海濱木巴戟種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

T/CSMAXXXX－2018海濱木巴戟種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了海濱木巴戟[MorindacitrifoliaL.]種子超低溫保存過程中的術(shù)語和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于海濱木巴戟種子的超低溫長期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程水分測定GB/T3543.7農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程其他項目檢驗術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。海濱木巴戟MorindacitrifoliaL.為茜草科（Rubiaceae）巴戟天屬（Morinda）灌木或小喬木，也稱海巴戟、海巴戟天，生于熱帶地區(qū)海濱平地和疏林中，樹冠幽雅，XX亞常種于庭園。果實可食，其果實、葉子、枝干、根部均可入藥，具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲、鎮(zhèn)痛、降壓、消炎和提高免疫力的作用。全株含蒽醌類化合物，波利尼西亞將其應(yīng)用于醫(yī)藥已有2000多年的歷史。收載于《世界藥用植物速查辭典（2015）》。海濱木巴戟果實MorindacitrifoliaL.fruits聚合果漿果狀，長卵形或球形，徑約2.5cm；幼時綠色，熟時白色或黃色。有時最下部的小核果的宿存花萼擴大成葉狀，核果卵形，扁平，邊緣具翅；二室，上側(cè)室大而空，下側(cè)室狹，具1種子。海濱木巴戟種子MorindacitrifoliaL.seed海濱木巴戟的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子黑褐色，長圓形，小，扁，下部有翅；胚直，胚根下位，子葉長圓形；胚乳豐富，質(zhì)脆。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過前處理的海濱木巴戟種子置于液氮（-196℃）中保存。種子的選擇果實采收花果期全年，全果變奶黃或金黃色時，即可時采收，去除果肉，取出種子。種子選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、健康的種子，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r間不超過2個月）。種子前處理生活力檢測參照《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》中的溴麝香草酚藍(lán)（BTB）法測定種子生活力。待測種子在30℃~35℃溫水中浸種2h，隨后取吸脹種子50粒，整齊地埋于備好的瓊脂凝膠中，注意要將胚埋入凝膠中。將培養(yǎng)皿置于35℃溫箱中5h后觀察結(jié)果。生活力計算在光下用放大鏡對染色結(jié)果進行觀察鑒定。凡種胚周圍出現(xiàn)黃色暈圈的種子為有活力的種子，否則為無活力的種子。計算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的海濱木巴戟種子生活力應(yīng)≥90%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹海濱木巴戟種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為19000:1，室溫條件下干燥處理1~5h，在干燥過程中定期測定種子含水量，將種子含水量由18%~25%降至10%~15%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量海濱木巴戟種子保存量不少于350粒，以便后期的活力檢測使用。種子冷凍方式海濱木巴戟種子超低溫保存的冷凍方式為直接冷凍法，即將待保存的海濱木巴戟種子放入5mL凍存管（每管50粒種子）中，迅速投入液氮中保存?；謴?fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出1個凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍2min。凍后種子生活力檢測取出25粒解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測方法，進行超低溫保存后的初始生活力檢測。當(dāng)種子生活力≥60%時視為保存成功。恢復(fù)培養(yǎng)將剩下25粒解凍后的海濱木巴戟種子，經(jīng)50℃熱水浸泡8h后，播種到帶有無菌濾紙的帶蓋發(fā)芽盒中，溫度28℃~35℃，濕度70%~85%條件下培養(yǎng)。附錄BTB的配制和保存方法精密稱取BTB0.5g，溶解于煮沸過的500mL純水中。濾液若呈黃色，可加數(shù)滴氫氧化鈉溶液，使之變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)綠色，隨后加入3.5g瓊脂溶解，稍稍冷卻即可趁熱倒入9cm培養(yǎng)皿中，使之成一均勻的薄層，完全冷卻后備用。參考文獻[1]肖培根，劉昌孝，江紀(jì)武等.世界藥用植物速查辭典[M].中國醫(yī)藥科技出版社.2015[2]中國科學(xué)院中國植物志委員會.中國植物志.第71（2）卷[M].科學(xué)出版社，2004（1999）：182[3]ChenTao，ZhuHua，ChenChia-jui.Rubiaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2011.19:220-230.[4]ReedBM.PlantCryopreservation?APracticalGuide[M].Springer，2010:3[5]張志強，李永成.海巴戟天