中國藥品檢驗標準操作流程

中國藥品檢驗標準操作規(guī)程

2010年版

高效液相色譜法11、對儀器的一般要求所用儀器為高效液相色譜儀，由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和色譜數據處理系統(tǒng)組成，儀器應按現(xiàn)行國家技術監(jiān)督局“液相色譜儀檢定規(guī)程”定期檢定并符合有關規(guī)定。1.1色譜柱最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性添充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜使用離子交換填充劑；分子排阻色譜使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。

填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應選擇孔徑在15nm（1nm=10?）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應選擇孔徑在30nm以上的填料。除另有規(guī)定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在3～10μm之間，粒徑更?。s2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內徑約2mm）。使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當的調整。當對其測定的結果產生爭議時，應以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結果為準。以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40℃，為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60℃。流動相的PH值應控制在2～8之間。當pH大于8時，可使載體硅膠溶解；當pH小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統(tǒng)中需使用PH大于8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當需使用PH小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機-無機雜化填充劑等。1.2檢測器最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。.紫外、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與待測溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關；蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發(fā)光散色檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與待測物的質量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄待測物的吸收光譜，故可用于待測物的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與待測溶液的濃度在一定范圍內呈線性關系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應值與待測溶液的濃度通常呈指數關系，故進行計算時，一般需經對數轉換。不同的檢檢測器，，對流動動相的要要求不同同。如采采用紫外外檢測器器，所用用流動相相應符合合紫外—可見分光光光度法法（《中國藥典典》2010年版二部部附錄ⅣA）項下對對溶劑的的要求；；采用低低波長檢檢測時，，還應考考慮有機機相中有有機溶劑劑的截止止使用波波長，并并選用色色譜級有有機溶劑劑。蒸發(fā)發(fā)光散射射檢測器器和質譜譜檢測器器通常不不允許使使用含不不揮發(fā)鹽鹽組分的的流動相相。1.3流動相反相色譜譜系統(tǒng)的的流動相相首選甲甲醇-水系統(tǒng)（（采用紫紫外末端端波長檢檢測時，，首選乙乙腈-水系統(tǒng)）），如經經試用不不合適時時，再選選用其他他溶劑系系統(tǒng)。應應盡可能能少用含含有緩沖沖液的流流動相，，必須使使用時，，應盡可可能選用用含較低低濃度緩緩沖液的的流動相相。由于于C18鏈在水相相環(huán)境中中不易保保持伸展展狀態(tài)，，故對于于十八烷烷基硅烷烷鍵合硅硅膠為固固定相的的反相色色譜系統(tǒng)統(tǒng)，流動動相中有有機溶劑劑的比例例通常應應不低于于5%，否則C18鏈的隨機機卷曲將將導致組組分保留留值變化化，造成成色譜系系統(tǒng)不穩(wěn)穩(wěn)定。各品種項項下規(guī)定定的條件件除固定定相種類類、流動動相組成成、檢測測器類型型不得改改變外，，其余如如色譜柱柱內徑、、長度、、載體粒粒度、流流動相流流速、混混合流動動相各組組成的比比例、柱柱溫、進進樣量、、檢測器器的靈敏敏度等，，均可適適當改變變，以適適應供試試品并達達到系統(tǒng)統(tǒng)適用性性試驗的的要求。。其中，，調整流流動相組組分比例例時，以以組分比比例較低低者（小小于或等等于50%）相對于于自身的的改變量量不超過過±30%且相對于于總量的的改變量量不超過過±10%為限，如如30%相對改變變量的數數值超過過總量的的10%時，則改改變量以以總量的的±10%為限。對于必須須使用特特定牌號號的填充充劑方能能滿足分分離要求求的品種種，可在在該品種種項下注注明。2、系統(tǒng)適適用性試試驗色譜系統(tǒng)統(tǒng)的適用用性試驗驗通常包包括理論論板數、、分離度度、重復復性和拖拖尾因子子等四個個參數。。其中，，分離度度和重復復性尤為為重要。。按各品種種項下要要求對色色譜系統(tǒng)統(tǒng)進行適適用性試試驗，即即用規(guī)定定的對照照品溶液液或系統(tǒng)統(tǒng)適用性性試驗溶溶液在規(guī)規(guī)定的色色譜系統(tǒng)統(tǒng)進行試試驗，必必要時，，可對色色譜系統(tǒng)統(tǒng)進行調調整，以以符合要要求。2.1色譜柱的的理論板板數(n)。用于評價價色譜柱柱的分離離效能。。由于不不同物質質在同一一色譜柱柱上的色色譜行為為不同，，采用理理論板數數作為衡衡量柱效效能的指指標時，，應指明明測定物物質，一一般為待待測組分分或內標標物質的的理論板板數。在規(guī)定的的條件下下，注入入供試品品溶液或或各品種種項下規(guī)規(guī)定的內內標物質質溶液，，記錄色色譜圖，，量出供供試品主主成分峰峰或內標標物質峰峰的保留留時間tR（以分鐘鐘或長度度計，下下同，但但應取相相同單位位）和峰峰寬（W）半峰高高寬（Wh/2），按n＝16(tR/W)2或n=5.54(tR/Wh/2)2計算色譜譜柱的理理論板數數。2.2分離度（（R）用于評價價待測組組分與相相鄰共存存物或難難分離物物質之間間的分離離程度，，是衡量量色譜系系統(tǒng)效能能的關鍵鍵指標。。可以通通過測定定待測物物質與已已知雜質質的分離離度，也也可以通通過測定定待測組組分與某某一添加加的指標標性成分分（內標標物質或或其他難難分離物物質）的的分離度度，或將將供試品品或對照照品用適適當的方方法降解解，通過過測定待待測組分分與某一一降解產產物的分分離度，，對色譜譜系統(tǒng)進進行評價價與控制制。無論是定定性鑒別別還是定定量分析析，均要要求待測測峰與其其他峰、、內標峰峰或特定定的雜質質對照峰峰之間有有較好的的分離度度。除另另有規(guī)定定外，待待測組分分與相鄰鄰共存物物之間的的分離度度應大于于1.5。2.3重復性用于評價價連續(xù)進進樣后，，色譜系系統(tǒng)響應應值的重重復性能能。采用用外標法法時，通通常取各各品種項項下的對對照品溶溶液，連連續(xù)進樣樣5次，除另另有規(guī)定定外，其其峰面積積測量值值的相對對標準偏偏差應不不大于2.0％；采用用內標法法時，通通常配制制相當于于80％、100％和120％的對照照品溶液液，加入入規(guī)定量量的內標標溶液，，配成3種不同濃濃度的溶溶液，分分別至少少進樣2次，計算算平均校校正因子子，其相相對標準準偏差也也應不大大于2.0％。2.4拖尾因子子（T）用于評價價色譜峰峰的對稱稱性。為為保證分分離效果果和測量量精度，，應檢查查待測峰峰的拖尾尾因子是是否符合合各品種種項下的的規(guī)定。。拖尾因因子計算算公式為為：T＝W0.05h/2d1式中,W0.05h為5%峰高處的的峰寬；；d1為5%峰高出峰峰頂點至至峰前沿沿之間的的距離。。除另有規(guī)規(guī)定外，，峰高法法定量時時T應在0.95～1.05之間。峰面積法法測定時時，若拖拖尾嚴重重，將影影響峰面面積的準準確測量量。必要要時，應應在各品品種項下下對拖尾尾因子做做出規(guī)定定。3、測定法法3.1內標法按各品種種項下的的規(guī)定，，精密稱稱（量））取對照照品和內內標物質質，分別別配成溶溶液，精精密量取取各適量量，混合合配成校校正因子子測定用用的對照照溶液。。取一定定量注入入儀器，，記錄色色譜圖。。測量對對照品和和內標物物質的峰峰面積或或峰高，，按下式式計算校校正因子子校正因子子（?）＝（AS/CS）/(AR/CR)式中,AS為內標物物質的峰峰面積或或峰高；；AR為對照品品的峰面面積或峰峰高；CS為內標物物質的濃濃度；CR為對照品品的濃度度。再取各品品種項下下含有內內標物質質的供試試品溶液液，注入入儀器，，記錄色色譜圖，，測量供供試品中中待測成成分和內內標物質質的峰面面積或峰峰高，按按下式計計算含量量：含量（CX）＝?·AX/(A′′S／C′S)式中,Ax為供試品品峰面積積或峰高高；CX為供試品品的濃濃度；A′S為內標物物質的峰峰面積或或峰高；；C′S為內標物物質的濃濃度；?為較正因因子。采用內標標法，可可避免因因樣品前前處理及及進樣體體積誤差差對測定定結果的的影響。。3.2外標法按各品種種項下的的規(guī)定，，精密稱稱(量)取對照品品和供試試品，配配制成溶溶液，分分別精密密取一定定量，注注入儀器器，記錄錄色譜圖圖，測量量對照品品溶液和和供試品品溶液中中待測成成分的峰峰面積（（或峰高高），按按下式計計算含量量：含量（CX）＝CR(AX/AR)式中各符符號意義義同上。。由于微量量注射器器不易精精確控制制進樣量量，當采采用外標標法測定定供試品品中某成成分或雜雜質含量量時，以以定量環(huán)環(huán)或自動動進樣器器進樣為為好。3.3加校正因因子的主主成分自自身對照照法測定雜質質含量時時，可采采用加校校正因子子的主成成分自身身對照法法。在建建立方法法時，按按各品種種項下的的規(guī)定，，精密稱稱（量））取雜質質對照品品和待測測成分對對照品各各適量，，配制測測定雜質質校正因因子的溶溶液，進進樣，記記錄色譜譜圖，按按上述3.1法計算雜雜質的校校正因子子。此校校正因子子可直接接載入各各品種項項下，用用于校正正雜質的的實測峰峰面積。。這些需需作較正正計算的的雜質，，通常以以主成分分為參照照，采用用相對保保留時間間定位，，其數值值一并載載入各品品種項下下。測定雜質質含量時時，按各各品種項項下規(guī)定定的雜質質限度，，將供試試品溶液液稀釋成成與雜質質限度相相當的溶溶液作為為對照溶溶液，進進樣，調調節(jié)儀器器靈敏度度（以噪噪音水平平可接受受為限））或進樣樣量（以以柱子不不過載為為限），，使對照照溶液的的主成分分色譜峰峰高約達達滿量程程的10％～25％或其峰峰面積能能準確積積分【通常含量量低于0.5%的雜質，，峰面積積的相對對標準偏偏差（RSD）應小于于10%；含量在在0.5%～2%的雜質，，峰面積積的RSD應小于5%；含量大大于2%的雜質，，峰面積積的RSD應小于2%】。然后，，取供試試品溶液液和對照照品溶液液適量，，分別進進樣，供供試品溶溶液的記記錄時間間，除另另有規(guī)定定外，應應為主成成分色譜譜峰保留留時間的的2倍，測量量供試品品溶液色色譜圖上上各雜質質的峰面面積，分分別乘以以相應的的校正因因子后與與對照溶溶液主成成分的峰峰面積比比較，依依法計算算各雜質質含量。。3.4不加校正正因子的的主成分分自身對對照法測定雜質質含量時時，若沒沒有雜質質對照品品，也可可采用不不加校正正因子的的主成分分自身對對照法。。同上述述3.3法配制對對照溶液液并調節(jié)節(jié)檢測靈靈敏度后后，取供供試品溶溶液和對對照溶液液適量，，分別進進樣，前前者的記記錄時間間除另有有規(guī)定外外，應為為主成分分保留時時間的2倍，測量量供試品品溶液色色譜圖上上各雜質質的峰面面積并與與對照溶溶液主成成分的峰峰面積比比較，計計算雜質質含量。。若供試品品所含的的部分雜雜質未與與溶劑峰峰完全分分離，則則按規(guī)定定先記錄錄供試品品溶液的的色譜圖圖Ⅰ，再記錄錄等體積積純溶劑劑的色譜譜圖Ⅱ。色譜圖圖Ⅰ上雜質峰峰的總面面積（包包括溶劑劑峰），，減去色色譜圖Ⅱ上的溶劑劑峰面積積，即為為總雜質質峰的校校正面積積。然后后依法計計算。3.5面積歸一一法按各品種種項下的的規(guī)定，，配制供供試品溶溶液，取取一定量量注入儀儀器，記記錄色譜譜圖。測測量各峰峰的面積積和色譜譜圖上除除溶劑峰峰以外的的總色譜譜峰面積積，計算算各峰面面積占總總峰面積積的百分分率。用于雜質檢檢查時，由由于峰面積積歸一化法法測定誤差差大，因此此，通常只只用于粗略略考察供試試品中的雜雜質含量。。除另有規(guī)規(guī)定外，一一般不宜用用于微量雜雜質的檢查查。4、注意事項項4.1流動相的制制備與保存存用高純度的的試劑配制制流動相，，必要時照照紫外-可見分光光光度法進行行溶劑檢查查，應符合合要求；水水應為新鮮鮮制備的高高純水，可可用超純水水器制得或或用重蒸水水。凡規(guī)定定pH值的流動相相，應使用用精密pH計進行調節(jié)節(jié)，除另有有規(guī)定外，，偏差一般般不超過±0.2pH單位。配制制好的流動動相應通過過適宜的0.45μμm（或0.22μμm)濾膜濾過，，以除去雜雜質微粒。。流動相用用前必須脫脫氣，否則則容易在系系統(tǒng)內逸出出氣泡，影影響泵的工工作、色譜譜柱的分離離效率、檢檢測器的靈靈敏度以及及基線穩(wěn)定定性等。流動相一般般貯存于玻玻璃、聚四四氟乙烯等等容器內，，不能貯存存在塑料容容器中。因因許多有機機溶劑如甲甲醇、乙腈腈等可浸出出塑料表面面的增塑劑劑，導致流流動相受污污染。貯存存溶劑一定定要蓋嚴，，以防止溶溶劑揮發(fā)引引起組成變變化，也防防止氧和二二氧化碳溶溶入流動相相引起pH值變化，對對分離或分分析結果帶帶來誤差。。磷酸鹽、、醋酸鹽緩緩沖液容易易發(fā)霉變質質，應盡量量新鮮配制制使用。如如確需貯存存，可在冰冰箱內冷藏藏，并在3天內使用，，用前應重重新濾過。。4.2溶劑的配制制與保存除另有規(guī)定定外，采用用規(guī)定溶劑劑配制對照照品溶液和和供試品溶溶液，定量量測定時，，對照品溶溶液和供試試品溶液均均應分別配配制兩份。。供試品溶溶液在注入入液相色譜譜儀前，一一般應經適適宜的0.45μμm（或0.22μμm)濾膜濾過，，以減少對對色譜系統(tǒng)統(tǒng)產生污染染或影響色色譜分離。。應根據試試驗要求和和供試品的的穩(wěn)定性，，設置待測測溶液的貯貯存條件（（如溫度、、遮光等））。4.3色譜柱的使使用與保存存根據實驗要要求和流動動相的pH值范圍，參參照色譜柱柱說明書，，選用適宜宜的色譜柱柱。安裝色色譜柱時應應使流動相相流路的方方向與色譜譜柱標簽上上箭頭所示示方向一致致。除另有有規(guī)定外，，不宜反向向使用，否否則會導致致色譜柱柱柱效明顯降降低，無法法恢復。進進樣前，色色譜柱應用用流動相充充分沖洗平平衡。經色色譜系統(tǒng)適適用性試驗驗測試，應應符合要求求。色譜柱在使使用過程中中，應避免免壓力和溫溫度的急劇劇變化及任任何機械震震動。溫度度的突然變變化或者機機械震動都都會影響柱柱內定相的的填充狀況況；柱壓的的突然升高高或降低也也會沖動柱柱內填料，，因此在調調節(jié)流動相相流速時應應該緩慢進進行。試驗結束后后，可按色色譜柱的使使用說明書書，對色譜譜柱進行沖沖洗和保存存。一般來講，，對于反相相色譜柱，，如使用緩緩沖液或含含鹽溶液作作為流動相相，在試驗驗結束后，，應用10倍柱體積（（如150mm柱長，約15ml）的低濃度度的甲醇/乙腈-水溶液（10%～20%）沖洗，使使色譜柱內內的鹽完全全溶解洗脫脫出，再用用較高濃度度的甲醇/乙腈-水溶液（50%）沖洗，最最后用高濃濃度的甲醇醇/乙腈-水溶液（80%～100%）沖洗，使使色譜柱中中的強吸附附物質沖洗洗出來。如色譜柱需需長期保存存，反相柱柱可以貯存存于甲醇或或乙腈中，，正相柱可可以貯存于于經脫水處處理后的正正己烷中，，離子交換換柱可以貯貯存于含5%甲醇或含0.05%疊氮化納的的水中，并并將色譜柱柱兩端密封封，以免干干燥，室溫溫保存。4.4流動相的調調整為滿足色譜譜柱系統(tǒng)適適用性要求求，試驗中中有時需要要調整流動動相組分的的比例。在在調整流動動相組分比比例時，以以組分比例例較低者（（小于或等等于50%）相對改變變量不超過過±30%且絕對改變變量不超過過±10%為限，如30%相對改變量量的數值超超過10%時，則改變變量以±10%為限。下面面舉例說明明。4.4.1二元流動相相系統(tǒng)例1兩組分比例例為50：50按上述原則則，50%的最大相對對該變量為為15%，已超過了了絕對改變變量允許的的范圍，故故該流動相相比例調節(jié)節(jié)的范圍是是±10%，即40：60至60:40。例2兩組分比例例為2:98按上述原則則，2%的最大相對對改變量為為0.6%，故該流動動相比例調調節(jié)的范圍圍是1.4:98.6至2.6:97.4。4.4.2三元流動相相系統(tǒng)例3三組分比例例為60:35:5按上述原則則，可每次次調節(jié)流動動相系統(tǒng)中中比例較低低的兩個組組分。對于35%的組分，其其最大相對對改變量為為10.5%，已超過了了絕對該變變量允許的的范圍，故故該組分比比例調節(jié)的的范圍是±10%，即25%～45%，則流動相相系統(tǒng)比例例的調節(jié)范范圍是50:45:5至70:25:5。對于5%的組分，其其最大相對對改變量為為1.5%，該組分比比例調節(jié)的的范圍是±1.5%，即3.5%～6.5%，則流動相相系統(tǒng)比例例的調節(jié)范范圍是58.5:35:6.5至61.5:35:3.5。4.5雜質檢查查時色譜譜參數的的設置在進行雜雜質檢查查時，選選擇適宜宜的檢測測靈敏度度和設定定適宜的的積分參參數非常常重要。。國內藥藥品質量量標準中中，通常常制備與與雜質限限度相當當濃度的的