非天然熒光核酸探針用于活細(xì)胞內(nèi)重要組分傳感與成像的研究

國(guó)家自然科學(xué)基（）：：湖 沙市岳麓區(qū)麓山南路湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)：：2014年2月26國(guó)家自然科學(xué)基（）：：湖 沙市岳麓區(qū)麓山南路湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)：：2014年2月26第1 1982年04男 助 每年工作時(shí)間（月 湖 沙市岳麓區(qū)麓山南路湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué) 主 領(lǐng) 第1 1982年04男 助 每年工作時(shí)間（月 湖 沙市岳麓區(qū)麓山南路湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué) 主 領(lǐng) heResarchofArtifi lFluorescenceNucleicAcidProbesforSensingandImagingofImportantComponentinLivingCell2015年01月--2017年1230.0000L-DNAL-DNA；Nucleicacidmolecularprobes；cellimaging第2核酸分子探針已被廣泛應(yīng)用 物體內(nèi)各種生物、化學(xué)物質(zhì)的傳感和成像。然而，由于復(fù)雜第2核酸分子探針已被廣泛應(yīng)用 物體內(nèi)各種生物、化學(xué)物質(zhì)的傳感和成像。然而，由于復(fù)雜生理環(huán)境，核酸分子在細(xì)胞內(nèi)易被降解、產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。本項(xiàng)目利用天然DNA（D-DNA）的映異構(gòu)體：L-DNA能夠抵抗核酸酶降解、不與蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合等性能，擬發(fā)展一系列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、響應(yīng)快速、能夠穩(wěn)定存在于細(xì)胞環(huán)境并準(zhǔn)確 細(xì)胞內(nèi)特定目標(biāo)物的L-DNA核酸分子探針。首先，借助G-Quadruplex、i-motif、DNAzyme等天然或人工篩選的特殊DNA結(jié)構(gòu)對(duì)目標(biāo)物的特異性識(shí)別能力，設(shè)計(jì)并構(gòu)建檢測(cè)鉀離子、 值、重金屬離子的L-DNA傳感器；在此基礎(chǔ)上 Nucleicacidmolecularprobes(NAMPs) efoundwideapplicat sinsensingandimagingofvariouschemicalandbiologicalsubstan invivo.However,duetonucleasedegradat andproteinbinding,tradit alNAMPsmaygeneratefalseitivesignalswhenusedinlivingcells.Inorderto ethisproblem,thispro alwouldliketochoosemirror-imageoligonucleotides,alsoknownasL-DNAs,anddevelopaseriesofL-DNA-basedNAMPs(L-NAMPs),whichcombinepatibilityand tosignal erferencewithsimple,ra ,stable,andaccurate sensinginlivingcells.Asaproofofconcept,byemployingnaturalorartifi lselectedfunct aloligonucleotide chasG-Quadruplex,i-motifandDNAzyme,wewill lydesignL-NMPsfordetect ofK+, ,andheavymetal invitrorespectively.ThenL-NAMPswillbeusedinvivotomapspatialandtemporal changes.ThisprojctisexpectedtodevelopaseriesofL-NAMPsforsimple,ra ,stable,andaccuratechemicaland parameterssensinginlivingcells,andpro eastraightforward methodforreal-timemonitoringoflivingbody olecularlevel.項(xiàng)目組主要參與者不包括項(xiàng)目申請(qǐng)人第3生8152時(shí)間（）11990-03-男21988-08-女生 31987-11-女41988-02-男生m51985-01-男61988-09-女71987-01-女項(xiàng)目組主要參與者不包括項(xiàng)目申請(qǐng)人第3生8152時(shí)間（）11990-03-男21988-08-女生 31987-11-女41988-02-男生m51985-01-男61988-09-女71987-01-女（：萬(wàn)元第4備注（計(jì)算依據(jù)與說明一 經(jīng)1.(1)(2)(3) 物/文獻(xiàn)/信 (5)2.(1) （：萬(wàn)元第4備注（計(jì)算依據(jù)與說明一 經(jīng)1.(1)(2)(3) 物/文獻(xiàn)/信 (5)2.(1) (2)03.2.0(1)(2)0 改裝及配置 及生化分5.01.用 參 交 0 不得超過申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的000正1.申請(qǐng)人簡(jiǎn)： ：湖南大學(xué)，化學(xué)化工學(xué)院，助員2002/092006/06，員2.立項(xiàng)依據(jù)（1）項(xiàng)要參考文獻(xiàn)目錄正1.申請(qǐng)人簡(jiǎn)： ：湖南大學(xué)，化學(xué)化工學(xué)院，助員2002/092006/06，員2.立項(xiàng)依據(jù)（1）項(xiàng)要參考文獻(xiàn)目錄出的生物/。第5DNA探針結(jié)構(gòu)變化 DNA探針結(jié)構(gòu)變化 要對(duì)核酸分子探針進(jìn)行序列的篩選和優(yōu)化，這對(duì)核酸分子探針的設(shè)計(jì)造成了一定的復(fù)雜性[]uninenuleotide,G）A序列在鉀離子存在下形（Qudruplxdruplx核酸探針用于鉀druplx同時(shí)又是某些蛋白質(zhì)，如凝血酶、核仁素[]hinerance 物體內(nèi)用于目標(biāo)物的長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)[8]第6L-DNADNA，DDNA的對(duì)映異構(gòu)體（圖1。與D-DNA相比，L-DNA能夠抵抗核酸酶的降解、不與細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合。同時(shí)，L-DNAL-DNADNA，DDNA的對(duì)映異構(gòu)體（圖1。與D-DNA相比，L-DNA能夠抵抗核酸酶的降解、不與細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合。同時(shí)，L-DNADL-DNA等問題[9]。然而，L-DNA的結(jié)果表明，L-DNAGG-Quadruplex結(jié)構(gòu)，并保持其對(duì)過氧化物酶的催化活性，以及對(duì)鉀離子的響應(yīng)效果[10，同時(shí)，由于其手性的改變，形成的L-DNAG-Quadruplex核酸適體失去了與其對(duì)應(yīng)配體蛋白質(zhì)的結(jié)合能力[11]，從而有望設(shè)鉀離子探針。除此之外，富含胞嘧啶（cytosine,C）DNA結(jié)構(gòu)13]；具有特定催化功能的脫氧核酶條件下發(fā)生質(zhì)子化，形成i-（DNAzyme）對(duì)特定重金屬離子的依賴性催化[1415]L-DNA1L-DNA與D-為了解決核酸探針在活細(xì)胞等復(fù)雜生物環(huán)境中用于檢測(cè)所的諸多問L-DNA G-Quadruplex、i-motifDNAzymeDNA構(gòu)作為構(gòu)建L-DNA第7，有助 疾病的防治。[1]Liu,J.;Cao,Z.;Lu,Y.,Functalnucleicacidsensors.Chem.Rev.2009,[2]Wang,K.;Tang,,C.J.;Kim,,X.;Li,W.;Wu,Y.;Medley,C.Cao,Z.;Li,J.;Colon,P.;Lin,H.;Tan,W.,，有助 疾病的防治。[1]Liu,J.;Cao,Z.;Lu,Y.,Functalnucleicacidsensors.Chem.Rev.2009,[2]Wang,K.;Tang,,C.J.;Kim,,X.;Li,W.;Wu,Y.;Medley,C.Cao,Z.;Li,J.;Colon,P.;Lin,H.;Tan,W.,MolecularengineeringofDNA:beacons.Angew..Ed.2009,48,856-[3]Ke,G.;Wang,C.;Ge,Y.;Zheng,N.;Zhu,,C.J.,L-DNAbeacon:asafe,stable,andracellularnano-thrmometerforsensinginlivingcells.J.Am.Chem.Soc.2012,134,8908,C.J.;Martinez,K.;Lin,H.;Tan,W.Hybridmolecularprobefornucleicysisinbiologicalsamples.J.Am.Chem.Soc2006,128,9986-9987.[5]Kim,,C.J.;Tan,W.,Superiorstrcturestabilityandselectivityofnucleicacidprobesnl-DNAstem.NuclAcidsRes.2007,35,7279-[6]Ohtsuka,K.;Sato,S.;Sato,Y.;Sota,K.;Ohzawa,S.;Matsuda,T.;Takemoto,une,N.;Juskowiak,B.;Nagai,T.;TakenakaS.,Fluorescenceimagingsinlivingcellsusingafluorescentprobebasedonathrombinbindingeptideconjugate.Chem.Commun.,2012,48,4740–4742.[7]Seferos,D.S.;Prigodich,A.E.;Giljohann,D.A.;Pa,P.C.;Mirkin,C.A.,PolyvalentDNAnanoparticleconjugatesstabilizenucleicacids.NanoLett.2009,9,[8]Wang,,C.J;Medley,C.D.;Benner,S.A.;Tan,W.,Lockednucleicmolecularbeacons.JAmChemSoc2005,127,15664-[9]Purschke,W.G.;Eulberg,D.;Buchner,K.;Vonhoff,S.;Klussmann,S.,L-RNA-basedaquareticUSA,2006,103,5173-tinhibitsvasopressininvivo.Proc..Acad.[10]Li,C.;Zhu,L.;Zhu,Z.;Fu,H.;Jenkins,G.;Wang,C.;Zou,Y.;Lu,,J.,BackbonepromotesperoxidaseactivityofG-Quadruplex-DNAzyme.Chem.Commun.,2012,48,8347-[11]Williams,K.;Liu,X.;Schumacher,T.;Lin,H.;Ausiello,D.;Kim,P.;,Bioactiveandnuclease-resistantL-DNAligandofvasopressin.Proc.NUSA.1997,94,11285-11290..Acad.Liu,D.;Balasubramanian,S.,Aproton-fuelledDNAnanomachine.AngewChemEdEngl.2003,42,5734-5736Modi,S.;S,M.G.;Goswami,D.;Gupta,GD.;Mayor,S.;Krishnan,Y.,Atmapsspatialandchangesinsidelivingcells.Nanotechnol.2009,4,325-[14]Liu,J.;Brown,A.K.;Meng,X.;Cropek,D.M.;Istok,J.D.;Watson,D.B.;第8Y.,Acatalyticbeaconsensorforuraniumwithparts-per-sensitivityfoldselectivity.Proc..Acad.Sci.USA2007,104,2056-[15]Wu,P.;Hwang,K.;Lan,T.;Lu,Y.,ADNAzyme-GoldNanoparticleProbeY.,Acatalyticbeaconsensorforuraniumwithparts-per-sensitivityfoldselectivity.Proc..Acad.Sci.USA2007,104,2056-[15]Wu,P.;Hwang,K.;Lan,T.;Lu,Y.,ADNAzyme-GoldNanoparticleProbeinLivingCells.J.Am.Chem.Soc.,2013,135,5254-（2）項(xiàng)目目標(biāo),（部分為重點(diǎn)闡述內(nèi)容L-DNA目以核酸分子識(shí)別為基礎(chǔ)，設(shè) 目標(biāo)物響應(yīng)L-DNA項(xiàng)目將以G-Quadruplex對(duì)鉀離子的特異性響應(yīng)、i-motif對(duì)H+的響應(yīng)、以及DNAzymeD-DNAL-L-DNAL-DNAL-DNA2.1.1L-DNA由L-DNAL-DNAG-QuadruplexL-DNAG-Quadruplex核酸適體失去了與其對(duì)應(yīng)配體蛋白質(zhì)識(shí)別的性質(zhì)，可以直接設(shè)計(jì)復(fù)雜基質(zhì)中對(duì)鉀離子高選擇性響應(yīng)的L-G-QuadruplexD-DNAL-DNAi-motifDNAzymeD-DNAL-DNA第92.1.2L-DNADL-DNAD2.1.3L-DNAL-DNA2.1.3L-DNAHeLa2.1.2L-DNADL-DNAD2.1.3L-DNAL-DNA2.1.3L-DNAHeLa。L-DNA準(zhǔn) ，用于疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、生命體 疾病提供有力的分析。2.31）L-DNA核酸探針在生理環(huán)境下的穩(wěn)定性。L-DNADNaseIL-DNA2）L-DNA核酸探針在特定目標(biāo)物存在下形成特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)（或特定催化效果的能力。鉀離子、H+DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)合不會(huì)受L-DNAG-Quadruplexi-motif第10DNAzymeL-DNAD-DNAL-DNA標(biāo)物存在下形成特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)（或特定催化效果）（3）擬采（DNAzymeL-DNAD-DNAL-DNA標(biāo)物存在下形成特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)（或特定催化效果）（3）擬采（等說明、3.1L-DNA：2第113L-DNA3.1.1G-QuadruplexL-DNA鉀離子是生命體內(nèi)不可或缺的金屬離子，利用鉀離子能夠特異性促進(jìn)G-QuadruplexD-G-Quadruplex的解，另一方面，G-Quadruplex一般較易與多種蛋白質(zhì)形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)（3L-DNA3.1.1G-QuadruplexL-DNA鉀離子是生命體內(nèi)不可或缺的金屬離子，利用鉀離子能夠特異性促進(jìn)G-QuadruplexD-G-Quadruplex的解，另一方面，G-Quadruplex一般較易與多種蛋白質(zhì)形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)（QuadruplexD-G-Quadruplex的G-Quadruplex和TMR兩種能夠發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的熒光基團(tuán)，不存在鉀離子時(shí)，組成FAM的熒光信號(hào)；鉀離子出現(xiàn)后，G-Quadruplex結(jié)構(gòu)形成，F(xiàn)AMTMRTMR1）G-QuadruplexG-QuadruplexL-DNAG-Quadruplex第12 G-QuadruplexL-DNAG-Quadruplex2）L-DNAG-QuadruplexNa+Rb+Cs+、Li+、 G-QuadruplexL-DNAG-Quadruplex2）L-DNAG-QuadruplexNa+Rb+Cs+、Li+、NH4+探針對(duì)鉀離子的選擇性響應(yīng)。L-3）L-DNAG-QuadruplexD力G-QuadruplexD型核酸干D-DNAG-QuadruplexDNaseI存在下L-DNAG-QuadruplexDD-DNAG-QuadruplexG-QuadruplexD-DNAG-QuadruplexL-DNAG-QuadruplexL-DNAG-Quadruplex4）L-DNAG-QuadruplexL-DNAG-Quadruplex使用細(xì)胞裂解液和血漿模擬復(fù)雜生物環(huán)境，分別這兩種基質(zhì)中L-G-Quadruplex第135）L-DNAG-QuadruplexHeLaL-DNAG-QuadruplexotericinBL-DNAG-QuadruplexL-DNAG-Quadruplex3.1.2i-motifL-DNA（H+CC-mo5）L-DNAG-QuadruplexHeLaL-DNAG-QuadruplexotericinBL-DNAG-QuadruplexL-DNAG-Quadruplex3.1.2i-motifL-DNA（H+CC-motifi-motif3BL-DNAi-motif1）L-DNAi-motifD-DNAL-i-motif酸性i-motif2）L-DNAi-motifDD-DNADNaseIi-motifL-DNAi-motif探針能夠抵抗核酸酶降解（（使用熒光和熒光偏振兩種方法）3）L-DNAi-motifi-motifi-motif在5.08.0第144）L-DNAi-motifHeLaL-DNAi-motif時(shí)間增加，L-DNAi-motif值的分辨率和靈敏度，進(jìn)行定量或半定量分析，建立L-i-motif3.1.3DNAzymeL-DNA4）L-DNAi-motifHeLaL-DNAi-motif時(shí)間增加，L-DNAi-motif值的分辨率和靈敏度，進(jìn)行定量或半定量分析，建立L-i-motif3.1.3DNAzymeL-DNA（DNAzymeDNAzyme的催化作用一般需要依賴特定的金DNAzyme設(shè)計(jì)核酸探針用于該類金屬離子的檢測(cè)（3CDNAzyme的識(shí)別不具L-DNAzyme探針用于細(xì)胞內(nèi)重金屬離子的成像檢測(cè)。DNAzymeLDNAzyme探針用于細(xì)胞內(nèi)銅離子1）DNAzyme特異性響應(yīng)銅離子的DNAzyme含有一條底物鏈和一條酶鏈。銅離子DNAzyme探針的底物鏈的3’末端和酶鏈的5’D-探針，通過延長(zhǎng)或減短熒光/2）L-DNAzymeD-DNAzymeL-DNAzymeL-DNAzyme3）L-DNAzyme第15D-DNAzymeDNaseIDNAzymeD-DNA（D-DNAzyme的底物鏈取代下來(lái)）L-DNAzyme探針能夠抵抗核酸酶降解（使用熒光和電泳兩種方法D型核酸干擾（使用熒光）以及抵抗非特異性蛋白質(zhì)的干擾（種方法）能力，從而證明該探針能夠穩(wěn)定地存 物體內(nèi)并準(zhǔn)4）L-DNAzymeL-DNAzymeD-DNAzymeDNaseIDNAzymeD-DNA（D-DNAzyme的底物鏈取代下來(lái)）L-DNAzyme探針能夠抵抗核酸酶降解（使用熒光和電泳兩種方法D型核酸干擾（使用熒光）以及抵抗非特異性蛋白質(zhì)的干擾（種方法）能力，從而證明該探針能夠穩(wěn)定地存 物體內(nèi)并準(zhǔn)4）L-DNAzymeL-DNAzyme 這兩種基質(zhì)中L-DNAzyme探針對(duì)銅離子改變的響應(yīng)效5）L-DNAzymeHeLaLDNAzymeL-DNAzyme3.2L-DNAL-DNA對(duì)L-DNAL-DNAL-DNAG-Quadruplex第1660006000及（4）本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處1）L-DNA3)L-DNA（5）60006000及（4）本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處1）L-DNA3)L-DNA（5）（活動(dòng)、國(guó)際合作與交流計(jì)劃等5.12015.1–2015.12L-DNAG-Quadruplex 的設(shè)計(jì)、構(gòu)建、條件優(yōu)化與體系評(píng)估2016.1–2016.12L-DNAi-的2017.1–2017.12:L-DNAzymeL-DNA像第175.2；2）2-3、高選擇性的生物分析方法5.02-33）1-24）2-3。（1）工作基礎(chǔ)（作成績(jī)工其教授首先，設(shè)計(jì)了氧化石墨烯保護(hù)的核酸分子探針用于復(fù)雜體系中miRNAmiRNA力DNaseI5.2；2）2-3、高選擇性的生物分析方法5.02-33）1-24）2-3。（1）工作基礎(chǔ)（作成績(jī)工其教授首先，設(shè)計(jì)了氧化石墨烯保護(hù)的核酸分子探針用于復(fù)雜體系中miRNAmiRNA力DNaseIDNAmiRNAA549及乳腺上皮細(xì)胞MCF-10AmiRNAChemicals（2012,48,194-196）30RNA第18VEGF10該工 在分析化學(xué)國(guó)yticalChemistry（2013,85,2269--機(jī)理，發(fā)展前景及不足之處（Chemistry-AEuropeanJournal,2013,19,10442-1041擾等特性 VEGF10該工 在分析化學(xué)國(guó)yticalChemistry（2013,85,2269--機(jī)理，發(fā)展前景及不足之處（Chemistry-AEuropeanJournal,2013,19,10442-1041擾等特性 5μM2470μMyticalChemistry（2012,84,5535–5541）（2）工作條件（包括已具備的實(shí)驗(yàn)條件，尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬的計(jì)劃與落實(shí)情況實(shí)驗(yàn)；申請(qǐng)人所在院系，湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析測(cè)試中心，擁有第19MALDI-TOFCDDNA點(diǎn)60006000水（3）承擔(dān)科研項(xiàng)目情況（申請(qǐng)人正在承擔(dān)或參加科研項(xiàng)目的情況MALDI-TOFCDDNA點(diǎn)60006000水（3）承擔(dān)科研項(xiàng)目情況（申請(qǐng)人正在承擔(dān)或參加科研項(xiàng)目的情況起止年月、與本項(xiàng)目的關(guān)系及負(fù)責(zé)的內(nèi)容等（4）完成自然科學(xué)基金項(xiàng)目情況（對(duì)申請(qǐng)人負(fù)責(zé)的前一個(gè)已結(jié)題學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目名稱及批準(zhǔn)號(hào)）第20科技部973核酸適體分的設(shè)計(jì)與生物標(biāo)志物的2010年12014年12核酸適體探針的優(yōu)項(xiàng)目參與國(guó)家自然基于功能化二氧化硅載藥納米粒的膠質(zhì)瘤靶向治療與成像 年月至201412納米顆粒與修飾項(xiàng)目參與國(guó)家自然科學(xué)基金特異性靶向肝細(xì)胞肝癌的核酸適配體篩選以及在正電子成 年月至201712核酸適配 飾項(xiàng)目參與要（限500字）和相關(guān)成果的詳細(xì)目錄：LiangCui,ZhiZhu*,NinghangLin,HuiminZhang,ZhichaoChaoyong*.“T7Exonuclease-AssistedCyclicMethodCoupledwithRollingCircle: .”Chemicals,50(13),要（限500字）和相關(guān)成果的詳細(xì)目錄：LiangCui,ZhiZhu*,NinghangLin,HuiminZhang,ZhichaoChaoyong*.“T7Exonuclease-AssistedCyclicMethodCoupledwithRollingCircle: .”Chemicals,50(13),1576-1578,LiangCui,GuoliangKe,XiaoyanLin,YanlingSong,HuiminZhichaoGuan,ZhiZhu*,Chaoyong.“Cyclic Method(CEAM)BasedonExonucleaseIIIforSensitiveysis.”Methods,63(3,202-211,LiangCui,YanlingSong,GuoliangKe,ZhichaoGuan,HuiminZhang,Lin,Huang,ZhiZhu*,andChaoyong*.Oxide-ProtectedNucleicAcidProbesforysisandChemistry-AEuropenJournal,19(32),10442-10451,LiangCui,ZirongChen,ZhiZhu,XiaoyanLin,XiChen,and*. ofssRNAon eneOxideSurface: RNAChemistry,85(4),2269-2275,LiangCui,YuanZou,NinghangLin,ZhiZhu,GarethJenkins,and*.“MassAmplifyingProbeforSensitiveFluorescenceofSmallMoleculesinComplexBiologicalChemistry,84(13),5535-5541,LiangCui,XiaoyanLin,NinghangLin,Yanl