單克隆抗體的制備及應(yīng)用

單克隆抗體的制備及應(yīng)用

單克隆抗體的制備及應(yīng)用單克隆抗體是由淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對(duì)復(fù)合抗原分子上某一單個(gè)抗原決定簇。單克隆抗體技術(shù)（monoclonalantibodytechnique）:一種免疫學(xué)技術(shù)，將產(chǎn)生抗體的單個(gè)B淋巴細(xì)胞同骨髓腫瘤細(xì)胞雜交，獲得既能產(chǎn)生抗體，又能無(wú)限增殖的雜種細(xì)胞能無(wú)限增殖的雜種細(xì)胞，并以此生產(chǎn)抗體。是僅=1由一種類型的細(xì)胞制造出來(lái)的抗體，對(duì)應(yīng)于多克隆抗體、多株抗體——由多種類型的細(xì)胞制造出來(lái)的一種抗體。1單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)與局限性：1.1單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：（1）雜交瘤可以在體外“永久”地存活并傳代，只要不發(fā)生細(xì)胞株的基因突變，就可以不斷地生產(chǎn)高特異性、高均一高度特異的、均一的抗體。（3）由于可能得到“無(wú)限量”的均一性抗體，所以適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法，如IRMA和ELISA等。性的抗體。（2）可以用相對(duì)不純的抗原，獲得大量|三」（4）由于單克隆抗體的高特異性和單一生物學(xué)功能，可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療。

性的抗體。（2）可以用相對(duì)不純的抗原，獲得大量|三」I=j

w總體來(lái)說(shuō)，即：高特異性、高純度、重復(fù)性好、敏感性強(qiáng)、成本低和可大量生產(chǎn)等。I=j

w1.2單克隆抗體的局限性：(1)單克隆抗體固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍。由于單克隆抗體不能進(jìn)行沉淀和凝集反應(yīng)，所以很多檢測(cè)方法不能用單克隆抗體完成。(2)單克隆抗體的反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體。⑶制備技術(shù)復(fù)雜，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)工，所以單克隆抗體的價(jià)格也較高。2單克隆抗體的制備：=1=1單克隆抗體的制備原理：應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。這種雜種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性，它既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來(lái)源于單個(gè)融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。=1=1單克隆抗體的制備過(guò)程：抗原準(zhǔn)備、動(dòng)物的選擇與免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測(cè)、雜交瘤的克隆化、雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)

蘇、單克隆抗體的純化等步驟。2.1抗原準(zhǔn)備抗原，是指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生（特異性）免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)（特異性反應(yīng)）的物質(zhì)?？乖幕咎匦杂袃煞N，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，也就是抗原性。很多物質(zhì)都可以成為抗原，抗原的具體分類可以參見(jiàn)抗原，在進(jìn)行單克隆抗體制備過(guò)程中，很多物質(zhì)都可以成為抗原，在常規(guī)的科研實(shí)驗(yàn)中，科研者經(jīng)常選用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug重組蛋白、偶聯(lián)多肽、偶聯(lián)小分子等作為抗原產(chǎn)生特異性的單克隆抗體。2.2動(dòng)物的選擇與免疫2.2.1動(dòng)物的選擇純種BALB/c小鼠，較溫順，般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能飼養(yǎng)成活.目前開(kāi)展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種BALAc小鼠。離窩的活動(dòng)范圍小，體弱，食量及排污較小，1^1I三」2.2.2免疫方案選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個(gè)月左右根據(jù)確立免疫方

案開(kāi)始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不離窩的活動(dòng)范圍小，體弱，食量及排污較小，1^1I三」（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免疫抗原1?50pg加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.8?1ml，0.2ml/點(diǎn)）,3周后第二次免疫，劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過(guò)0.5ml），l=J

wIII3周后第三次免疫，劑量同一，不加佐劑，ip（5?7天后采血測(cè)其效價(jià)），2?3周加強(qiáng)免疫，劑量50?500pg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射），3天后取脾融合。l=J

wIIIl=J

w（2）顆粒抗原免疫性強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時(shí)要求抗原量為1?2x107個(gè)細(xì)胞。初次免疫1x107/0.5mlip，2?3周后，第二次免疫1x107/0.5mlip，3周后加強(qiáng)免疫（融合前三天）1x107/0.5mlip或iv，取脾融合。l=J

w2.3細(xì)胞融合2.3.1細(xì)胞融合前準(zhǔn)備（1）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)Ill和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%?20%，細(xì)胞濃度以104?5x105/ml為宜，最大濃度不得超過(guò)106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)曲長(zhǎng)的中期時(shí)，可按1：3?1：10的比例傳代。每3?5天傳代一次。細(xì)胞在傳代過(guò)程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥(niǎo)嘌峰進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對(duì)HAT呈均一的敏感性。Ill(2)飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長(zhǎng)繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過(guò)程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(較為常用)、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2x104或105細(xì)胞/孔。2.3.2細(xì)胞融合的步驟將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無(wú)血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min；棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。l=j

w90s內(nèi)加入37°C預(yù)溫的1ml45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)。37C水浴作用90s。l=j

w加37。C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。離心，800rpm,6min。充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100/1—般一個(gè)免疫脾臟可接種4塊96孔板。將培養(yǎng)板置37C、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。22.4選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測(cè)2.4.1HAT選擇雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸昔激酶或次黃嘌吟鳥(niǎo)嘌吟核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長(zhǎng)繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長(zhǎng)繁殖。在用HAT選擇培養(yǎng)1?2天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3?4天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7?10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時(shí)，即可開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2?3天換一半培養(yǎng)液。2.4.2抗體的檢測(cè)檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有：（1）放射免疫測(cè)定（RIA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測(cè)。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測(cè)。（3）免疫熒光試驗(yàn)適合于細(xì)胞表面抗原的McAb的檢測(cè)。（4）其它如間接血凝試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗(yàn)等。

2.5雜交瘤克隆化=j雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。因?yàn)榻?jīng)過(guò)HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無(wú)關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開(kāi)就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過(guò)的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力?？寺』姆椒ê芏?，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。=j2.6雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇2.6.1雜交瘤細(xì)胞的凍存及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊](méi)有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)可能發(fā)

生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒(méi)有原始細(xì)胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。Ill細(xì)胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。Ill=1凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降至0°C后放入-70°C超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。=12.6.2細(xì)胞復(fù)蘇方法將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37C水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細(xì)胞解凍，將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37C、5%CO孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞形成集落2時(shí)，檢測(cè)抗體活性。2.7單克隆抗體的大量制備III大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：一種是雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純

l=j化。如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。IIIl=jI=J另一種方法是最普遍采用小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5?10ml的腹水，有時(shí)甚至超過(guò)40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。I=J2.8單克隆抗體的鑒定對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的，應(yīng)做下述幾個(gè)方面的鑒定：2.8.1抗體特異性的鑒定除用免疫原（抗原）進(jìn)行抗體的檢測(cè)外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)該用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無(wú)交叉。

Illl=jMcAb的Ig類與亞類的鑒定一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測(cè)出來(lái)的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來(lái)確定。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成。Illl=jMcAb中和活性的鑒定用動(dòng)物或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定McAb的生物學(xué)活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來(lái)觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。McAb識(shí)別抗原表位的鑒定用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，測(cè)相加指數(shù)的方法，測(cè)定McAb所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來(lái)確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。McAb親合力的鑒定用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力。2.9單克隆抗體制備的影響因素：污染。2、PEG有毒性，可能作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，

Illl=J牛血清質(zhì)量差，骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體，HAT有問(wèn)題，融合后雜交瘤細(xì)胞不生長(zhǎng)。3免疫原抗原性弱，免疫效果不好，融合后有細(xì)胞生長(zhǎng)，但無(wú)抗體產(chǎn)生（可能是HAT中的A失效，或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞），原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮裕赡苁侵гw污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)），使雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體。4小牛血清質(zhì)量問(wèn)題，雜交瘤細(xì)胞活性狀態(tài)，細(xì)胞有支原體污染，使雜交瘤細(xì)胞難以克隆化等。Illl=J3單克隆抗體的應(yīng)用：檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑目前，應(yīng)用單克隆抗體制作的商品化試劑盒廣泛應(yīng)用于：①病原微生物抗原、抗體的檢測(cè)；②腫瘤抗原的檢測(cè)；③免疫細(xì)胞及其亞群的的檢測(cè)；④激素測(cè)定；⑤細(xì)胞因子的測(cè)定。單克隆抗體對(duì)抗原的識(shí)別，與多克隆抗體有很大的不同。不同試劑盒因使用的單克隆抗體不同，識(shí)別抗原的位點(diǎn)不同，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果有一定差異。因此，標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題還需要進(jìn)一步研究。蛋白質(zhì)的提純單克隆抗體是親和層析中

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