植物基因工程中的λ噬菌體載體課件

植物基因工程中的λ噬菌體載體2013年6月29日植物基因工程中的2013年6月29日1載體（vector）是把一個(gè)有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具。

植物基因工程技術(shù)中尤為重要的是載體，不同目的基因需要采用不同的載體。

組成植物基因工程載體系統(tǒng)常見的幾種載體有：

質(zhì)粒

λ噬菌體

柯斯質(zhì)粒(cosmid)

m13單鏈?zhǔn)删w。載體（vector）是把一個(gè)有用的目的DNA片段通過重組DN2噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的細(xì)菌病毒，結(jié)構(gòu)簡單、基因數(shù)少，是分子生物學(xué)與基因工程的良好實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。噬菌體有嚴(yán)格的宿主特異性，只寄居在易感宿主菌體內(nèi)。噬菌體具有高效率的感染性和自主復(fù)制繁殖性能，使它能高效導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能使攜帶的外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增，所以噬菌體被開發(fā)成基因工程的有用載體。噬菌體(bacteriophage，phage)簡介噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的細(xì)菌病毒，結(jié)3噬菌體分類毒性噬菌體（virulentphage）：吸附、穿入、生物合成、成熟、釋放溫和噬菌體（temperatephage）：轉(zhuǎn)導(dǎo)、溶源性轉(zhuǎn)換噬菌體溫和噬菌體可有三種存在狀態(tài)：溶菌周期的具有感染性的游離噬菌體顆粒；溶源周期的前噬菌體；宿主菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的游離噬菌體核酸。DNA重組技術(shù)一般需要λ噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)。噬菌體分類噬菌體溫和噬菌體可有三種存在狀態(tài)：溶菌周期的具有感4目前用于基因克隆的噬菌體載體及其衍生載體有：

單鏈M13噬菌體載體；

λ噬菌體載體；

P1噬菌體載體；

噬菌粒載體；

等等。

其中使用最多的是入噬菌體。

目前用于基因克隆的噬菌體載體及其衍生載體有：

單鏈M13噬5λ噬菌體λ噬菌體是溫和噬菌體，屬長尾噬菌體科，頭殼為直徑約50nm的二十面體，其內(nèi)包裹一長線狀雙鏈DNA分子（46500bp）。λ噬菌體λ噬菌體是溫和噬菌體，屬長尾噬菌體科，頭殼為直徑約56左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。

中段：從J到N長約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長所需的序列，但非溶菌生長所必需右臂：長約10kb，控制溶菌和溶原生長最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)?；蚪M長約50kb，至少包括61個(gè)基因，除少數(shù)例外，大多數(shù)編碼基因均是按功能的相似性成簇排列。左右臂包含λDNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對(duì)溶菌生長來說，中段是非必需的。左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾7在λDNA雙鏈分子的兩個(gè)5’端各有12個(gè)核苷酸單鏈的互補(bǔ)粘性末端，且兩者的核苷酸序列互補(bǔ)，當(dāng)λ噬菌體感染宿主細(xì)胞后，其DNA可迅速通過粘性末端配對(duì)而成雙鏈環(huán)狀DNA分子，這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)。cos位點(diǎn)

（cohesive

endsite）

在λDNA雙鏈分子的兩個(gè)5’端各有12個(gè)核苷酸單鏈的互補(bǔ)粘8如果將左右臂和中段都去除，僅留下λDNA而端包裝噬菌體所必需的cos序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標(biāo)志基因、多克隆位點(diǎn)等，就可構(gòu)成cos質(zhì)粒或稱為粘粒的載體。粘粒可插入45kb長的外源DNA，然后用λ噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌后，粘粒的DNA能以質(zhì)粒的形式在細(xì)菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文庫的構(gòu)建。如果將左右臂和中段都去除，僅留下λDNA而端包裝噬菌體所必需9植物基因工程中的λ噬菌體載體10當(dāng)噬菌體感染宿主細(xì)胞后,雙鏈DNA分子通過cos而成環(huán)狀。

在感染早期,環(huán)狀DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在此期間,噬菌體有兩條復(fù)制途徑可供選擇:一是裂解生長。環(huán)狀DNA分子在宿主細(xì)胞里復(fù)制若干次,合成了大量的噬菌體基因產(chǎn)物,形成子代噬菌體顆粒,成熟后使細(xì)菌裂解,釋放出許多新的有感染能力的病毒顆粒。另一是溶源性生長。噬菌體DNA整合進(jìn)宿主菌的基因組,然后像細(xì)菌染色體上的基因一樣進(jìn)行復(fù)制,并傳遞給下一代細(xì)菌。

由于噬菌體頭部包裝容量的限制，重組λ-DNA分子大小只能在39—52kb之間。當(dāng)噬菌體感染宿主細(xì)胞后,雙鏈DNA分子通過cos而成環(huán)11λ噬菌體的繁殖方式在感染的細(xì)胞內(nèi),噬菌體有兩條復(fù)制途徑:1、裂解生長2、溶源性生長DNA重組技術(shù)一般需要λ噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)。λ噬菌體的繁殖方式在感染的細(xì)胞內(nèi),噬菌體有兩條復(fù)制途徑:12植物基因工程中的λ噬菌體載體13λ噬菌體載體的構(gòu)建構(gòu)建方式：1、插入型。只具有一個(gè)限制酶位點(diǎn)，可便于外源DNA插入，這種載體叫插入型載體（insertionvectors）。2、置換型。含有二個(gè)限制酶切點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被外源DNA片段所取代。這種載體叫置換型載體（replacementvectors）。λ噬菌體載體的構(gòu)建構(gòu)建方式：14植物基因工程中的λ噬菌體載體15植物基因工程中的λ噬菌體載體16至今已用噬菌體開發(fā)出許多插入型和置換型載體

插入型載體:

ZAP,ZAP,

gt10,gt11等

置換型載體:

GEM-11,

GEM-12,EMBL3,EMBL4等至今已用噬菌體開發(fā)出許多插入型和置換型載體

插入型載體:

17構(gòu)建過程野生型λ噬菌體DNA必須經(jīng)過改造才能成為理想的載體，其構(gòu)建過程主要有：①刪除基因組中非必需區(qū)，建立外源DNA片段的替換點(diǎn)，增加承載外源DNA片段的容量。②在非必需區(qū)內(nèi)插入或替換選擇的標(biāo)記基因和目的基因。③建立重組λDNA分子的體外包裝系統(tǒng)，使之有效地感染受體細(xì)胞。簡而言之，將目的基因插入或替換進(jìn)入病毒基因組的可替代區(qū)，再利用病毒的侵染性，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，這就是病毒作為“分子運(yùn)輸車”的基本機(jī)理。

構(gòu)建過程野生型λ噬菌體DNA必須經(jīng)過改造才能成為理想的載體，18λ噬菌體載體的應(yīng)用一、建立cDNA文庫

噬菌體載體系統(tǒng)是在eDNA文庫構(gòu)建中最早使用的載體系統(tǒng)，其主要優(yōu)點(diǎn)是插入片段的裝載容量大，適合于全長的eDNA克隆，不僅質(zhì)量高、代表性好，而且重組噬菌體顆粒的感染活性在4℃環(huán)境中極其穩(wěn)定，非常適合于eDNA文庫的長期保存。

cDNA與載體重組，或經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，或不經(jīng)體外包裝直接轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，但轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率較高。λ噬菌體載體的應(yīng)用一、建立cDNA文庫19λDNA作為外源基因的克隆載體

λ基因組中間部分占30%的DNA(包括重組和溶源化基因)并不是噬菌體裂解生長所必需的，裂解生長所需的基因都在基因組的左側(cè)和右側(cè)，而典型的λ克隆載體在部分或全部非必需基因的兩側(cè)含有限制酶位點(diǎn)，這就賦予了λ載體克隆大片段的能力，外源基因插入到限制酶位點(diǎn)之間，在體外包裝成噬菌體，雖然包裝效率僅達(dá)10%，但一經(jīng)包裝，在大腸桿菌中形成噬菌斑的效率可達(dá)100%。目前由λ衍生的許多載體被廣泛地應(yīng)用于基因克隆中，尤其是在構(gòu)建基因文庫中的應(yīng)用產(chǎn)生了非常好的效果。λDNA作為外源基因的克隆載體

λ基因組中間部分占30%的20二、克隆外源目的序列

為了使外源基因能有效轉(zhuǎn)錄，將其插入λDNA的PL啟動(dòng)子或PR啟動(dòng)子的有效轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)。二、克隆外源目的序列

為了使外源基因能有效轉(zhuǎn)錄，將其插入λD21λ噬菌體載體的克隆原理和步驟（1）通過裂解過程增殖載體通過噬菌體的增殖，從中提取噬菌體DNA噬菌體載體均含有與裂解生長所必須的基因片斷，不同的載體采用不同的大腸桿菌宿主菌來增殖。經(jīng)過裂解生長獲得噬菌體顆粒，再經(jīng)過分級(jí)分離分化，可用于提取噬菌體DNA。λ噬菌體載體的克隆原理和步驟（1）通過裂解過程增殖載體22（2）載體與外源片斷的酶切插入型載體來說，載體被酶切后，很容易自身連接，一般對(duì)載體的進(jìn)行去磷酸化。置換型載體，切割后形成左臂、填充片斷、右臂，填充片斷的存在會(huì)影響連接效率，必須純化左臂和右臂。（2）載體與外源片斷的酶切23（3）外源片斷與載體的連接通過載體的粘性末端，將載體連接成多聯(lián)體，以利于將兩個(gè)cos位點(diǎn)之間的片斷裝入噬菌體顆粒（3）外源片斷與載體的連接24（4）重組噬菌體的體外包裝，形成有感染力的噬菌體顆粒利用特殊材料，制備噬菌體包裝蛋白連接產(chǎn)物與包裝蛋白混合時(shí)，就可完成包裝反應(yīng)，形成有感染力的噬菌體顆粒包裝蛋白對(duì)所包裝的DNA大小有高度選擇性，范圍：λDNA分子的75％－105％（4）重組噬菌體的體外包裝，形成有感染力的噬菌體顆粒25植物基因工程中的λ噬菌體載體26λ噬菌體的改造設(shè)計(jì)去除λDNA上的多余序列和一些限制性酶切點(diǎn)：因?yàn)棣薉NA較大，序列中的限制性酶切點(diǎn)過多，妨礙其應(yīng)用。在中段非必需區(qū)，替換或插入某些標(biāo)志基因，如上述的可供藍(lán)白篩選lacZ’序列和多克隆位點(diǎn)等。建立重組λDNA分子的體外包裝系統(tǒng)。與一般的質(zhì)粒載體不同,

噬菌體轉(zhuǎn)染前需要利用噬菌體外殼蛋白和噬菌體DNA加工酶組成的混合物(包裝抽提物)在體外將連接好的DNA線性分子包裝成噬菌體顆粒λ噬菌體的改造設(shè)計(jì)去除λDNA上的多余序列和一些限制性酶切點(diǎn)27草菇噬菌體基因文庫的構(gòu)建

(見文獻(xiàn)附件）草菇噬菌體基因文庫的構(gòu)建

(見文獻(xiàn)附件）28植物基因工程中的λ噬菌體載體2013年6月29日植物基因工程中的2013年6月29日29載體（vector）是把一個(gè)有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具。

植物基因工程技術(shù)中尤為重要的是載體，不同目的基因需要采用不同的載體。

組成植物基因工程載體系統(tǒng)常見的幾種載體有：

質(zhì)粒

λ噬菌體

柯斯質(zhì)粒(cosmid)

m13單鏈?zhǔn)删w。載體（vector）是把一個(gè)有用的目的DNA片段通過重組DN30噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的細(xì)菌病毒，結(jié)構(gòu)簡單、基因數(shù)少，是分子生物學(xué)與基因工程的良好實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。噬菌體有嚴(yán)格的宿主特異性，只寄居在易感宿主菌體內(nèi)。噬菌體具有高效率的感染性和自主復(fù)制繁殖性能，使它能高效導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能使攜帶的外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增，所以噬菌體被開發(fā)成基因工程的有用載體。噬菌體(bacteriophage，phage)簡介噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的細(xì)菌病毒，結(jié)31噬菌體分類毒性噬菌體（virulentphage）：吸附、穿入、生物合成、成熟、釋放溫和噬菌體（temperatephage）：轉(zhuǎn)導(dǎo)、溶源性轉(zhuǎn)換噬菌體溫和噬菌體可有三種存在狀態(tài)：溶菌周期的具有感染性的游離噬菌體顆粒；溶源周期的前噬菌體；宿主菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的游離噬菌體核酸。DNA重組技術(shù)一般需要λ噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)。噬菌體分類噬菌體溫和噬菌體可有三種存在狀態(tài)：溶菌周期的具有感32目前用于基因克隆的噬菌體載體及其衍生載體有：

單鏈M13噬菌體載體；

λ噬菌體載體；

P1噬菌體載體；

噬菌粒載體；

等等。

其中使用最多的是入噬菌體。

目前用于基因克隆的噬菌體載體及其衍生載體有：

單鏈M13噬33λ噬菌體λ噬菌體是溫和噬菌體，屬長尾噬菌體科，頭殼為直徑約50nm的二十面體，其內(nèi)包裹一長線狀雙鏈DNA分子（46500bp）。λ噬菌體λ噬菌體是溫和噬菌體，屬長尾噬菌體科，頭殼為直徑約534左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。

中段：從J到N長約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長所需的序列，但非溶菌生長所必需右臂：長約10kb，控制溶菌和溶原生長最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)?；蚪M長約50kb，至少包括61個(gè)基因，除少數(shù)例外，大多數(shù)編碼基因均是按功能的相似性成簇排列。左右臂包含λDNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對(duì)溶菌生長來說，中段是非必需的。左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾35在λDNA雙鏈分子的兩個(gè)5’端各有12個(gè)核苷酸單鏈的互補(bǔ)粘性末端，且兩者的核苷酸序列互補(bǔ)，當(dāng)λ噬菌體感染宿主細(xì)胞后，其DNA可迅速通過粘性末端配對(duì)而成雙鏈環(huán)狀DNA分子，這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)。cos位點(diǎn)

（cohesive

endsite）

在λDNA雙鏈分子的兩個(gè)5’端各有12個(gè)核苷酸單鏈的互補(bǔ)粘36如果將左右臂和中段都去除，僅留下λDNA而端包裝噬菌體所必需的cos序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標(biāo)志基因、多克隆位點(diǎn)等，就可構(gòu)成cos質(zhì)粒或稱為粘粒的載體。粘?？刹迦?5kb長的外源DNA，然后用λ噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌后，粘粒的DNA能以質(zhì)粒的形式在細(xì)菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文庫的構(gòu)建。如果將左右臂和中段都去除，僅留下λDNA而端包裝噬菌體所必需37植物基因工程中的λ噬菌體載體38當(dāng)噬菌體感染宿主細(xì)胞后,雙鏈DNA分子通過cos而成環(huán)狀。

在感染早期,環(huán)狀DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在此期間,噬菌體有兩條復(fù)制途徑可供選擇:一是裂解生長。環(huán)狀DNA分子在宿主細(xì)胞里復(fù)制若干次,合成了大量的噬菌體基因產(chǎn)物,形成子代噬菌體顆粒,成熟后使細(xì)菌裂解,釋放出許多新的有感染能力的病毒顆粒。另一是溶源性生長。噬菌體DNA整合進(jìn)宿主菌的基因組,然后像細(xì)菌染色體上的基因一樣進(jìn)行復(fù)制,并傳遞給下一代細(xì)菌。

由于噬菌體頭部包裝容量的限制，重組λ-DNA分子大小只能在39—52kb之間。當(dāng)噬菌體感染宿主細(xì)胞后,雙鏈DNA分子通過cos而成環(huán)39λ噬菌體的繁殖方式在感染的細(xì)胞內(nèi),噬菌體有兩條復(fù)制途徑:1、裂解生長2、溶源性生長DNA重組技術(shù)一般需要λ噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)。λ噬菌體的繁殖方式在感染的細(xì)胞內(nèi),噬菌體有兩條復(fù)制途徑:40植物基因工程中的λ噬菌體載體41λ噬菌體載體的構(gòu)建構(gòu)建方式：1、插入型。只具有一個(gè)限制酶位點(diǎn)，可便于外源DNA插入，這種載體叫插入型載體（insertionvectors）。2、置換型。含有二個(gè)限制酶切點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被外源DNA片段所取代。這種載體叫置換型載體（replacementvectors）。λ噬菌體載體的構(gòu)建構(gòu)建方式：42植物基因工程中的λ噬菌體載體43植物基因工程中的λ噬菌體載體44至今已用噬菌體開發(fā)出許多插入型和置換型載體

插入型載體:

ZAP,ZAP,

gt10,gt11等

置換型載體:

GEM-11,

GEM-12,EMBL3,EMBL4等至今已用噬菌體開發(fā)出許多插入型和置換型載體

插入型載體:

45構(gòu)建過程野生型λ噬菌體DNA必須經(jīng)過改造才能成為理想的載體，其構(gòu)建過程主要有：①刪除基因組中非必需區(qū)，建立外源DNA片段的替換點(diǎn)，增加承載外源DNA片段的容量。②在非必需區(qū)內(nèi)插入或替換選擇的標(biāo)記基因和目的基因。③建立重組λDNA分子的體外包裝系統(tǒng)，使之有效地感染受體細(xì)胞。簡而言之，將目的基因插入或替換進(jìn)入病毒基因組的可替代區(qū)，再利用病毒的侵染性，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，這就是病毒作為“分子運(yùn)輸車”的基本機(jī)理。

構(gòu)建過程野生型λ噬菌體DNA必須經(jīng)過改造才能成為理想的載體，46λ噬菌體載體的應(yīng)用一、建立cDNA文庫

噬菌體載體系統(tǒng)是在eDNA文庫構(gòu)建中最早使用的載體系統(tǒng)，其主要優(yōu)點(diǎn)是插入片段的裝載容量大，適合于全長的eDNA克隆，不僅質(zhì)量高、代表性好，而且重組噬菌體顆粒的感染活性在4℃環(huán)境中極其穩(wěn)定，非常適合于eDNA文庫的長期保存。

cDNA與載體重組，或經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，或不經(jīng)體外包裝直接轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，但轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率較高。λ噬菌體載體的應(yīng)用一、建立cDNA文庫47λDNA作為外源基因的克隆載體

λ基因組中間部分占30%的DNA(包括重組和溶源化基因)并不是噬菌體裂解生長所必需的，裂解生長所需的基因都在基因組的左側(cè)和右側(cè)，而典型的λ克隆載體在部分或全部非必需基因的兩側(cè)含有限制酶位點(diǎn)，這就賦予了λ載體克隆大片段的能力，外源基因插入到限制酶位點(diǎn)之間，在體外包裝成噬菌體，雖然包裝效率僅達(dá)10%，但一經(jīng)包裝，在大腸桿菌中形成噬菌斑的效率可達(dá)100%。目前由λ衍生的許多載體被廣泛地應(yīng)用于基因克隆中，尤其是在構(gòu)建基因文庫中的應(yīng)用產(chǎn)生了非常好的效果。λDNA作為外源基因的克隆載體

λ基因組中間部分占30%的48二、克隆外源目的序列

為了使外源基因能有效轉(zhuǎn)錄，將其插入λDNA的PL啟動(dòng)子或PR啟動(dòng)子的有效轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)。二、克隆外源目的序列

為了使外源基因能有效轉(zhuǎn)錄，將其插入λD49λ噬菌體載體的克隆原理和步驟（1）通過裂解過程