菌種的保存方法介紹課件

菌種的保存方法介紹

江西省臨床檢驗中心臨床微生物實驗室經(jīng)常能夠分離到一些有意義的菌種，但接種在平板上的細(xì)菌放4℃冰箱只能保存數(shù)天，并且細(xì)菌在培養(yǎng)基上移種3次后，其形態(tài)、菌落、毒力等均易發(fā)生變異[1]，監(jiān)測日常工作的室內(nèi)質(zhì)控用標(biāo)準(zhǔn)菌株也需要長期留存。所以盡可能長期有效地留存菌種對于系統(tǒng)地分析當(dāng)前流行株的生物學(xué)、分子生物學(xué)特征及耐藥性變遷，醫(yī)院感染病原學(xué)調(diào)查、新藥臨床研究都十分重要的意義。本文介紹幾種常用的菌種保存方法

常規(guī)保存法

該法操作簡單，只需普通冰箱保存，每個臨床微生物實驗室均可采用。但缺點是留存時間短，傳代頻繁，菌種易變異。

斜面保存法

⑴普通瓊脂斜面保存法：葡萄球菌、腸道桿菌等對營養(yǎng)要求不高的一股細(xì)菌可接種于普通瓊脂斜面上，斜面底部應(yīng)加少許無糖肉膏液，以防干涸(但變形桿菌"OX"及傷寒桿"O"菌株宜接種于干燥的瓊脂斜面以防變異)。用橡皮塞塞緊，經(jīng)37℃18-24h培養(yǎng)后，存放于4℃冰箱中，一般可保存3-6個月。

⑵血液瓊脂斜面保存法：鏈球菌及肺炎球菌等對營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌應(yīng)接種于血液瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)生長后，放4℃冰箱保存。鏈球菌須半個月至1個月移種一次，肺炎球菌則須4d移種一次。⑶雞蛋斜面保存法：將細(xì)菌接種于雞蛋斜面上，經(jīng)37℃18-24h培養(yǎng)后，加無菌液體石蠟至斜面浸液，再超出約1cm，置4℃冰箱保存。此法用于保存含有Vi抗原的沙門氏菌及其它含表面抗原的細(xì)菌，可保存3-6個月。⑷呂氏血清斜面：白喉棒狀桿菌可保存在該培養(yǎng)基上，其成份為1%葡萄糖肉湯(pH7.4)1份，無菌牛血清或兔血清3份。白喉棒狀桿菌在此培養(yǎng)基上生長迅速、旺盛，菌體形態(tài)典型，如在培養(yǎng)基中再加入5%-10%的中性甘油，則培養(yǎng)出的白喉棒狀桿菌異染顆粒更為明顯，單24小時后即衰老成為多形態(tài)，很少有異染顆粒，菌體粗大3-4倍，置4℃可保存2周至1個月。砂土管保存法

適用于產(chǎn)芽孢的細(xì)菌

低溫冷凍保存法

實驗室必須配備-20℃以下低溫冰箱，冰箱溫度越低，保存的時間越長。

濕牛奶冷凍法[3]

材料①保護(hù)劑牛奶的準(zhǔn)備：新鮮牛奶經(jīng)脫脂棉反復(fù)3次過濾后，10磅10min高壓蒸氣滅菌后，冰箱保存?zhèn)溆?。②菌種管的處理：先經(jīng)清潔液浸泡1天，之后用清水沖洗，再用蒸餾水浸泡過夜，以達(dá)中性，然后管口塞上棉花，經(jīng)15磅30min高壓蒸氣滅菌備用。方法將各種細(xì)菌種于各自生長良好的平板培養(yǎng)基上，經(jīng)分純后在37℃孵箱孵育18h后，用準(zhǔn)備好的保護(hù)劑牛奶洗下菌苔，然后用無菌毛細(xì)滴管吸取菌懸液滴入菌種管球部，每管球部約有一半的菌液，之后火焰封口，保存于-20℃冰箱。抵抗強(qiáng)的細(xì)菌至少可保存3年，抵抗力弱的細(xì)菌保存不低于2年。

商品化菌種保存管

每只保藏管中含20-25個小珠以及緩沖液，使用時將菌落挑入緩沖液中，混勻，將緩沖液吸去，置-70℃冰箱保存可達(dá)10年，-20℃冰箱可保存1-3年。復(fù)蘇時，只需將小珠接入肉湯或平板上滾動即可。商品化菌種保存管操作簡單，但價格偏高。筆者預(yù)計隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展和實驗室條件的改善，使用的單位將會越來越多。

冷凍真空干燥保存法

該法是目前保存菌種的最佳方法，具有如下幾個突出的優(yōu)點：①適用范圍廣。除少數(shù)不產(chǎn)生孢子只產(chǎn)生菌絲體的絲狀真菌不宜采用此方法保藏外，其他各大類微生物如細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌及病毒均可采用此方法保藏；②保藏期長，成活率高。有人報道保藏在真空冷凍干燥安培管中的真菌成活期長達(dá)40多年[5]，一般微生物至少可保存10余年；③微生物在保藏期內(nèi)可避免其它雜菌污染；④便于攜帶運輸，易實現(xiàn)商品化生產(chǎn)。其缺點為需要一定的設(shè)備（冷凍真空干燥機(jī)）、操作繁瑣等。菌種管由傳統(tǒng)的玻璃菌種管改為0.5ml帶蓋塑料離心管。方法：①將塑料離心管置耐高壓塑料離心管盒內(nèi)并用雙層報紙包好，高壓蒸汽15磅15min消毒，放烤箱80℃烤干。②在凈化工作臺內(nèi)將脫脂牛奶洗下的濃厚菌懸液用長毛細(xì)玻璃滴管加到塑料離心管的底部，每只0.2ml左右，切記不要將牛奶污染離心管口。③將加好菌液的離心管盒置-20℃冰箱預(yù)凍，預(yù)凍好后把離心管盒放置到冷凍干燥機(jī)干燥箱內(nèi)凍干。④凍干后在凈化工作臺內(nèi)壓好離心管蓋，不抽真空。貼標(biāo)簽，用封口膜封離心管口。放-20℃冰箱保存。

該改良法優(yōu)點有：⑴操作過程大大簡化，菌種管口不需溶封，不抽真空。⑵菌種管抗破損性極佳；⑶菌種管體積超小。⑷成本低廉，易于商品化生產(chǎn)、推廣。筆者使用該改良法近七年，本省發(fā)放菌種上萬只沒有破損情況出現(xiàn)；數(shù)次發(fā)放嗜血桿菌、鏈球菌、奈瑟氏菌等苛養(yǎng)菌，生長情