高效液相色譜分析課件

高效液相色譜的使用及其維護(hù)高效液相色譜的使用及其維護(hù)一液相色譜的發(fā)展史

早在古羅馬時(shí)期，人們就已經(jīng)知道將一滴含有混合色素的溶液滴在一塊布或一張紙上，并通過(guò)觀察溶液的展開(kāi)產(chǎn)生的一個(gè)個(gè)同心圓來(lái)分析染料和色素。100多年前，德國(guó)化學(xué)家就對(duì)古羅馬的這種方法做了改進(jìn)，后來(lái)就發(fā)展成為今天的紙上色譜技術(shù)。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，到1941年就有人采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動(dòng)相分離乙?；被?，這成為分配色譜的首次應(yīng)用。

1960年代末科克蘭、哈伯、荷瓦斯、里普斯克等人開(kāi)發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開(kāi)啟了高效液相色譜的時(shí)代。1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書(shū)，標(biāo)志著高效液相色譜法

(HPLC)正式建立。在此后的時(shí)間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測(cè)手段，在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)與檢測(cè)、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。一液相色譜的發(fā)展史早在古羅馬時(shí)期二HPLC的原理及特點(diǎn)

色譜法是利用物質(zhì)在兩相中吸附或分配系數(shù)的微小差異達(dá)到分離的目的。當(dāng)兩相做相對(duì)移動(dòng)時(shí)，被測(cè)物質(zhì)在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配，這樣使原來(lái)微小的分配差異產(chǎn)生了很大的效果，達(dá)到分離、分析及測(cè)定一些物理化學(xué)常數(shù)的目的。

必要條件：不同組分性質(zhì)上的微小差別；

充分條件：不同組分在兩相之間進(jìn)行的上千次或上百萬(wàn)次質(zhì)量交換。HPLC是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。

二HPLC的原理及特點(diǎn)色二HPLC的原理及特點(diǎn)

特點(diǎn)

高壓

高速

高效

高靈敏度

適應(yīng)范圍寬而與氣象色譜相比，其最大得特點(diǎn)是可以分離不可揮發(fā)而具有一定溶解性的物質(zhì)或受熱后不穩(wěn)定的物質(zhì)二HPLC的原理及特點(diǎn)特點(diǎn)三液相色譜的分類按固定相形態(tài)分類按作用原理分離按物理特征分類固定相名稱原理名稱特征名稱液體液液色譜分配液液分配色譜平面狀固定相平面色譜固體液固色譜吸附液固吸附色譜紙固定相紙色譜分子大小凝膠或尺寸排阻色譜薄層固定相薄層色譜離子交換能力離子交換色譜顆粒固定相填充填充色譜親和力親和色譜色譜柱中空空心柱色譜電滲及電泳淌度電泳流動(dòng)相采用高壓液體高壓液相色譜三液相色譜的分類按固定相形態(tài)分類按作用原理分離按物理特征四固定相

液固色譜的固定相一般為硅膠、氧化鋁等吸附劑。

溶質(zhì)在柱中吸附劑上不斷進(jìn)行吸附-解吸循環(huán)，由于不同的被測(cè)物在吸附劑上吸附作用的差異而獲得分離。溶質(zhì)所帶官能團(tuán)的性質(zhì)是決定其吸附作用的主要因素，若溶質(zhì)分子官能團(tuán)的極性增強(qiáng)或數(shù)目增多，在使用極性吸附劑時(shí)，分子和極性吸附劑的總的相互作用加強(qiáng)，其相對(duì)吸附作用也增強(qiáng)，保留時(shí)間加長(zhǎng)。四固定相而目前在高效液相色譜的應(yīng)用中，有80%以上是化學(xué)鍵合固定相的色譜。

化學(xué)鍵合相是利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到擔(dān)體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的。一般用硅膠作擔(dān)體，采用鍵合反應(yīng)有酯化鍵合（Si-O-C）、硅烷化鍵合（Si-O-Si-C）和硅氮鍵合（Si-N）。

正相鍵合色譜最常用的是鍵合氰基、氨基、二醇基等極性基團(tuán)的鍵合相，采用極性固定相、非極性或弱極性流動(dòng)相，適合于中等極性樣品的分離。

反相鍵合色譜的固定相是非極性，通常擁有疏水的十八硅烷（ODS）或辛烷官能團(tuán)。如鍵合C2，C4，C6，C8，C16，

C18，C22烷基和苯基等非極性基團(tuán)的固定相。

而目前在高效液相色譜的應(yīng)用中，有8五流動(dòng)相流動(dòng)相對(duì)樣品有一定的溶解能力，保證組分不會(huì)沉淀在柱中或長(zhǎng)

時(shí)間保留在柱中；溶劑要有一定的化學(xué)穩(wěn)定性,不與固定相和樣品組分起反應(yīng)；溶劑的粘度要低，以便得到好的分離效果；降低柱壓，延長(zhǎng)泵的使用壽命；溶劑應(yīng)與檢測(cè)器兼容性好，不影響檢測(cè)器正常工作；樣品易于回收、易于得到純品、毒性低等特征；保證該色譜系統(tǒng)的分離過(guò)程可重復(fù)進(jìn)行；溶劑的沸點(diǎn)低，有利于制備色譜的樣品回收，但不宜過(guò)低，否則易產(chǎn)生氣泡。從實(shí)用角度考慮，溶劑應(yīng)當(dāng)價(jià)格低廉，容易購(gòu)得，使用安全。

五流動(dòng)相

正相色譜中，流動(dòng)相與固定相間的相互作用越強(qiáng)，溶質(zhì)吸附就越弱，反之亦然。也就是說(shuō)流動(dòng)相強(qiáng)度增大，洗脫能力增強(qiáng)。一般采用乙烷、庚烷、異辛烷、苯和二甲苯等有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相，有時(shí)還加入一定量的四氫呋喃等極性溶劑，即采用多元流動(dòng)相的分離模式。

反相色譜中，常用洗脫劑有水、乙腈、甲醇和四氫呋喃等。洗脫強(qiáng)度的強(qiáng)弱順序?yàn)椋核?lt;甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷。溶劑的極性隨溶劑強(qiáng)度的增加而降低。

正相色譜中，流動(dòng)相與固定相間的相互作用越強(qiáng)，溶六液相色譜柱

色譜柱的構(gòu)造

高效液相色譜柱通常用能耐80MPa(816atm)，內(nèi)徑均勻的優(yōu)質(zhì)不銹鋼制成，包括柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板、接頭、螺絲等。

色譜柱的類型：分析型和制備型常規(guī)分析柱(常量柱)，內(nèi)徑2-5mm(常用4.6mm，國(guó)內(nèi)有4mm和5mm)，長(zhǎng)度200-250mm，填料通常為3-10μm。窄徑柱，又稱細(xì)管徑柱、半微柱，內(nèi)徑1-2mm,柱長(zhǎng)10-20cm;毛細(xì)管柱(又稱微柱)，內(nèi)徑0.2-0.5mm；半制備柱，內(nèi)徑>5mm；實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20-40rnm，柱長(zhǎng)10-30cm;生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長(zhǎng)、填料粒徑和折合流速來(lái)確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。

六液相色譜柱色譜柱的構(gòu)造

色譜柱的維護(hù)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩；進(jìn)樣前檢查色譜系統(tǒng)的各個(gè)接頭看是否有漏液現(xiàn)象；不要把柱接頭上得太緊，以免損壞接頭螺紋；一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效；柱子不應(yīng)放在有氣流和陽(yáng)光照射的地方，氣流和陽(yáng)光都會(huì)使柱子產(chǎn)生溫度梯度而造成基線漂移；不要使其碰撞，以免柱床因震動(dòng)產(chǎn)生空隙或通道。色譜柱的維護(hù)反相色譜柱應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇來(lái)保存，通常用20倍柱體積（50-60ml）沖洗。柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間；柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5-30mm），可以起到保護(hù)、延長(zhǎng)柱壽命的作用。反相色譜柱應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇來(lái)保存，通常用20倍柱體六HPLC的使用與維護(hù)流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細(xì)的膜過(guò)濾)。

流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。使用緩沖鹽溶液為流動(dòng)相時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，以免鹽類堵塞柱子與管路；然

后用甲醇沖洗40分鐘以上，以充分沖洗柱子。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間；對(duì)于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水緩慢沖洗20ml以上。不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液長(zhǎng)時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用甲醇等有機(jī)溶劑，因?yàn)榧兯组L(zhǎng)霉。

六HPLC的使用與維護(hù)流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器，再以水清洗。C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。堵塞導(dǎo)致壓力太大，按柱子→預(yù)柱→混合器中的過(guò)濾器→管路過(guò)濾器→單向閥檢查并清洗。要注意柱子的PH值范圍（2-8），不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。更換流動(dòng)相時(shí)要先將流速降到零，不要在有流速的狀態(tài)下將濾頭置于空氣中；另外更換時(shí)應(yīng)先將濾頭部分沖洗或放入燒杯中邊振動(dòng)邊清洗，然后插入新的

流動(dòng)相中。更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下。高效液相色譜分析課件每次開(kāi)機(jī)時(shí)，流速與柱壓要逐漸增加。尤其是用兩種流動(dòng)相時(shí)，可以考慮在低于預(yù)設(shè)流速的狀態(tài)下平衡一段時(shí)間，因?yàn)閮上嗷旌蠒?huì)有一個(gè)高壓，直接升到較高流速，泵會(huì)因壓力過(guò)高而停止運(yùn)行。每次開(kāi)機(jī)時(shí)可以先沖洗一下管路或柱前部分，除去上次使用殘留在管路中的流動(dòng)相，這樣可以防止殘留液對(duì)柱子的污染，還可縮短平衡基線的時(shí)間。如果管路中有氣泡要先用注射器抽除，以免氣泡進(jìn)入泵或柱子中。進(jìn)樣閥在進(jìn)樣過(guò)程中，必須是非常清潔的，否則得不到較好的結(jié)果。

在沖洗管路時(shí)進(jìn)樣閥切換到進(jìn)樣位置后，在此位置保持一段時(shí)間，使流動(dòng)相充分沖洗樣品定量管，這樣可以保證有較高的精確度，而且不用另外再?zèng)_洗樣品定量管每次開(kāi)機(jī)時(shí)，流速與柱壓要逐漸增加。尤其是用兩種流動(dòng)相時(shí)，可以七HPLC的使用常見(jiàn)問(wèn)題

柱壓過(guò)高，可能是流速定位過(guò)高、泵出口過(guò)濾器堵塞、柱頭雜質(zhì)堵塞或柱前過(guò)濾塞堵塞，應(yīng)逐一檢查確定堵塞的地方，再?zèng)_洗，有時(shí)需拆下過(guò)濾器超聲清洗。

柱壓波動(dòng)，泵或柱中有氣泡、高壓系統(tǒng)有泄漏或單向閥被污染，部分堵塞。檢查是否泄漏、單向閥是否有問(wèn)題，若有則應(yīng)及時(shí)清洗或更換單向閥。若有氣泡，就purge10到15分鐘。

泵不吸液，可能是泵中有氣泡、流動(dòng)相濾頭被污染或單向閥堵塞

，使用注射器吸液，通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。若不行就通過(guò)排除氣泡和清洗濾篩來(lái)解決問(wèn)題。

進(jìn)樣后不出峰，可能檢測(cè)器選擇不當(dāng)、試液濃度太低、檢測(cè)器到記錄儀之間輸入信號(hào)斷開(kāi)或樣品未能進(jìn)入進(jìn)樣閥。

七HPLC的使用常見(jiàn)問(wèn)題柱壓過(guò)高，可能是流速定位過(guò)高、

出現(xiàn)負(fù)峰，用示差檢測(cè)器時(shí)，樣品的折光指數(shù)小于流動(dòng)相溶劑的折光指數(shù)；或流動(dòng)相不純凈；用UV檢測(cè)器時(shí)，溶解樣品的溶劑與流動(dòng)相溶劑不能互溶或PH值不同，當(dāng)光在兩種互不相溶的溶劑界面產(chǎn)生折射，從而使光電池受到不同強(qiáng)度的光，光強(qiáng)度減弱，以至于低于參比而出現(xiàn)負(fù)峰。

樣品前處理，最好使用流動(dòng)相溶解樣品，用0.45μm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)；進(jìn)樣前清洗進(jìn)樣針和進(jìn)樣閥。

剩余流動(dòng)相的處理，有機(jī)相要是高純的，用完了剩下的密封起來(lái)就行了，時(shí)間不限；水相或者緩沖鹽的，最多放48小時(shí)，再用不完就應(yīng)廢棄；有機(jī)相和水相混合的有機(jī)相超過(guò)50％的用剩下的可以4度保持，但最多一周。此外，流動(dòng)相一定要貼標(biāo)簽注明出現(xiàn)負(fù)峰，用示差檢測(cè)器時(shí)，樣品的折光指數(shù)小于流動(dòng)相溶劑的感謝您的關(guān)注感謝您的關(guān)注高效液相色譜的使用及其維護(hù)高效液相色譜的使用及其維護(hù)一液相色譜的發(fā)展史

早在古羅馬時(shí)期，人們就已經(jīng)知道將一滴含有混合色素的溶液滴在一塊布或一張紙上，并通過(guò)觀察溶液的展開(kāi)產(chǎn)生的一個(gè)個(gè)同心圓來(lái)分析染料和色素。100多年前，德國(guó)化學(xué)家就對(duì)古羅馬的這種方法做了改進(jìn)，后來(lái)就發(fā)展成為今天的紙上色譜技術(shù)。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，到1941年就有人采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動(dòng)相分離乙?；被幔@成為分配色譜的首次應(yīng)用。

1960年代末科克蘭、哈伯、荷瓦斯、里普斯克等人開(kāi)發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開(kāi)啟了高效液相色譜的時(shí)代。1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書(shū)，標(biāo)志著高效液相色譜法

(HPLC)正式建立。在此后的時(shí)間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測(cè)手段，在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)與檢測(cè)、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。一液相色譜的發(fā)展史早在古羅馬時(shí)期二HPLC的原理及特點(diǎn)

色譜法是利用物質(zhì)在兩相中吸附或分配系數(shù)的微小差異達(dá)到分離的目的。當(dāng)兩相做相對(duì)移動(dòng)時(shí)，被測(cè)物質(zhì)在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配，這樣使原來(lái)微小的分配差異產(chǎn)生了很大的效果，達(dá)到分離、分析及測(cè)定一些物理化學(xué)常數(shù)的目的。

必要條件：不同組分性質(zhì)上的微小差別；

充分條件：不同組分在兩相之間進(jìn)行的上千次或上百萬(wàn)次質(zhì)量交換。HPLC是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。

二HPLC的原理及特點(diǎn)色二HPLC的原理及特點(diǎn)

特點(diǎn)

高壓

高速

高效

高靈敏度

適應(yīng)范圍寬而與氣象色譜相比，其最大得特點(diǎn)是可以分離不可揮發(fā)而具有一定溶解性的物質(zhì)或受熱后不穩(wěn)定的物質(zhì)二HPLC的原理及特點(diǎn)特點(diǎn)三液相色譜的分類按固定相形態(tài)分類按作用原理分離按物理特征分類固定相名稱原理名稱特征名稱液體液液色譜分配液液分配色譜平面狀固定相平面色譜固體液固色譜吸附液固吸附色譜紙固定相紙色譜分子大小凝膠或尺寸排阻色譜薄層固定相薄層色譜離子交換能力離子交換色譜顆粒固定相填充填充色譜親和力親和色譜色譜柱中空空心柱色譜電滲及電泳淌度電泳流動(dòng)相采用高壓液體高壓液相色譜三液相色譜的分類按固定相形態(tài)分類按作用原理分離按物理特征四固定相

液固色譜的固定相一般為硅膠、氧化鋁等吸附劑。

溶質(zhì)在柱中吸附劑上不斷進(jìn)行吸附-解吸循環(huán)，由于不同的被測(cè)物在吸附劑上吸附作用的差異而獲得分離。溶質(zhì)所帶官能團(tuán)的性質(zhì)是決定其吸附作用的主要因素，若溶質(zhì)分子官能團(tuán)的極性增強(qiáng)或數(shù)目增多，在使用極性吸附劑時(shí)，分子和極性吸附劑的總的相互作用加強(qiáng)，其相對(duì)吸附作用也增強(qiáng)，保留時(shí)間加長(zhǎng)。四固定相而目前在高效液相色譜的應(yīng)用中，有80%以上是化學(xué)鍵合固定相的色譜。

化學(xué)鍵合相是利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到擔(dān)體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的。一般用硅膠作擔(dān)體，采用鍵合反應(yīng)有酯化鍵合（Si-O-C）、硅烷化鍵合（Si-O-Si-C）和硅氮鍵合（Si-N）。

正相鍵合色譜最常用的是鍵合氰基、氨基、二醇基等極性基團(tuán)的鍵合相，采用極性固定相、非極性或弱極性流動(dòng)相，適合于中等極性樣品的分離。

反相鍵合色譜的固定相是非極性，通常擁有疏水的十八硅烷（ODS）或辛烷官能團(tuán)。如鍵合C2，C4，C6，C8，C16，

C18，C22烷基和苯基等非極性基團(tuán)的固定相。

而目前在高效液相色譜的應(yīng)用中，有8五流動(dòng)相流動(dòng)相對(duì)樣品有一定的溶解能力，保證組分不會(huì)沉淀在柱中或長(zhǎng)

時(shí)間保留在柱中；溶劑要有一定的化學(xué)穩(wěn)定性,不與固定相和樣品組分起反應(yīng)；溶劑的粘度要低，以便得到好的分離效果；降低柱壓，延長(zhǎng)泵的使用壽命；溶劑應(yīng)與檢測(cè)器兼容性好，不影響檢測(cè)器正常工作；樣品易于回收、易于得到純品、毒性低等特征；保證該色譜系統(tǒng)的分離過(guò)程可重復(fù)進(jìn)行；溶劑的沸點(diǎn)低，有利于制備色譜的樣品回收，但不宜過(guò)低，否則易產(chǎn)生氣泡。從實(shí)用角度考慮，溶劑應(yīng)當(dāng)價(jià)格低廉，容易購(gòu)得，使用安全。

五流動(dòng)相

正相色譜中，流動(dòng)相與固定相間的相互作用越強(qiáng)，溶質(zhì)吸附就越弱，反之亦然。也就是說(shuō)流動(dòng)相強(qiáng)度增大，洗脫能力增強(qiáng)。一般采用乙烷、庚烷、異辛烷、苯和二甲苯等有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相，有時(shí)還加入一定量的四氫呋喃等極性溶劑，即采用多元流動(dòng)相的分離模式。

反相色譜中，常用洗脫劑有水、乙腈、甲醇和四氫呋喃等。洗脫強(qiáng)度的強(qiáng)弱順序?yàn)椋核?lt;甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷。溶劑的極性隨溶劑強(qiáng)度的增加而降低。

正相色譜中，流動(dòng)相與固定相間的相互作用越強(qiáng)，溶六液相色譜柱

色譜柱的構(gòu)造

高效液相色譜柱通常用能耐80MPa(816atm)，內(nèi)徑均勻的優(yōu)質(zhì)不銹鋼制成，包括柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板、接頭、螺絲等。

色譜柱的類型：分析型和制備型常規(guī)分析柱(常量柱)，內(nèi)徑2-5mm(常用4.6mm，國(guó)內(nèi)有4mm和5mm)，長(zhǎng)度200-250mm，填料通常為3-10μm。窄徑柱，又稱細(xì)管徑柱、半微柱，內(nèi)徑1-2mm,柱長(zhǎng)10-20cm;毛細(xì)管柱(又稱微柱)，內(nèi)徑0.2-0.5mm；半制備柱，內(nèi)徑>5mm；實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20-40rnm，柱長(zhǎng)10-30cm;生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長(zhǎng)、填料粒徑和折合流速來(lái)確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。

六液相色譜柱色譜柱的構(gòu)造

色譜柱的維護(hù)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩；進(jìn)樣前檢查色譜系統(tǒng)的各個(gè)接頭看是否有漏液現(xiàn)象；不要把柱接頭上得太緊，以免損壞接頭螺紋；一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效；柱子不應(yīng)放在有氣流和陽(yáng)光照射的地方，氣流和陽(yáng)光都會(huì)使柱子產(chǎn)生溫度梯度而造成基線漂移；不要使其碰撞，以免柱床因震動(dòng)產(chǎn)生空隙或通道。色譜柱的維護(hù)反相色譜柱應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇來(lái)保存，通常用20倍柱體積（50-60ml）沖洗。柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間；柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5-30mm），可以起到保護(hù)、延長(zhǎng)柱壽命的作用。反相色譜柱應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇來(lái)保存，通常用20倍柱體六HPLC的使用與維護(hù)流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細(xì)的膜過(guò)濾)。

流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。使用緩沖鹽溶液為流動(dòng)相時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，以免鹽類堵塞柱子與管路；然

后用甲醇沖洗40分鐘以上，以充分沖洗柱子。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間；對(duì)于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水緩慢沖洗20ml以上。不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液長(zhǎng)時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用甲醇等有機(jī)溶劑，因?yàn)榧兯组L(zhǎng)霉。

六HPLC的使用與維護(hù)流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器，再以水清洗。C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。堵塞導(dǎo)致壓力太大，按柱子→預(yù)柱→混合器中的過(guò)濾器→管路過(guò)濾器→單向閥檢查并清洗。要注意柱子的PH值范圍（2-8），不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。更換流動(dòng)相時(shí)要先將流速降到零，不要在有流速的狀態(tài)下將濾頭置于空氣中；另外更換時(shí)應(yīng)先將濾頭部分沖洗或放入燒杯中邊振動(dòng)邊清洗，然后插入新的

流動(dòng)相中。更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下。高效液相色譜分析課件每次開(kāi)機(jī)時(shí)，流速與柱壓要逐漸增加。尤其是用兩種流動(dòng)相時(shí)，可以考慮在低于預(yù)設(shè)流速