細(xì)菌性食物中毒的快速檢驗(yàn)課件

12/18/20221細(xì)菌性食物中毒的快速檢驗(yàn)平山縣疾控中心

12/14/20221細(xì)菌性食物中毒的快速檢驗(yàn)平山縣疾控中心12/18/20222定義食源性疾病世界衛(wèi)生組織將食源性疾病定義為“凡是通過攝食而進(jìn)入人體的病原體，使人體患感染性或中毒性疾病，統(tǒng)稱為食源性疾病”

12/14/20222定義食源性疾病12/18/20223定義食物中毒食物中毒是指人攝人了含有生物性、化學(xué)性有毒有害物質(zhì)后或把有毒有害物質(zhì)當(dāng)作食物攝入后所出現(xiàn)的而非傳染性的急性或亞急性疾病，屬于食源性疾病的范疇。食物中毒既不包括因暴飲暴食而引起的急性胃腸炎、食源性腸道傳染病(如傷寒)和寄生蟲病(如囊蟲病)，也不包括因一次大量或者長(zhǎng)期少量攝入某些有毒有害物質(zhì)而引起的以慢性毒性為主要特征(如致畸、致癌、致突變)的疾病。

12/14/20223定義食物中毒12/18/20224

食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)主要以流行病學(xué)調(diào)查資料及病人的潛伏期和中毒的特有表現(xiàn)為依據(jù)，實(shí)驗(yàn)室診斷是為了確定中毒的病因而進(jìn)行的。食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)及技術(shù)處理總則GB14938-1994

12/14/20224食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)主12/18/20225中毒特征名稱常見食物潛伏期病程主要癥狀重點(diǎn)采集標(biāo)本沙門氏菌肉蛋類4-48h3-7d惡心嘔吐腹痛腹瀉發(fā)熱38-40℃便食品血副溶血弧菌水產(chǎn)品3-24h1-3d嘔吐發(fā)熱腹痛以上腹部為主水樣便腹瀉便食品變形桿菌肉蛋及水產(chǎn)品5-18h1-3d惡心嘔吐腹痛腹瀉發(fā)熱38℃左右食品便致瀉性大腸涼拌菜4-44h1-3d嘔吐腹痛腹瀉水樣便或粘液便發(fā)熱<39℃便食品蠟樣芽孢桿菌米飯、肉、乳嘔吐型0.5-5h腹瀉型8-16h1d惡心嘔吐為主腹痛腹瀉為主食品嘔吐物葡萄球菌肉、乳、蛋2-4h1-2d惡心頻繁劇烈嘔吐腹痛腹瀉食品嘔吐物糞鏈球菌肉、乳、蛋、冷凍食品5-10h1-2d惡心嘔吐腹痛腹瀉食品嘔吐物糞便肉毒梭菌罐頭、腌制品1-7d2-20d吞咽困難復(fù)視失音呼吸困難食品嘔吐物血液12/14/20225中毒特征常見食物潛伏期病程主要癥狀重點(diǎn)12/18/20226細(xì)菌性食物中毒檢驗(yàn)采集樣品檢驗(yàn)程序直接涂片、染色、鏡檢→活菌數(shù)測(cè)定→選擇適當(dāng)?shù)脑鼍丸b別培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)→生化鑒定→血清學(xué)鑒定→毒素測(cè)定。12/14/20226細(xì)菌性食物中毒檢驗(yàn)采集樣品12/18/20227酶聯(lián)熒光免疫分析法此E.coliO157:H7的抗原鑒別是基于在VIDAS儀器內(nèi)進(jìn)行的酶聯(lián)熒光免疫分析。像吸液管的裝置是固相容器（SPR），在分析中既作為固相也作為吸液器。SPR包被有高特異的單克隆抗體混合物。將一定量的增菌肉湯加入試劑條，肉湯中的混合物在特定時(shí)間內(nèi)循環(huán)于SPR內(nèi)外。如果有E.coliO157:H7抗原存在則與包被在SPR內(nèi)的單克隆抗體結(jié)合，其他沒有結(jié)合上的化合物被沖洗掉。結(jié)合有堿性磷酸酶的抗體在SPR內(nèi)外循環(huán)與結(jié)合在SPR內(nèi)壁上的E.coliO157:H7抗原結(jié)合，最后的沖洗步驟將沒有結(jié)合的接合劑沖洗掉。底物—4-甲基傘形磷酸酮被SPR壁上的酶轉(zhuǎn)換成熒光產(chǎn)物—4-甲基傘形酮。熒光強(qiáng)度由光學(xué)掃描器測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析，產(chǎn)生基于熒光測(cè)試的試驗(yàn)值與標(biāo)準(zhǔn)相比較后打印出每一個(gè)被測(cè)樣品的陽(yáng)性或陰性結(jié)果報(bào)告。12/14/20227酶聯(lián)熒光免疫分析法此E.coliO112/18/20228分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)是在體外酶促擴(kuò)增特定DNA或RNA片段的技術(shù)由變性Templatedenaturation退火Primerannealing延伸Primerextension

三個(gè)基本步驟構(gòu)成12/14/20228分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)12/18/20229體系組成一段長(zhǎng)的雙鏈DNA，是待擴(kuò)增的目的片段，作為擴(kuò)增反應(yīng)的原始模板(template)兩段單鏈寡核苷酸，其序列與待擴(kuò)增片段的兩端相同，作為反應(yīng)的引物(primer)有四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）作為合成DNA的原料有DNA聚合酶(polymerase)，催化DNA的合成有合適的鹽、緩沖液以及溫度循環(huán)參數(shù)，以提供酶促反應(yīng)的最佳條件并保證反應(yīng)的產(chǎn)量。12/14/20229體系組成一段長(zhǎng)的雙鏈DNA，是待擴(kuò)增12/18/202210

12/14/20221012/18/20221112/14/20221112/18/20221212/14/20221212/18/20221312/14/20221312/18/20221412/14/20221412/18/20221512/14/20221512/18/202216在PCR體系中，相對(duì)于模板DNA，引物大量過剩，模板變性后退火時(shí)，它們以3’末端相對(duì)分別結(jié)合于模板DNA的兩條互補(bǔ)鏈上，在DNA聚合酶催化下，合成新的、引物對(duì)之間的DNA片段。在第一個(gè)循環(huán)中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，從引物3'端開始延伸，其5'端是固定的，3’端則沒有固定的止點(diǎn)，隨延伸時(shí)間的增加而增長(zhǎng)，因此該循環(huán)的產(chǎn)物長(zhǎng)度是不定的；12/14/202216在PCR體系中，相對(duì)于模板DNA，引12/18/202217二、PCR技術(shù)的特點(diǎn)高特異性：PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：①以堿基配對(duì)原則使引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；②DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；③靶基因的特異性與保守性12/14/202217二、PCR技術(shù)的特點(diǎn)高特異性：PCR12/18/202218高靈敏度：PCR產(chǎn)物量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在細(xì)菌的檢測(cè)中，最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)PFU(空斑形成單位)。12/14/202218高靈敏度：PCR產(chǎn)物量是以指數(shù)方式增12/18/202219PCR反應(yīng)五要素的優(yōu)化1、多聚核苷酸引物2、TaqDNA聚合酶3、dNTP（三磷酸脫氧核苷酸）4、模板核酸5、緩沖液12/14/202219PCR反應(yīng)五要素的優(yōu)化1、多聚核苷酸12/18/202220其它因素對(duì)PCR的影響1、PCR反應(yīng)的總體積2、PCR反應(yīng)的促進(jìn)劑通過加入某些物質(zhì)穩(wěn)定酶活性或有利于DNA的變性與復(fù)性，以提高擴(kuò)增效率和反應(yīng)的特異性。12/14/202220其它因素對(duì)PCR的影響1、PCR反應(yīng)12/18/202221穩(wěn)定酶活性的有牛血清白蛋白、0.01%明膠、0.05~0.1%Tween-20及5mmol/L二巰基蘇糖醇（DTT），但應(yīng)注意使用濃度不應(yīng)過高，只有牛血清白蛋白的濃度可高達(dá)800μg/ml，而對(duì)酶活性仍無(wú)抑制。5~10%的二甲基亞砜有利于DNA變性，5~10%的甘油有利于DNA復(fù)性。12/14/202221穩(wěn)定酶活性的有牛血清白蛋白、0.0112/18/202222注意事項(xiàng)減少非特異性擴(kuò)增及交叉污染①將反應(yīng)管及各試劑置于冰上，以防引物與模板的非特異性結(jié)合后產(chǎn)生擴(kuò)增；②注意使用防止產(chǎn)生氣溶膠的加樣頭，以避免交叉污染；③最好先加入反應(yīng)所需無(wú)菌水，再依次加入各成分，最后加入聚合酶及模板。12/14/202222注意事項(xiàng)減少非特異性擴(kuò)增及交叉污染12/18/202223PCR產(chǎn)物的檢測(cè)分析凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳——

聚丙烯酰胺凝膠電泳——區(qū)分小于300b的DNA片段

12/14/202223PCR產(chǎn)物的檢測(cè)分析凝膠電泳：12/18/202224瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～32.00.1～212/14/202224瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分12/18/202225電泳緩沖液：常用的電泳緩沖液有三種，即Tris-硼酸(TBETris-boricacid-EDTA)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE)

EDTA可螯合二價(jià)陽(yáng)離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被降解12/14/202225電泳緩沖液：常用的電泳緩沖液有三種，12/18/202226樣品緩沖液便于觀察——溴酚蘭在堿性溶液中呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，其遷移率分別與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段相似；二甲苯腈在該溶液中呈蘭色，其在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時(shí)，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA相近減少擴(kuò)散——蔗糖或甘油使樣品的比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)，減少擴(kuò)散12/14/202226樣品緩沖液便于觀察——溴酚蘭在堿性溶12/18/202227核酸染色劑溴化乙錠染色：溴化乙錠(ethidiumbromide，EB)是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出橘黃色熒光。EB貯備液濃度為10mg/ml水溶液，應(yīng)放冰箱避光保存；常用終濃度為0.5μg/ml，可根據(jù)情況在制膠時(shí)加入，或者在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min。染色后若肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng，當(dāng)溴化乙錠太多，凝膠本底會(huì)染色過深，不易看清弱顯色帶時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察。由于溴化乙錠是一種誘變劑，使用時(shí)應(yīng)戴手套，并避免環(huán)境污染。

12/14/202227核酸染色劑溴化乙錠染色：溴化乙錠(e12/18/202228②銀染色：銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用甲醛等還原劑使Ag+還原成銀顆粒，使核酸帶呈黑褐色，主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色，其靈敏度比EB高，但缺點(diǎn)是銀染色后，DNA不宜回收再使用。12/14/202228②銀染色：銀染色液中的銀離子(Ag+12/18/202229PCR污染與對(duì)策污染原因（1）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染——最主要最常見的污染問題（2）標(biāo)本間交叉污染——主要由于盛裝標(biāo)本的容器被污染、加樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染、有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染12/14/202229PCR污染與對(duì)策污染原因12/18/202230防止污染的方法（1）合理分隔實(shí)驗(yàn)室（2）分裝PCR試劑（3）防加樣槍引起污染（4）選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管時(shí)動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。12/14/202230防止污染的方法12/18/202231原則上分為四個(gè)分隔開的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；標(biāo)本制備區(qū)；擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。12/14/202231原則上分為四個(gè)分隔開的工作區(qū)域：12/18/202232PCR分類對(duì)稱引物系統(tǒng)PCR

1、經(jīng)典PCR2、巢式PCR3、多重PCR4、膜結(jié)合PCR5、原位PCR12/14/202232PCR分類對(duì)稱引物系統(tǒng)PCR12/18/202233不對(duì)稱PCR將反應(yīng)系統(tǒng)中由于引物濃度的巨大差別，導(dǎo)致擴(kuò)增的產(chǎn)物以某條單鏈DNA為主的PCR稱為不對(duì)稱PCR。兩條引物的濃度相差很大（50～100：1），濃度低的稱為限制性引物，濃度高的稱為非限制性引物，在最初的十幾個(gè)循環(huán)中，兩條DNA的目的片段得到等量擴(kuò)增，但后來限制性引物被消耗殆盡，只有非限制性引物尚存，擴(kuò)增的產(chǎn)物主要為該引物引導(dǎo)的單鏈DNA。不對(duì)稱PCR主要為序列測(cè)定制備單鏈DNA

12/14/202233不對(duì)稱PCR將反應(yīng)系統(tǒng)中由于引物濃度12/18/202234逆轉(zhuǎn)錄PCR以RNA為模板的PCR稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptasePCR,RT-PCR），與前述PCR的不同之處在于首先需在一單引物的介導(dǎo)和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補(bǔ)鏈，該互補(bǔ)鏈稱為cDNA，通過加熱使逆轉(zhuǎn)錄酶失活后，加入另一引物，再以該cDNA為模板，在DNA聚合酶催化下合成目的雙鏈DNA片段。逆轉(zhuǎn)錄PCR的模板可為細(xì)胞、病毒的總RNA或細(xì)胞mRNA，該方法常用于檢測(cè)RNA病毒或研究真核細(xì)胞的基因表達(dá)12/14/202234逆轉(zhuǎn)錄PCR以RNA為模板的PCR稱12/18/202235標(biāo)記引物PCR是利用熒光素、同位素或生物素等對(duì)PCR引物的5’端進(jìn)行標(biāo)記，通過檢測(cè)熒光素或者同位素，直接顯示產(chǎn)物的存在；或者利用生物素—親合素系統(tǒng)與酶促反應(yīng)結(jié)合，借助酶促反應(yīng)的放大效應(yīng)，顯示目的片段的存在，更加提高PCR的靈敏度。

12/14/202235標(biāo)記引物PCR是利用熒光素、同位素或12/18/202236不同熒光素標(biāo)記不同引物---彩色PCRPCR-ELISA法---個(gè)引物的5’端，使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定于微孔板的的功能基團(tuán)，如生物素；而另一引物或者探針的5’端修飾便于用酶連免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)的基團(tuán)如FITC，經(jīng)此修飾后的引物仍能引導(dǎo)PCR的特異擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增后的產(chǎn)物不需電泳，直接加入鏈霉親合素包被的聚丙乙烯微孔板，通過生物素與鏈霉親合素反應(yīng)，使產(chǎn)物以及生物素修飾的游離引物固定于微孔板，但只有產(chǎn)物可與隨后加入的HRP-抗FITC抗體結(jié)合，借助檢測(cè)酶活性反映PCR產(chǎn)物的多少12/14/202236不同熒光素標(biāo)記不同引物---彩色P12/18/202237免疫PCR是將抗原抗體的特異性反應(yīng)與PCR技術(shù)結(jié)合起來，以檢測(cè)微量蛋白質(zhì)的方法。如：將與被檢物對(duì)應(yīng)的單克隆抗體先吸附在固相載體上，然后使被檢抗原與之反應(yīng)，再用生物素化的特異性多抗結(jié)合此抗原，通過親合素再與生物素化DNA相連結(jié)，再以適當(dāng)?shù)囊飳?duì)DNA指示分子進(jìn)行擴(kuò)增，以擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)與多少，反應(yīng)待測(cè)抗原的存在與數(shù)量12/14/202237免疫PCR是將抗原抗體的特異性反應(yīng)與12/18/202238定量PCR12/14/202238定量PCR12/18/202239實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。12/14/202239實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR12/18/2022401.Ct值的定義在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念——Ct值。其含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。12/14/2022401.Ct值的定義12/18/2022412.熒光域值（threshold）的設(shè)定PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)12/14/2022412.熒光域值（threshold）的12/18/2022423.Ct值與起始模板的關(guān)系每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。12/14/2022423.Ct值與起始模板的關(guān)系12/18/202243TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。12/14/202243TaqMan熒光探針：12/18/202244在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。12/14/202244在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR12/18/20224512/14/20224512/18/20224612/14/20224612/18/202247熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

12/14/202247熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線12/18/202248總結(jié)細(xì)菌性食物中毒的判斷很重要

診斷標(biāo)準(zhǔn)主要以流行病學(xué)調(diào)查資料及病人的潛伏期和中毒的特有表現(xiàn)為依據(jù)，實(shí)驗(yàn)室診斷是為了確定中毒的病因而進(jìn)行的

12/14/202248總結(jié)細(xì)菌性食物中毒的判斷很重要12/18/202249總結(jié)樣品采集是關(guān)鍵采集最可疑剩余食物，炊事用具、患者的嘔吐物、病人便、患者血液和尸體標(biāo)本，有時(shí)還需采集與食物中毒有關(guān)的人、動(dòng)物及外環(huán)境樣品。例如廚師便、手涂抹物等。12/14/202249總結(jié)樣品采集是關(guān)鍵12/18/202250總結(jié)檢驗(yàn)程序不能省略直接涂片、染色、鏡檢→活菌數(shù)測(cè)定→選擇適當(dāng)?shù)脑鼍丸b別培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)→生化鑒定→血清學(xué)鑒定→毒素測(cè)定。

12/14/202250總結(jié)檢驗(yàn)程序不能省略12/18/202251總結(jié)采用多種快速檢驗(yàn)方法篩選采用酶聯(lián)熒光免疫分析法實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)鑒定采用

API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)----數(shù)值鑒定法基因指紋鑒定系統(tǒng)12/14/202251總結(jié)采用多種快速檢驗(yàn)方法12/18/202252

謝謝大家12/14/20225212/18/202253細(xì)菌性食物中毒的快速檢驗(yàn)平山縣疾控中心

12/14/20221細(xì)菌性食物中毒的快速檢驗(yàn)平山縣疾控中心12/18/202254定義食源性疾病世界衛(wèi)生組織將食源性疾病定義為“凡是通過攝食而進(jìn)入人體的病原體，使人體患感染性或中毒性疾病，統(tǒng)稱為食源性疾病”

12/14/20222定義食源性疾病12/18/202255定義食物中毒食物中毒是指人攝人了含有生物性、化學(xué)性有毒有害物質(zhì)后或把有毒有害物質(zhì)當(dāng)作食物攝入后所出現(xiàn)的而非傳染性的急性或亞急性疾病，屬于食源性疾病的范疇。食物中毒既不包括因暴飲暴食而引起的急性胃腸炎、食源性腸道傳染病(如傷寒)和寄生蟲病(如囊蟲病)，也不包括因一次大量或者長(zhǎng)期少量攝入某些有毒有害物質(zhì)而引起的以慢性毒性為主要特征(如致畸、致癌、致突變)的疾病。

12/14/20223定義食物中毒12/18/202256

食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)主要以流行病學(xué)調(diào)查資料及病人的潛伏期和中毒的特有表現(xiàn)為依據(jù)，實(shí)驗(yàn)室診斷是為了確定中毒的病因而進(jìn)行的。食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)及技術(shù)處理總則GB14938-1994

12/14/20224食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)主12/18/202257中毒特征名稱常見食物潛伏期病程主要癥狀重點(diǎn)采集標(biāo)本沙門氏菌肉蛋類4-48h3-7d惡心嘔吐腹痛腹瀉發(fā)熱38-40℃便食品血副溶血弧菌水產(chǎn)品3-24h1-3d嘔吐發(fā)熱腹痛以上腹部為主水樣便腹瀉便食品變形桿菌肉蛋及水產(chǎn)品5-18h1-3d惡心嘔吐腹痛腹瀉發(fā)熱38℃左右食品便致瀉性大腸涼拌菜4-44h1-3d嘔吐腹痛腹瀉水樣便或粘液便發(fā)熱<39℃便食品蠟樣芽孢桿菌米飯、肉、乳嘔吐型0.5-5h腹瀉型8-16h1d惡心嘔吐為主腹痛腹瀉為主食品嘔吐物葡萄球菌肉、乳、蛋2-4h1-2d惡心頻繁劇烈嘔吐腹痛腹瀉食品嘔吐物糞鏈球菌肉、乳、蛋、冷凍食品5-10h1-2d惡心嘔吐腹痛腹瀉食品嘔吐物糞便肉毒梭菌罐頭、腌制品1-7d2-20d吞咽困難復(fù)視失音呼吸困難食品嘔吐物血液12/14/20225中毒特征常見食物潛伏期病程主要癥狀重點(diǎn)12/18/202258細(xì)菌性食物中毒檢驗(yàn)采集樣品檢驗(yàn)程序直接涂片、染色、鏡檢→活菌數(shù)測(cè)定→選擇適當(dāng)?shù)脑鼍丸b別培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)→生化鑒定→血清學(xué)鑒定→毒素測(cè)定。12/14/20226細(xì)菌性食物中毒檢驗(yàn)采集樣品12/18/202259酶聯(lián)熒光免疫分析法此E.coliO157:H7的抗原鑒別是基于在VIDAS儀器內(nèi)進(jìn)行的酶聯(lián)熒光免疫分析。像吸液管的裝置是固相容器（SPR），在分析中既作為固相也作為吸液器。SPR包被有高特異的單克隆抗體混合物。將一定量的增菌肉湯加入試劑條，肉湯中的混合物在特定時(shí)間內(nèi)循環(huán)于SPR內(nèi)外。如果有E.coliO157:H7抗原存在則與包被在SPR內(nèi)的單克隆抗體結(jié)合，其他沒有結(jié)合上的化合物被沖洗掉。結(jié)合有堿性磷酸酶的抗體在SPR內(nèi)外循環(huán)與結(jié)合在SPR內(nèi)壁上的E.coliO157:H7抗原結(jié)合，最后的沖洗步驟將沒有結(jié)合的接合劑沖洗掉。底物—4-甲基傘形磷酸酮被SPR壁上的酶轉(zhuǎn)換成熒光產(chǎn)物—4-甲基傘形酮。熒光強(qiáng)度由光學(xué)掃描器測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析，產(chǎn)生基于熒光測(cè)試的試驗(yàn)值與標(biāo)準(zhǔn)相比較后打印出每一個(gè)被測(cè)樣品的陽(yáng)性或陰性結(jié)果報(bào)告。12/14/20227酶聯(lián)熒光免疫分析法此E.coliO112/18/202260分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)是在體外酶促擴(kuò)增特定DNA或RNA片段的技術(shù)由變性Templatedenaturation退火Primerannealing延伸Primerextension

三個(gè)基本步驟構(gòu)成12/14/20228分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)12/18/202261體系組成一段長(zhǎng)的雙鏈DNA，是待擴(kuò)增的目的片段，作為擴(kuò)增反應(yīng)的原始模板(template)兩段單鏈寡核苷酸，其序列與待擴(kuò)增片段的兩端相同，作為反應(yīng)的引物(primer)有四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）作為合成DNA的原料有DNA聚合酶(polymerase)，催化DNA的合成有合適的鹽、緩沖液以及溫度循環(huán)參數(shù)，以提供酶促反應(yīng)的最佳條件并保證反應(yīng)的產(chǎn)量。12/14/20229體系組成一段長(zhǎng)的雙鏈DNA，是待擴(kuò)增12/18/202262

12/14/20221012/18/20226312/14/20221112/18/20226412/14/20221212/18/20226512/14/20221312/18/20226612/14/20221412/18/20226712/14/20221512/18/202268在PCR體系中，相對(duì)于模板DNA，引物大量過剩，模板變性后退火時(shí)，它們以3’末端相對(duì)分別結(jié)合于模板DNA的兩條互補(bǔ)鏈上，在DNA聚合酶催化下，合成新的、引物對(duì)之間的DNA片段。在第一個(gè)循環(huán)中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，從引物3'端開始延伸，其5'端是固定的，3’端則沒有固定的止點(diǎn)，隨延伸時(shí)間的增加而增長(zhǎng)，因此該循環(huán)的產(chǎn)物長(zhǎng)度是不定的；12/14/202216在PCR體系中，相對(duì)于模板DNA，引12/18/202269二、PCR技術(shù)的特點(diǎn)高特異性：PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：①以堿基配對(duì)原則使引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；②DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；③靶基因的特異性與保守性12/14/202217二、PCR技術(shù)的特點(diǎn)高特異性：PCR12/18/202270高靈敏度：PCR產(chǎn)物量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在細(xì)菌的檢測(cè)中，最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)PFU(空斑形成單位)。12/14/202218高靈敏度：PCR產(chǎn)物量是以指數(shù)方式增12/18/202271PCR反應(yīng)五要素的優(yōu)化1、多聚核苷酸引物2、TaqDNA聚合酶3、dNTP（三磷酸脫氧核苷酸）4、模板核酸5、緩沖液12/14/202219PCR反應(yīng)五要素的優(yōu)化1、多聚核苷酸12/18/202272其它因素對(duì)PCR的影響1、PCR反應(yīng)的總體積2、PCR反應(yīng)的促進(jìn)劑通過加入某些物質(zhì)穩(wěn)定酶活性或有利于DNA的變性與復(fù)性，以提高擴(kuò)增效率和反應(yīng)的特異性。12/14/202220其它因素對(duì)PCR的影響1、PCR反應(yīng)12/18/202273穩(wěn)定酶活性的有牛血清白蛋白、0.01%明膠、0.05~0.1%Tween-20及5mmol/L二巰基蘇糖醇（DTT），但應(yīng)注意使用濃度不應(yīng)過高，只有牛血清白蛋白的濃度可高達(dá)800μg/ml，而對(duì)酶活性仍無(wú)抑制。5~10%的二甲基亞砜有利于DNA變性，5~10%的甘油有利于DNA復(fù)性。12/14/202221穩(wěn)定酶活性的有牛血清白蛋白、0.0112/18/202274注意事項(xiàng)減少非特異性擴(kuò)增及交叉污染①將反應(yīng)管及各試劑置于冰上，以防引物與模板的非特異性結(jié)合后產(chǎn)生擴(kuò)增；②注意使用防止產(chǎn)生氣溶膠的加樣頭，以避免交叉污染；③最好先加入反應(yīng)所需無(wú)菌水，再依次加入各成分，最后加入聚合酶及模板。12/14/202222注意事項(xiàng)減少非特異性擴(kuò)增及交叉污染12/18/202275PCR產(chǎn)物的檢測(cè)分析凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳——

聚丙烯酰胺凝膠電泳——區(qū)分小于300b的DNA片段

12/14/202223PCR產(chǎn)物的檢測(cè)分析凝膠電泳：12/18/202276瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～32.00.1～212/14/202224瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分12/18/202277電泳緩沖液：常用的電泳緩沖液有三種，即Tris-硼酸(TBETris-boricacid-EDTA)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE)

EDTA可螯合二價(jià)陽(yáng)離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被降解12/14/202225電泳緩沖液：常用的電泳緩沖液有三種，12/18/202278樣品緩沖液便于觀察——溴酚蘭在堿性溶液中呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，其遷移率分別與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段相似；二甲苯腈在該溶液中呈蘭色，其在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時(shí)，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA相近減少擴(kuò)散——蔗糖或甘油使樣品的比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)，減少擴(kuò)散12/14/202226樣品緩沖液便于觀察——溴酚蘭在堿性溶12/18/202279核酸染色劑溴化乙錠染色：溴化乙錠(ethidiumbromide，EB)是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出橘黃色熒光。EB貯備液濃度為10mg/ml水溶液，應(yīng)放冰箱避光保存；常用終濃度為0.5μg/ml，可根據(jù)情況在制膠時(shí)加入，或者在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min。染色后若肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng，當(dāng)溴化乙錠太多，凝膠本底會(huì)染色過深，不易看清弱顯色帶時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察。由于溴化乙錠是一種誘變劑，使用時(shí)應(yīng)戴手套，并避免環(huán)境污染。

12/14/202227核酸染色劑溴化乙錠染色：溴化乙錠(e12/18/202280②銀染色：銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用甲醛等還原劑使Ag+還原成銀顆粒，使核酸帶呈黑褐色，主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色，其靈敏度比EB高，但缺點(diǎn)是銀染色后，DNA不宜回收再使用。12/14/202228②銀染色：銀染色液中的銀離子(Ag+12/18/202281PCR污染與對(duì)策污染原因（1）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染——最主要最常見的污染問題（2）標(biāo)本間交叉污染——主要由于盛裝標(biāo)本的容器被污染、加樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染、有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染12/14/202229PCR污染與對(duì)策污染原因12/18/202282防止污染的方法（1）合理分隔實(shí)驗(yàn)室（2）分裝PCR試劑（3）防加樣槍引起污染（4）選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管時(shí)動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。12/14/202230防止污染的方法12/18/202283原則上分為四個(gè)分隔開的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；標(biāo)本制備區(qū)；擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。12/14/202231原則上分為四個(gè)分隔開的工作區(qū)域：12/18/202284PCR分類對(duì)稱引物系統(tǒng)PCR

1、經(jīng)典PCR2、巢式PCR3、多重PCR4、膜結(jié)合PCR5、原位PCR12/14/202232PCR分類對(duì)稱引物系統(tǒng)PCR12/18/202285不對(duì)稱PCR將反應(yīng)系統(tǒng)中由于引物濃度的巨大差別，導(dǎo)致擴(kuò)增的產(chǎn)物以某條單鏈DNA為主的PCR稱為不對(duì)稱PCR。兩條引物的濃度相差很大（50～100：1），濃度低的稱為限制性引物，濃度高的稱為非限制性引物，在最初的十幾個(gè)循環(huán)中，兩條DNA的目的片段得到等量擴(kuò)增，但后來限制性引物被消耗殆盡，只有非限制性引物尚存，擴(kuò)增的產(chǎn)物主要為該引物引導(dǎo)的單鏈DNA。不對(duì)稱PCR主要為序列測(cè)定制備單鏈DNA

12/14/202233不對(duì)稱PCR將反應(yīng)系統(tǒng)中由于引物濃度12/18/202286逆轉(zhuǎn)錄PCR以RNA為模板的PCR稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptasePCR,RT-PCR），與前述PCR的不同之處在于首先需在一單引物的介導(dǎo)和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補(bǔ)鏈，該互補(bǔ)鏈稱為cDNA，通過加熱使逆轉(zhuǎn)錄酶失活后，加入另一引物，再以該cDNA為模板，在DNA聚合酶催化下合成目的雙鏈DNA片段。逆轉(zhuǎn)錄PCR的模板可為細(xì)胞、病毒的總RNA或細(xì)胞mRNA，該方法常用于檢測(cè)RNA病毒或研究真核細(xì)胞的基因表達(dá)12/14/202234逆轉(zhuǎn)錄PCR以RNA為模板的PCR稱12/18/202287標(biāo)記引物PCR是利用熒光素、同位素或生物素等對(duì)PCR引物的5’端進(jìn)行標(biāo)記，通過檢測(cè)熒光素或者同位素，直接顯示產(chǎn)物的存在；或者利用生物素—親合素系統(tǒng)與酶促反應(yīng)結(jié)合，借助酶促反應(yīng)的放大效應(yīng)，顯示目的片段的存在，更加提高PCR的靈敏度。

12/14/202235標(biāo)記引物PCR是利用熒光素、同位素或12/18/202288不同熒光素標(biāo)記不同引物---彩色PCRPCR-ELISA法---個(gè)引物的5’端，使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定于微孔板的的功能基團(tuán)，如生物素；而另一引物或者探針的5’端修飾便于用酶連免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)的基團(tuán)如FITC，經(jīng)此修飾后的引物仍能引導(dǎo)PCR的特異擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增后的產(chǎn)物不需電泳，直接加入鏈霉親合素包被的聚丙乙烯微孔板，通過生物素與鏈霉親合素反應(yīng)，使產(chǎn)物以及生物素修飾的游離引物固定于微孔板，但只有產(chǎn)物可與隨后加入的HRP-抗FITC抗體結(jié)合，借助檢測(cè)酶活性反映PCR產(chǎn)物的多少12/14/202236不同熒光素標(biāo)記不同引物---彩色P12/18/202289免疫PCR是將抗原抗體的特異性反應(yīng)與PCR技術(shù)結(jié)合起來，以檢測(cè)微量蛋白質(zhì)的方法。如：將與被檢物對(duì)應(yīng)的單克隆抗體先吸附在固相載體上，然后使被檢抗原與之反應(yīng)，再用生物素化的特異性多抗結(jié)合此抗原，通過親合素再與生物素化DNA相連結(jié)，再以適當(dāng)?shù)囊飳?duì)DNA指示分子進(jìn)行擴(kuò)增，以擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)與多少，反應(yīng)待測(cè)抗原的存在與數(shù)量12/14/202237免疫PCR是將抗原抗體的特異性反應(yīng)與12/18/202290定量P