制的研究主要來自原核生物。但近年來，由于一些新技術(shù)的應(yīng)用和體外復(fù)制系統(tǒng)的建立，真核細(xì)胞DNA的復(fù)制研究也有了較大進(jìn)展。在真核細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了岡崎片段、RNA引物、DNA連接酶和各種有關(guān)DNA螺旋分子解旋的酶和蛋白質(zhì)。因此，真核細(xì)胞DNA的復(fù)制的過程可能十分相似于原核細(xì)胞DNA的復(fù)制。但兩者相比，主要又下列不同之處：①真核細(xì)胞DNA的復(fù)制叉有多個(gè)起始點(diǎn)，即具有多個(gè)復(fù)制叉來完成，并且常是雙向延長。而原核細(xì)胞常具一個(gè)復(fù)制叉。②真核細(xì)胞的岡崎片段較小，常為100-200個(gè)核苷酸；引物也較小，約為10個(gè)核苷酸。③真核細(xì)胞DNA復(fù)制的速度比原核生物慢，基因組比原核生物大。然而真核生物DNA上有多個(gè)復(fù)制點(diǎn)，所以復(fù)制的總速度可能比原核生物更快。④真核細(xì)胞的DNA在全部復(fù)制完成之前，起點(diǎn)不再從新開始復(fù)制，而在快速生長的原核生物，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。⑤DNA聚合酶的作用有差別。原核具有3種聚合酶，真核具有4（或5）種聚合酶，且除了聚合酶δ外都不具有外切酶活力。⑥真核細(xì)胞線性染色體的末端DNA稱為端粒（telomere）。端粒的復(fù)制由一種特殊的酶——端粒酶（telomerase）所催化。端粒酶是一核糖核蛋白，它由RNA和蛋白質(zhì)連種成分組成。端粒酶最早于1985年在四膜蟲細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)知該酶在所有真核細(xì)胞中都可能存在且具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。5、真核DNA的復(fù)制：真核細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，有關(guān)DN16復(fù)制叉復(fù)制叉終止區(qū)端粒結(jié)構(gòu)3535端粒結(jié)構(gòu)端粒酶是含RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制叉復(fù)制叉終止區(qū)端粒結(jié)構(gòu)3535端粒結(jié)構(gòu)端17

DNA復(fù)制的其它方式大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制（一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制）真核細(xì)胞線狀染色體DNA的復(fù)制方式（多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制）單向滾環(huán)式復(fù)制（噬菌體X174DNA—單鏈環(huán)狀）3

D-環(huán)式復(fù)制方式（線粒體雙鏈環(huán)狀DNA：兩條鏈的復(fù)制起點(diǎn)不同位置，且復(fù)制不同步）DNA復(fù)制的其它方式大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制（一個(gè)復(fù)制18總之，DNA復(fù)制分子機(jī)制的基本特點(diǎn)是：1、復(fù)制是半保留的。2、復(fù)制起始于細(xì)菌或病毒的特定部位，真核生物有多個(gè)起始點(diǎn)。3、復(fù)制可以朝一個(gè)方向，也可以向兩個(gè)方向進(jìn)行，后者更為常見。4、復(fù)制時(shí)，DNA的兩條鏈都從5‘端向3’端延伸。5復(fù)制時(shí)半不連續(xù)的，前導(dǎo)鏈時(shí)連續(xù)合成的，后隨鏈時(shí)不連續(xù)合成的，即先合成短的岡崎片段，再連接起來構(gòu)成后隨鏈。6、岡崎片段的合成起始于一小段RNA引物，這一小段RNA以后被酶切除，缺口由脫氧核苷酸補(bǔ)滿后再與新生DNA鏈連接在一起。7、復(fù)制有多種機(jī)制，即使在同一個(gè)細(xì)胞里，也可因環(huán)境——酶的豐富程度、溫度、營養(yǎng)條件等的不同而具有不同的起始機(jī)制和鏈延長的方式?？傊?，DNA復(fù)制分子機(jī)制的基本特點(diǎn)是：19（二）反轉(zhuǎn)錄作用（RNA指導(dǎo)下的DNA合成）以RNA為模板，即按照RNA中的核苷酸順序合成DNA，這與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反，故稱為反向轉(zhuǎn)錄，又稱為逆轉(zhuǎn)錄（revrsetranscription)。催化逆轉(zhuǎn)錄的酶，即RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（RNA-directedDNApolymerase），最初是在致癌病毒中發(fā)現(xiàn)的。

1970年，Temin，Mizufani和Baltimore分別從致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase),這就有力地證明了Temin的前病毒學(xué)說（provirustheory）：即致癌RNA病毒的復(fù)制需經(jīng)過一個(gè)DNA中間體（即前病毒），此DNA中間體可部分或全部整合（integration）到細(xì)胞DNA中，并隨細(xì)胞增殖而傳遞至子代細(xì)胞，細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化就是由前病毒引起的。前病毒學(xué)說的一個(gè)關(guān)鍵，即是認(rèn)為遺傳信息可以從RNA傳遞給DNA。在此傳遞過程中需逆轉(zhuǎn)錄酶。該酶催化的反應(yīng)需要模板和引物，此外還需要適當(dāng)濃度的二價(jià)陽離子（鎂或錳）和還原劑（以保護(hù)酶蛋白中的巰基）；合成的方向也是5‘至3’。逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，它有三種酶的活力：1、它可以利用RNA作模板，在其上合成出一條互補(bǔ)DNA鏈，RNA-DNA雜種分子（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力）；2、還可以在新合成的DNA鏈上合成另一條互補(bǔ)DNA鏈，形成雙鏈DNA分子（DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力）；3、它尚有核糖核酸酶H的活力，專門水解RNA-DNA雜種分子中的RNA，可沿3‘至5’和5‘至3’兩個(gè)方向起核糖核酸酶的作用。逆轉(zhuǎn)錄過程的發(fā)現(xiàn)，有助于人們對(duì)RNA病毒致癌機(jī)制的了解，并對(duì)防止腫瘤提供了重要線索。（二）反轉(zhuǎn)錄作用（RNA指導(dǎo)下的DNA合成）20+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄過程

（以前病毒形式引起整合到宿主細(xì)胞DNA中而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化）

單鏈病毒RNA

RNA-DNA雜交分子雙鏈DNA（前病毒）

逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性：

RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性

DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿5’3’和3’5’兩個(gè)方向起核酸外切酶的作用。逆轉(zhuǎn)錄酶也和DNA聚合酶一樣，沿5’3’方向合成DNA，并要求短鏈RNA作引物。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶21cDNA：幾乎所有真核生物mRNA分子的3‘末端都有一段polyA,當(dāng)加入寡聚dT作為引物時(shí)，mRNA就可作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下在體外合成與其互補(bǔ)的DNA，稱為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的理論和實(shí)踐意義：不能把“中心法則”絕對(duì)化，遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。促進(jìn)了分子生物學(xué)、生物化學(xué)和病毒學(xué)的研究，為腫瘤的防治提供了新的線索。目前逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成為研究這些學(xué)科的工具。1983年，發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒（humanimmunedeficiencevirus,HIV）,感染T淋巴細(xì)胞后即殺死細(xì)胞，造成宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷，引起艾滋?。╝cquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）cDNA：幾乎所有真核生物mRNA分子的3‘末端都有一段po22（三）DNA的損傷修復(fù)DNA的損傷：DNA在復(fù)制時(shí)產(chǎn)生錯(cuò)配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學(xué)誘變等，破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。從而影響DNA的復(fù)制，并使DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯也跟著變化，因而表現(xiàn)出異常的特征（生物突變）。若DNA的損傷或錯(cuò)配得不到修復(fù)，會(huì)導(dǎo)致DNA突變。其主要形式：一個(gè)或幾個(gè)堿基被置換插入一個(gè)或幾個(gè)堿基一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)缺失

DNA的損傷修復(fù)——

四種修復(fù)途徑:光復(fù)活、切除修復(fù)、復(fù)組修復(fù)和誘導(dǎo)修復(fù)（亦稱暗修復(fù)）。（三）DNA的損傷修復(fù)23雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件24

光復(fù)活：400nm左右的光激活光復(fù)活酶，專一分解紫外光照射引起的同一條鏈上TT（CCCT）二聚體。（包括從單細(xì)胞生物到鳥類，而高等哺乳動(dòng)物無）切除修復(fù)：將DNA分子中的受損傷部分切除，以完整的那條鏈為模板再重新合成。特異內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA連接酶均參與。（發(fā)生在DNA復(fù)制前）重組修復(fù)

（發(fā)生在復(fù)制后）：復(fù)制時(shí)，跳過損傷部位，新鏈產(chǎn)生缺口由母鏈彌補(bǔ)，原損傷部位并沒有切除但在后代逐漸稀釋。P349誘導(dǎo)修復(fù)：造成DNA損傷或抑制復(fù)制的處理均能引起一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOSresponse）。此過程誘導(dǎo)產(chǎn)生切除修復(fù)和重組修復(fù)中的關(guān)鍵蛋白和酶，同時(shí)產(chǎn)生無校對(duì)功能的DNA聚合酶。所以會(huì)有2種結(jié)果：修復(fù)或變異（進(jìn)化）。

25

紫外線照射可以使DNA分子中同一條鏈相臨的兩個(gè)胸腺嘧啶堿基之間形成二聚體，這種二聚體是由兩個(gè)胸腺嘧啶堿基以共價(jià)鍵連接成環(huán)形丁烷的結(jié)構(gòu)而形成的，如右圖。其他嘧啶堿基之間也能形成類似的二聚體。但數(shù)量有限。嘧啶二聚體的形成，影響了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，使其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能均受到阻礙。細(xì)胞內(nèi)具有一系列起修復(fù)作用的酶系統(tǒng)，可以除去DNA上面的損傷，恢復(fù)DNA的正常雙螺旋結(jié)構(gòu)。目前已經(jīng)知道體內(nèi)有兩大修復(fù)系統(tǒng)，即無差錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)和有差錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)。紫外線照射可以使DNA分子中同一條鏈相臨的兩個(gè)261、無差錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)：此中修復(fù)系統(tǒng)可使受損傷的DNA完全得到修復(fù)，恢復(fù)原有的結(jié)構(gòu)和功能。主要包括光復(fù)活修復(fù)（photoreactivationrepair）和切除修復(fù)（excisionrepair）。（1）光復(fù)活修復(fù)：早在1949年即已發(fā)現(xiàn)光復(fù)活現(xiàn)象。稍后一些時(shí)間就了解到光復(fù)活的機(jī)制是可見光（大約在400nm）激活了光復(fù)活酶，它能分解由于紫外線照射而形成的嘧啶二聚體。光復(fù)活作用是一種高度專一的修復(fù)方式，它只作用于紫外線引起的DNA嘧啶二聚體。該酶在生物界分布很廣，從低等的單細(xì)胞生物到鳥類都有，而高等的哺乳類卻沒有。這說明在生物進(jìn)化過程中該作用逐漸被暗修復(fù)系統(tǒng)所取代，并丟失了這個(gè)酶。（2）切除修復(fù)：也稱為暗修復(fù)，即在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除掉，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)的過程。這是一種比較普遍的修復(fù)機(jī)制，對(duì)多種損傷均能起修復(fù)作用。參與切除修復(fù)的酶主要有：特異的核酸內(nèi)切酶、外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶。1、無差錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)：此中修復(fù)系統(tǒng)可使受損傷的DNA完全得到修27

修復(fù)過程包括四個(gè)步驟：即識(shí)別、切除、修復(fù)合成、連接（或者是識(shí)別、修復(fù)合成、切除、連接），如右圖。識(shí)別：專一性的核酸內(nèi)切酶在靠近二聚體（或其他損傷處）處切斷單鏈DNA。修復(fù)：DNA聚合酶利用完整的互補(bǔ)鏈為模板，在斷口處進(jìn)行局部的修復(fù)合成。切除：5‘-核酸外切酶切去含二聚體（或其他損傷）的寡核苷酸片段。連接：DNA連接酶在提供能量的基礎(chǔ)上將新合成的DNA鏈與原來的DNA鏈連接在一起。修復(fù)過程包括四個(gè)步驟：即識(shí)別、切除、修復(fù)合成、連接28雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件292、有差錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)：在這種修復(fù)系統(tǒng)中，受損傷DNA并不因修復(fù)而除掉損傷部位，但隨著修復(fù)的進(jìn)行，受損傷DNA的濃度越來越低，從而消除損傷的影響。主要包括重組修復(fù)（recombinationrepair）和SOS修復(fù)（SOSrepair）。（1）重組修復(fù)：重組修復(fù)是發(fā)生在DNA復(fù)制后的一種修復(fù)系統(tǒng)。在復(fù)制時(shí)，受損傷部位可被跳過，結(jié)果在子代鏈在損傷相對(duì)應(yīng)處留下一缺口，這種遺傳信息有缺損的子代DNA分子可通過遺傳重組而加以彌補(bǔ)，即從完整的母鏈上將相應(yīng)核苷酸序列片段移至子鏈缺口處，然后用再合成的序列來補(bǔ)上母鏈的空缺（如右圖）。此過程稱為重組修復(fù)，因?yàn)榘l(fā)生在復(fù)制之后，故又稱為復(fù)制后修復(fù)。2、有差錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)：在這種修復(fù)系統(tǒng)中，受損傷DNA并不因修復(fù)30雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件31（2）SOS修復(fù)：前面介紹的DNA損傷修復(fù)功能可以不經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生，然而許多能造成DNA損傷或抑制復(fù)制的處理均能引起一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOSresponse）。SOS反應(yīng)包括誘導(dǎo)出現(xiàn)的DNA損傷修復(fù)效應(yīng)、誘變效應(yīng)、細(xì)胞分裂的抑制以及溶原性細(xì)菌釋放噬菌體等。細(xì)胞的癌變也可能與SOS反應(yīng)有關(guān)。

SOS反應(yīng)是細(xì)胞DNA受到損傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現(xiàn)的應(yīng)急反應(yīng)。SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)系統(tǒng)包括避免差錯(cuò)的修復(fù)（errorfreerepair）和傾向差錯(cuò)的修復(fù)（errorpronerepair）兩類。光復(fù)活、切除修復(fù)能夠識(shí)別DNA的損傷或錯(cuò)配堿基而加以消除，在它們的修復(fù)過程中并不引入錯(cuò)配堿基，因此屬于避免差錯(cuò)的修復(fù)。SOS修復(fù)能誘導(dǎo)切除修復(fù)和重組修復(fù)中某些關(guān)鍵酶和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，使這些酶和蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的含量升高，從而加強(qiáng)切除修復(fù)和重組修復(fù)的能力。此外，SOS反應(yīng)還能誘導(dǎo)產(chǎn)生缺乏校對(duì)功能的DNA聚合酶，它能在DNA損傷部位進(jìn)行復(fù)制而避免了死亡，可是卻帶來了高的變異率。SOS的誘變效應(yīng)與此有關(guān)?，F(xiàn)在知道，SOS反應(yīng)是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。RecA蛋白不僅在同源重組中起重要作用，而且它也是SOS反應(yīng)最初發(fā)動(dòng)的因子。在有單鏈DNA和ATP存在時(shí)，RecA蛋白被激活而表現(xiàn)出蛋白水解酶的活力，它能分解λ噬菌體的組遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白（分子量22000）是許多基因的組遏物。當(dāng)它被RecA的蛋白水解酶分解后即可使一系列基因得以表達(dá)，其中包括紫外線損傷的修復(fù)基因uvrA、uvrB、uvrC（分別編碼核酸內(nèi)切酶的亞基），以及recA和lexA基因本身，此外還有編碼單鏈結(jié)合蛋白的基因ssb，與λ噬菌體DNA整合有關(guān)的基因himA，與誘變作用有關(guān)的基因umuDC，與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因sulA、ruv和lon以及一些功能還不清楚的基因dinA、B、D、F等。SOS反應(yīng)的機(jī)制見下圖：（2）SOS修復(fù)：前面介紹的DNA損傷修復(fù)功能可以不經(jīng)誘導(dǎo)而32雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件33雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件34

SOS反應(yīng)廣泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在不利環(huán)境中求得生存的一種基本功能。SOS反應(yīng)主要包括兩個(gè)方面：DNA修復(fù)和導(dǎo)致變異。在一般環(huán)境中突變常是不利的，可是在DNA受到損傷和修復(fù)被抑制的特殊條件下，生物發(fā)生突變將是有利于它的生存。因此SOS反應(yīng)可能在生物進(jìn)化中起著重要作用。然而在另一方面，大多數(shù)能在細(xì)菌中誘導(dǎo)產(chǎn)生SOS反應(yīng)的作用劑，對(duì)高等動(dòng)物都是致癌的：如X-射線、紫外線、烷化劑、黃曲霉毒素等。而某些不能造成致癌的誘變劑卻并不引起SOS反應(yīng)，如5-溴尿嘧啶。因此猜測，癌變可能是通過SOS反應(yīng)造成的。目前有關(guān)致癌物的一些簡便檢測方法即是根據(jù)SOS反應(yīng)原理而設(shè)計(jì)的，因?yàn)樵趧?dòng)物身上誘發(fā)腫瘤的試驗(yàn)需要花費(fèi)較大的人力、物力和較長的時(shí)間，而細(xì)菌的SOS反應(yīng)則很易測定。SOS反應(yīng)廣泛存在于原核生物和真核生物，它是35雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件36雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件37

4、雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制（以大腸桿菌為例）

雙鏈的解開

RNA引物的合成

DNA鏈的延伸切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段4、雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制38(1)雙鏈的解開一些概念：

DNA的復(fù)制有特定的起始位點(diǎn)，叫做復(fù)制原點(diǎn)。常用ori(或o）表示。許多生物的復(fù)制原點(diǎn)都是富含A、T的區(qū)段。大腸桿菌染色體DNA以及真核生物的細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀，只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，而真核生物染色體DNA是線性雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點(diǎn)。從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)復(fù)制單位，叫復(fù)制子（基因組獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位）。(1)雙鏈的解開一些概念：39復(fù)制原點(diǎn)由DnaA蛋白識(shí)別，在原點(diǎn)由DnaB蛋白（解螺旋酶）將雙螺旋解開成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補(bǔ)鏈(DNA雙鏈的解開還需DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Π、SSB),在原點(diǎn)處形成一個(gè)眼狀結(jié)構(gòu)，叫復(fù)制眼。

DNA復(fù)制進(jìn)行時(shí)，在眼的兩側(cè)出現(xiàn)兩個(gè)叉子狀的生長點(diǎn)(growthpoint)，叫復(fù)制叉。在復(fù)制叉上分布著各種與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白因子，它們構(gòu)成的復(fù)合物稱為復(fù)制體（replisome）復(fù)制叉復(fù)制叉復(fù)制原點(diǎn)由DnaA蛋白識(shí)別，在原點(diǎn)由DnaB蛋白（解螺旋酶40復(fù)制叉起點(diǎn)復(fù)制叉延伸延伸起點(diǎn)領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈隨后鏈隨后鏈3’5’3’5’DNA的雙向復(fù)制復(fù)制叉起點(diǎn)復(fù)制叉延伸延伸起點(diǎn)領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈隨后鏈隨后鏈3’5’41（2）RNA引物的合成

引發(fā)體在復(fù)制叉上移動(dòng)，沿模板鏈5’3’的方向移動(dòng)，與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相同，識(shí)別合成的起始位點(diǎn)，DnaB蛋白活化引物合成酶。引發(fā)RNA引物的合成。領(lǐng)頭鏈先引發(fā)開始合成，以原來一條DNA單鏈為模板（3’5’),按5’3’的方向合成一段RNA引物鏈。領(lǐng)頭鏈開始合成后，隨后鏈也開始合成其引物。引物長度約為幾個(gè)至10個(gè)核苷酸，在引物的5’端含3個(gè)磷酸殘基（引物酶的底物是核苷三磷酸），3’端為游離的羥基。RNA引物的合成稱為“引發(fā)”。引發(fā)是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，已經(jīng)證明大腸桿菌、枯草桿菌和淋巴細(xì)胞等DNA的復(fù)制的引發(fā)需要一種稱為“引物體”（primosome)的RNA合成系統(tǒng)。引物體是由引物合成酶和另外的幾種蛋白質(zhì)共同組成的。它可以沿模板鏈向分叉的方向前進(jìn)，并斷斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成后隨鏈的引物RNA短鏈。引物RNA一般只含少數(shù)核苷酸殘基（原核生物約為100個(gè)核苷酸，真核生物約為10個(gè)核苷酸左右）。（2）RNA引物的合成引發(fā)體在復(fù)制42（3）DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種脫氧核糖核苷5’-三磷酸為底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時(shí)進(jìn)行領(lǐng)頭鏈和隨后鏈的合成。兩條鏈方向相反。

領(lǐng)頭鏈隨后鏈岡崎片段半不連續(xù)復(fù)制岡崎模型（3）DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種脫氧核糖43在DNA聚合酶Ⅲ的作用下，在引物的3’-端逐個(gè)添加與模板堿基順序互補(bǔ)的脫氧核苷酸單位以完成岡崎片段或完整鏈的合成。然后通過DNA聚合酶Ⅰ的5’至3’的外切酶活性將RNA引物上的核苷酸單位逐個(gè)除去。每個(gè)核苷酸單位被切除后立即被與模板鏈相應(yīng)位置堿基互補(bǔ)的脫氧核苷酸補(bǔ)上。這后一反應(yīng)是利用前面的岡崎片段作為引物通過DNA聚合酶Ⅰ的聚合酶活性完成的。在DNA聚合酶Ⅲ的作用下，在引物的3’-端逐個(gè)添加與模板堿基44領(lǐng)頭鏈—在DNA復(fù)制時(shí)，合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致并連續(xù)合成的鏈。隨后鏈—在DNA復(fù)制時(shí)，合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈。半不連續(xù)復(fù)制—在DNA復(fù)制時(shí)，領(lǐng)頭鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的,而隨后鏈的合成是不連續(xù)的，這種復(fù)制方式稱為半不連續(xù)復(fù)制。發(fā)現(xiàn)（1968）：同位素實(shí)驗(yàn)，3HdT

短時(shí)間內(nèi)為DNA小片段一段時(shí)間后檢測到DNA大片段。當(dāng)用DNA連接酶的變異株時(shí)，檢測到大量DNA片段的積累。——證明DNA復(fù)制中有小片段合成。測定DNA小片段，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于合成DNA的一半。由于U替代dT，被尿嘧啶-N-糖基酶切除。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突變植株中，檢測到一半3H標(biāo)記出現(xiàn)在小片段（岡崎片段）中。領(lǐng)頭鏈—在DNA復(fù)制時(shí)，合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致并連續(xù)45岡崎片段在DNA復(fù)制過程中，領(lǐng)頭鏈能連續(xù)合成，而隨后鏈只能是斷續(xù)的合成53的多個(gè)短片段，這些不連續(xù)的小片段以其發(fā)現(xiàn)者的名字命名為岡崎片段。岡崎片段：真核生物中100-200個(gè)核苷酸（核小體的DNA單位）。原核生物中1000-2000個(gè)核苷酸（相當(dāng)于一個(gè)順反子）。岡崎片段46

1968年岡崎等用3H脫氧胸苷摻入噬菌體感染的大腸桿菌，然后分離標(biāo)記的DNA產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)首先合成的是較短是DNA片段，接著出現(xiàn)較大的分子。一般把這些DNA片段稱為岡崎片段。進(jìn)一步研究證明，岡崎片段在細(xì)菌和真核生物中普遍存在。細(xì)菌的岡崎片段較長，約有1000-2000個(gè)核苷酸；真核生物的較短，約為100-200個(gè)核苷酸。岡崎等最初做的實(shí)驗(yàn)不能判斷DNA鏈的不連續(xù)合成只發(fā)生在一條鏈上，還是兩條鏈都如此。后來進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)證明，在DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)的，另一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的。也就是說，聚合酶沿復(fù)制叉移動(dòng)時(shí)，模板鏈為3’至5‘的一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，而模板鏈為5’至3‘的一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的。人們就將這種復(fù)制方式稱為半不連續(xù)復(fù)制。

由于DNA復(fù)制酶系不易從DNA模板上解離下來，因此前導(dǎo)鏈的合成總是連續(xù)的。但由于很多因素可影響到前導(dǎo)鏈的連續(xù)性，例如模板鏈的損傷、復(fù)制因子和底物的供應(yīng)不足等，都會(huì)引起前導(dǎo)鏈復(fù)制中斷并從另一新點(diǎn)起始。1968年岡崎等用3H脫氧胸苷摻入噬菌體感染的大47（4）切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段（復(fù)制終止）

當(dāng)新形成的岡崎片段延長至一定長度，其3’-OH端遇到上一個(gè)岡崎片段時(shí)即停止合成。復(fù)制叉移動(dòng)到終止區(qū)即停止復(fù)制（大腸桿菌有一個(gè)終止區(qū)）。這時(shí)會(huì)發(fā)生一系列變化：在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填補(bǔ)上；在DNA連接酶作用下，連接相鄰的DNA鏈；修復(fù)摻入DNA鏈的錯(cuò)配堿基；以修復(fù)方式填補(bǔ)終止區(qū)50-100bp的空缺。這樣以兩條親代DNA鏈為模板，各自形成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。結(jié)果是形成了兩個(gè)DNA雙股螺旋分子。（4）切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段48

連接是DNA連接酶的作用：各岡崎片段通過DNA連接酶相互連接最終形成后隨鏈。DNA連接酶催化一個(gè)DNA鏈的5’-磷酸根與另一個(gè)DNA鏈的3’-羥基形成磷酸二酯鍵，但是這兩個(gè)鏈必須都與同一個(gè)互補(bǔ)鏈結(jié)合，而且兩個(gè)鏈必須是相臨的，反應(yīng)需要能量。

49DNA復(fù)制體的結(jié)構(gòu)：DNA合成的生點(diǎn)，即復(fù)制叉上，分布著各種各樣于復(fù)制有關(guān)的酶和輔助因子，它們?cè)贒NA鏈上形成離散的復(fù)合體，彼此配合，進(jìn)行高度精確的復(fù)制，這異結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制體（replisome)。這種復(fù)制體于細(xì)胞內(nèi)存在的一般游離體（例如核糖體)不同，復(fù)制體只是于復(fù)制叉DNA特殊結(jié)構(gòu)相結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物。就現(xiàn)在所知，涉及DNA復(fù)制過程的酶和蛋白質(zhì)因子共有30多種。右圖為復(fù)制體的最主要成分和復(fù)制的過程示意圖解。圖中DNA復(fù)制叉上進(jìn)行的基本過程包括：雙鏈的解開；RNA引物的合成；DNA倆的延長；切除RNA引物，添補(bǔ)缺口，連接相臨的DNA片段；切除和修復(fù)摻入DNA鏈的脫氧尿苷酸和錯(cuò)配堿基。DNA復(fù)制體的結(jié)構(gòu)：DNA合成的生點(diǎn)，即復(fù)制叉上，分布50雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件51雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件525、真核DNA的復(fù)制：真核細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，有關(guān)DNA復(fù)制的研究主要來自原核生物。但近年來，由于一些新技術(shù)的應(yīng)用和體外復(fù)制系統(tǒng)的建立，真核細(xì)胞DNA的復(fù)制研究也有了較大進(jìn)展。在真核細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了岡崎片段、RNA引物、DNA連接酶和各種有關(guān)DNA螺旋分子解旋的酶和蛋白質(zhì)。因此，真核細(xì)胞DNA的復(fù)制的過程可能十分相似于原核細(xì)胞DNA的復(fù)制。但兩者相比，主要又下列不同之處：①真核細(xì)胞DNA的復(fù)制叉有多個(gè)起始點(diǎn)，即具有多個(gè)復(fù)制叉來完成，并且常是雙向延長。而原核細(xì)胞常具一個(gè)復(fù)制叉。②真核細(xì)胞的岡崎片段較小，常為100-200個(gè)核苷酸；引物也較小，約為10個(gè)核苷酸。③真核細(xì)胞DNA復(fù)制的速度比原核生物慢，基因組比原核生物大。然而真核生物DNA上有多個(gè)復(fù)制點(diǎn)，所以復(fù)制的總速度可能比原核生物更快。④真核細(xì)胞的DNA在全部復(fù)制完成之前，起點(diǎn)不再從新開始復(fù)制，而在快速生長的原核生物，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。⑤DNA聚合酶的作用有差別。原核具有3種聚合酶，真核具有4（或5）種聚合酶，且除了聚合酶δ外都不具有外切酶活力。⑥真核細(xì)胞線性染色體的末端DNA稱為端粒（telomere）。端粒的復(fù)制由一種特殊的酶——端粒酶（telomerase）所催化。端粒酶是一核糖核蛋白，它由RNA和蛋白質(zhì)連種成分組成。端粒酶最早于1985年在四膜蟲細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)知該酶在所有真核細(xì)胞中都可能存在且具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。5、真核DNA的復(fù)制：真核細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，有關(guān)DN53復(fù)制叉復(fù)制叉終止區(qū)端粒結(jié)構(gòu)3535端粒結(jié)構(gòu)端粒酶是含RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制叉復(fù)制叉終止區(qū)端粒結(jié)構(gòu)3535端粒結(jié)構(gòu)端54

DNA復(fù)制的其它方式大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制（一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制）真核細(xì)胞線狀染色體DNA的復(fù)制方式（多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制）單向滾環(huán)式復(fù)制（噬菌體X174DNA—單鏈環(huán)狀）3

D-環(huán)式復(fù)制方式（線粒體雙鏈環(huán)狀DNA：兩條鏈的復(fù)制起點(diǎn)不同位置，且復(fù)制不同步）DNA復(fù)制的其它方式大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制（一個(gè)復(fù)制55總之，DNA復(fù)制分子機(jī)制的基本特點(diǎn)是：1、復(fù)制是半保留的。2、復(fù)制起始于細(xì)菌或病毒的特定部位，真核生物有多個(gè)起始點(diǎn)。3、復(fù)制可以朝一個(gè)方向，也可以向兩個(gè)方向進(jìn)行，后者更為常見。4、復(fù)制時(shí)，DNA的兩條鏈都從5‘端向3’端延伸。5復(fù)制時(shí)半不連續(xù)的，前導(dǎo)鏈時(shí)連續(xù)合成的，后隨鏈時(shí)不連續(xù)合成的，即先合成短的岡崎片段，再連接起來構(gòu)成后隨鏈。6、岡崎片段的合成起始于一小段RNA引物，這一小段RNA以后被酶切除，缺口由脫氧核苷酸補(bǔ)滿后再與新生DNA鏈連接在一起。7、復(fù)制有多種機(jī)制，即使在同一個(gè)細(xì)胞里，也可因環(huán)境——酶的豐富程度、溫度、營養(yǎng)條件等的不同而具有不同的起始機(jī)制和鏈延長的方式。總之，DNA復(fù)制分子機(jī)制的基本特點(diǎn)是：56（二）反轉(zhuǎn)錄作用（RNA指導(dǎo)下的DNA合成）以RNA為模板，即按照RNA中的核苷酸順序合成DNA，這與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反，故稱為反向轉(zhuǎn)錄，又稱為逆轉(zhuǎn)錄（revrsetranscription)。催化逆轉(zhuǎn)錄的酶，即RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（RNA-directedDNApolymerase），最初是在致癌病毒中發(fā)現(xiàn)的。

1970年，Temin，Mizufani和Baltimore分別從致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase),這就有力地證明了Temin的前病毒學(xué)說（provirustheory）：即致癌RNA病毒的復(fù)制需經(jīng)過一個(gè)DNA中間體（即前病毒），此DNA中間體可部分或全部整合（integration）到細(xì)胞DNA中，并隨細(xì)胞增殖而傳遞至子代細(xì)胞，細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化就是由前病毒引起的。前病毒學(xué)說的一個(gè)關(guān)鍵，即是認(rèn)為遺傳信息可以從RNA傳遞給DNA。在此傳遞過程中需逆轉(zhuǎn)錄酶。該酶催化的反應(yīng)需要模板和引物，此外還需要適當(dāng)濃度的二價(jià)陽離子（鎂或錳）和還原劑（以保護(hù)酶蛋白中的巰基）；合成的方向也是5‘至3’。逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，它有三種酶的活力：1、它可以利用RNA作模板，在其上合成出一條互補(bǔ)DNA鏈，RNA-DNA雜種分子（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力）；2、還可以在新合成的DNA鏈上合成另一條互補(bǔ)DNA鏈，形成雙鏈DNA分子（DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力）；3、它尚有核糖核酸酶H的活力，專門水解RNA-DNA雜種分子中的RNA，可沿3‘至5’和5‘至3’兩個(gè)方向起核糖核酸酶的作用。逆轉(zhuǎn)錄過程的發(fā)現(xiàn)，有助于人們對(duì)RNA病毒致癌機(jī)制的了解，并對(duì)防止腫瘤提供了重要線索。（二）反轉(zhuǎn)錄作用（RNA指導(dǎo)下的DNA合成）57+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄過程

（以前病毒形式引起整合到宿主細(xì)胞DNA中而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化）

單鏈病毒RNA

RNA-DNA雜交分子雙鏈DNA（前病毒）

逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性：

RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性

DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿5’3’和3’5’兩個(gè)方向起核酸外切酶的作用。逆轉(zhuǎn)錄酶也和DNA聚合酶一樣，沿5’3’方向合成DNA，并要求短鏈RNA作引物。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶58cDNA：幾乎所有真核生物mRNA分子的3‘末端都有一段polyA,當(dāng)加入寡聚dT作為引物時(shí)，mRNA就可作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下在體外合成與其互補(bǔ)的DNA，稱為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的理論和實(shí)踐意義：不能把“中心法則”絕對(duì)化，遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。促進(jìn)了分子生物學(xué)、生物化學(xué)和病毒學(xué)的研究，為腫瘤的防治提供了新的線索。目前逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成為研究這些學(xué)科的工具。1983年，發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒（humanimmunedeficiencevirus,HIV）,感染T淋巴細(xì)胞后即殺死細(xì)胞，造成宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷，引起艾滋?。╝cquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）cDNA：幾乎所有真核生物mRNA分子的3‘末端都有一段po59（三）DNA的損傷修復(fù)DNA的損傷：DNA在復(fù)制時(shí)產(chǎn)生錯(cuò)配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學(xué)誘變等，破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。從而影響DNA的復(fù)制，并使DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯也跟著變化，因而表現(xiàn)出異常的特征（生物突變）。若DNA的損傷或錯(cuò)配得不到修復(fù)，會(huì)導(dǎo)致DNA突變。其主要形式：一個(gè)或幾個(gè)堿基被置換插入一個(gè)或幾個(gè)堿基一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)缺失

DNA的損傷修復(fù)——

四種修復(fù)途徑:光復(fù)活、切除修復(fù)、復(fù)組修復(fù)和誘導(dǎo)修復(fù)（亦稱暗修復(fù)）。（三）DNA的損傷修復(fù)60雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制課件61

光復(fù)活：400nm左右的光激活光復(fù)活酶，專一分解紫外光照射引起的同一條鏈上TT（CCCT）二聚體。（包括從單細(xì)胞生物到鳥類，而高等哺乳動(dòng)物無）切除修復(fù)：將DNA分子中的受損傷部分切除，以完整的那條鏈為模板再重新合成。特異內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA連接酶均參與。（發(fā)生在DNA復(fù)制前）重組修復(fù)

（發(fā)生在復(fù)制后）：復(fù)制時(shí)，跳過損傷部位，新鏈產(chǎn)生缺口由母鏈彌補(bǔ)，原損傷部位并沒有切除但在后代逐漸稀釋。P349誘導(dǎo)修復(fù)：造成DNA損傷或抑制復(fù)制的處理均能引起一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOSresponse）。此過程誘導(dǎo)產(chǎn)生切除修復(fù)和重組修復(fù)中的關(guān)鍵蛋白和酶，同時(shí)產(chǎn)生無校對(duì)功能的DNA聚合酶。所以會(huì)有2種結(jié)果：修復(fù)或變異（進(jìn)化）。

62

紫外線照射可以使DNA分子中同一條鏈相臨的兩個(gè)胸腺嘧啶堿基之間形成二聚體，這種二聚體是由兩個(gè)胸腺嘧啶堿基以共價(jià)鍵連接成環(huán)形丁烷的結(jié)構(gòu)而形成的，如右圖。其他嘧啶堿基之間也能形成類似的二聚體。但數(shù)量有限。嘧啶二聚體的形成，影響了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，使其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能均受到阻礙。細(xì)胞內(nèi)具有一系列起修復(fù)作用的酶系統(tǒng)，可以除去DNA上面的損傷，恢復(fù)DNA的正常雙螺旋結(jié)構(gòu)。目前已經(jīng)知道體內(nèi)有兩大修復(fù)系統(tǒng)，即無差錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)和有差錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)。紫外線照射可以使DNA分子中同一條鏈相臨的兩個(gè)631、無差錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)：此中修復(fù)系統(tǒng)可使受損傷的DNA完全得到修復(fù)，恢復(fù)原有的結(jié)構(gòu)和功能。主要包括光復(fù)活修復(fù)（photoreactivationrepair）和切除修復(fù)（excisionrepair）。（1）光復(fù)活修復(fù)：早在1949年即已發(fā)現(xiàn)光復(fù)活現(xiàn)象。稍后一些時(shí)間就了解到光復(fù)活的機(jī)制是可見光（大約在400nm）激活了光復(fù)活酶，它能分解由于紫外線照射而形成的嘧啶二聚體。光復(fù)活作用是一種高度專一的修復(fù)方式，它只作用于紫外線引起的DNA嘧啶二聚體。該酶在生物界分布很廣，從低等的單細(xì)胞生物到鳥類都有，而高等的哺乳類卻沒有。這說明在生物進(jìn)化過程中該作用逐漸被暗修復(fù)系統(tǒng)所取代，并丟失了這個(gè)酶。（2）切除修復(fù)：也稱為暗修復(fù)，即在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除掉，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)的過程。這是一種比較普遍的修復(fù)機(jī)制，對(duì)多種損傷均能起修復(fù)作用。參與切除修復(fù)的酶主要有：特異的核酸內(nèi)切酶、外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶。1、無差錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)：此中修復(fù)系統(tǒng)可使受損傷的DNA完全得到修64

修復(fù)過程包括四個(gè)步驟：即識(shí)別、切除、修復(fù)合成、連接（或者是識(shí)別、修復(fù)合成、切除、連接），如右圖。識(shí)別：專一性的核酸內(nèi)切酶在靠近二聚體（或其他損傷處