融合蛋白及其應(yīng)用課件

融合蛋白及其應(yīng)用融合蛋白及其應(yīng)用1主要內(nèi)容融合蛋白的概念融合蛋白技術(shù)概況融合蛋白技術(shù)的臨床應(yīng)用常見的幾種融合蛋白主要內(nèi)容融合蛋白的概念2一、融合蛋白的概念

在基因工程迅速發(fā)展的基礎(chǔ)上，有目的地把兩段或多段編碼功能蛋白的基因連接在一起，進(jìn)而表達(dá)所需蛋白，這種通過在人工條件下將兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾連接，由同一調(diào)控序列控制構(gòu)成的基因表達(dá)后所得的蛋白質(zhì)產(chǎn)物稱為融合蛋白(fusionprotein，F(xiàn)P)。一、融合蛋白的概念在基因工程迅速發(fā)展的基3二、融合蛋白技術(shù)概況

融合蛋白技術(shù)是為獲得大量標(biāo)準(zhǔn)融合蛋白而進(jìn)行的有目的性的基因融合和蛋白表達(dá)方法。利用融合蛋白技術(shù)，可構(gòu)建和表達(dá)具有多種功能的新型目的蛋白。二、融合蛋白技術(shù)概況融合蛋白技術(shù)是為4（一）融合蛋白技術(shù)的特點(diǎn)融合基因可在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)也可在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)是時(shí)程短，費(fèi)用低，是科研中的主要工具。其缺點(diǎn)是真核蛋白表達(dá)沒有得到確切修飾；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵體聚合物，需要復(fù)雜的變性和復(fù)性過程；大量蛋白的分泌較困難。（一）融合蛋白技術(shù)的特點(diǎn)融合基因可在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)5（一）融合蛋白技術(shù)的特點(diǎn)真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)是蛋白翻譯后加工機(jī)會(huì)多，甚至可被改造成人源型；真核細(xì)胞易被轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性；產(chǎn)物可被分泌，提純簡單，成本低。

（一）融合蛋白技術(shù)的特點(diǎn)真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)是蛋白翻譯后加工機(jī)6（二）融合蛋白技術(shù)的內(nèi)容構(gòu)建融合蛋白的基本原則是，將第一個(gè)蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白基因，以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的共同表達(dá)。具體步驟有：1.進(jìn)行目的基因的克?。焊鶕?jù)基因序列互補(bǔ)原則，設(shè)計(jì)合適的引物序列，以cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的目的DNA片段。（二）融合蛋白技術(shù)的內(nèi)容構(gòu)建融合蛋白的基本原則是，將第一個(gè)7（二）融合蛋白技術(shù)的內(nèi)容2.在載體中進(jìn)行重組：通過限制內(nèi)切酶將兩個(gè)DNA片段進(jìn)行酶切并回收，然后通過連接酶將兩個(gè)具有相同末端酶切位點(diǎn)的基因片段進(jìn)行體外連接，并克隆到高表達(dá)質(zhì)粒載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。（二）融合蛋白技術(shù)的內(nèi)容2.在載體中進(jìn)行重組：通過限制內(nèi)切酶8（二）融合蛋白技術(shù)的內(nèi)容3.將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并利用選擇標(biāo)志進(jìn)行篩選及測序。4.融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)蛋白的純化。（二）融合蛋白技術(shù)的內(nèi)容3.將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并利用9（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵在構(gòu)建融合蛋白中，一個(gè)關(guān)鍵的問題是兩蛋白間的接頭序列(Linker)，即連接肽。它的長度對蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性非常重要。如果接頭序列太短，可能影響兩蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊，從而相互干擾；如果接頭序列太長，又涉及免疫原性的問題，因?yàn)榻宇^序列本身就是新的抗原。（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵在構(gòu)建融合蛋白中，一個(gè)關(guān)鍵的問題是兩10（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵

一般來說，3-5個(gè)氨基酸的Linker可滿足大部分融合蛋白的正確折疊的要求。有人嘗試在融合蛋白間加入一段有疏水性和一定伸展性的較長肽鏈，如(Gly4Ser1)，目的是將兩者分開，以緩解相互干擾作用，并獲得了滿意的結(jié)果。（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵一般來說，3-5個(gè)氨基酸的Li11（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵

但具體涉及到每種蛋白時(shí)，需具體分析。當(dāng)我們構(gòu)建融合蛋白時(shí)，應(yīng)多選擇幾種融合方式，從中優(yōu)化出理想的連接方式。另外，大量研究表明連接肽的柔性和疏水性對不擾亂蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域是十分重要的。（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵但具體涉及到每種蛋白時(shí)，需具體分析12（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵遺憾的是，目前對于連接肽序列的設(shè)計(jì)還沒有可靠的選擇標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)在，大多數(shù)連接肽序列的設(shè)計(jì)和選擇仍主要依賴于直覺。盡管依賴于蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)來預(yù)測其二級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)產(chǎn)生了重大的進(jìn)步，但是我們對于序列和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系的了解還是很有限的。（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵遺憾的是，目前對于連接肽序列的設(shè)計(jì)還13三、融合蛋白技術(shù)的臨床

應(yīng)用DNA疫苗雙功能酶（多功能酶）定向藥物溶栓劑抗菌肽三、融合蛋白技術(shù)的臨床

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（一）DNA疫苗

目前，疫苗已經(jīng)經(jīng)歷了三代：第一代疫苗是用減毒或殺死的病原體來激活機(jī)體免疫系統(tǒng)；第二代疫苗是用生物技術(shù)和重組DNA技術(shù)研制的組分疫苗注射機(jī)體誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；第三代疫苗是直接注射基因重組的抗原基因來激活人體免疫系統(tǒng)，即DNA疫苗。（一）DNA疫苗目前，疫苗15

（一）DNA疫苗DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯的優(yōu)勢，如易于生產(chǎn)，穩(wěn)定性強(qiáng)，成本低廉等，并可同時(shí)誘導(dǎo)體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答。（一）DNA疫苗DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯16

（一）DNA疫苗DNA疫苗的免疫方法是將帶有目的基因并能在真核細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)菌質(zhì)粒直接導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，通過在體內(nèi)表達(dá)目的蛋白以引起機(jī)體對該蛋白的免疫應(yīng)答。

（一）DNA疫苗DNA疫苗的免疫方法是將帶有目17

（一）DNA疫苗目前利用基因工程成功制成的多價(jià)重組抗體融合蛋白CYF196(國內(nèi)尚未上市)就是一種DNA疫苗，它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因?yàn)镃YF196對病毒的主要受體-位于呼吸道上皮中的細(xì)胞間黏附分子有高度親和力，對鼻病毒感染有較強(qiáng)的防御功能。（一）DNA疫苗目前利用基因工程成功制成的多價(jià)18（二）雙功能酶（多功能酶）

以往研究發(fā)現(xiàn)，在利用基因融合所構(gòu)建的大的酶分子中，如果用以構(gòu)成融合蛋白的各個(gè)酶分子的整個(gè)編碼序列均保留于新的酶分子中，則融合蛋白一般均保留所構(gòu)成的酶分子各自的酶活性。（二）雙功能酶（多功能酶）以往研究發(fā)現(xiàn)19（二）雙功能酶（多功能酶）

并且發(fā)現(xiàn)在這些新構(gòu)建的融合蛋白中，蛋白的正確折疊以及各個(gè)酶的活性部位均未受到影響，與單個(gè)酶相比，融合蛋白的酶的比活力為50%-100%，對于催化連續(xù)反應(yīng)的兩種或幾種酶，利用基因融合的方法構(gòu)成的融合蛋白可產(chǎn)生“鄰近效應(yīng)”（proximityeffect）。（二）雙功能酶（多功能酶）并且發(fā)現(xiàn)在這些新20（二）雙功能酶（多功能酶）目前研究發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶-半乳糖脫氫酶融合蛋白在一定條件下，其偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生NADH的速度是同時(shí)加入這兩種酶的反應(yīng)速度的兩倍以上。同時(shí)過渡態(tài)時(shí)間縮短近四倍。（二）雙功能酶（多功能酶）目前研究發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶-半21（三）定向藥物定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結(jié)合的配基。通過融合蛋白技術(shù)將這兩部分融合在一起，即可構(gòu)成一個(gè)具有獨(dú)特構(gòu)象與功能的蛋白質(zhì)。（三）定向藥物定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部22（三）定向藥物特點(diǎn)：它可以特異性地與靶細(xì)胞或致病因子結(jié)合，并把藥物引導(dǎo)至病灶處，從而大大提高藥物的效力。可以選擇性地殺傷相應(yīng)的抗原相關(guān)細(xì)胞或受體相關(guān)細(xì)胞，對其他無關(guān)細(xì)胞影響較少或無影響。（三）定向藥物特點(diǎn)：它可以特異性地與靶細(xì)胞或致病因子結(jié)合，并23（三）定向藥物配基常是腫瘤特異性抗體、細(xì)胞因子或激素等導(dǎo)向物質(zhì)，藥物常是毒性分子（如動(dòng)植物毒素、放療、化療藥物或細(xì)菌毒素等）。

（三）定向藥物配基常是腫瘤特異性抗體、細(xì)胞因子或激素等導(dǎo)向物24（四）溶栓劑新型溶栓劑的要求是具有多種功能，既有較高的溶栓活性，又有較強(qiáng)的纖維蛋白的親和性或抑制血栓的功能，從而使溶栓劑具有較高的纖維蛋白專一性，減少出血副作用，降低溶栓藥物使用后再栓塞形成的可能性。（四）溶栓劑新型溶栓劑的要求是具有多種功能，既有較高的溶栓活25（四）溶栓劑

凝血酶在血小板激活后促進(jìn)纖維蛋白酶原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，在凝血過程中起主要作用，在動(dòng)物模型和人體中，肝素是凝血酶間接抑制劑，水蛭素則是其直接抑制劑。單克隆抗體mAb59D能靶向血塊，mAb59D8與纖溶酶原活化因子偶合能達(dá)到靶向治療和有效溶栓的目的。（四）溶栓劑凝血酶在血小板激活后促進(jìn)纖維26（四）溶栓劑但兩者化學(xué)結(jié)合不僅產(chǎn)量低，而且在生產(chǎn)過程中部分損失了水蛭素的溶栓活性。利用基因融合技術(shù)，把水蛭素和mAb59D8的纖維蛋白原片段融合，融合蛋白在穩(wěn)態(tài)時(shí)無作用，只有用凝血酶原激酶(Ax)對它進(jìn)行切割激活后，才有活性。（四）溶栓劑但兩者化學(xué)結(jié)合不僅產(chǎn)量低，而且在生產(chǎn)過程中部分損27（四）溶栓劑利用分子克隆技術(shù)，這種融合蛋白能成功轉(zhuǎn)錄并高效表達(dá)于59D8雜交瘤細(xì)胞系，這種策略結(jié)合了靶向溶栓和Ax因子激活，有效地在血栓處發(fā)揮作用，對全身的副作用很小。（四）溶栓劑利用分子克隆技術(shù)，這種融合蛋白能成功轉(zhuǎn)錄并高28（五）抗菌肽肽類抗生素又名抗菌肽，機(jī)體天然產(chǎn)生的抗菌肽由于其對耐藥菌的強(qiáng)大抗菌作用而受到人們關(guān)注。它廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，是由生物體特定基因編碼的一類陽離子小分子多肽，具有廣譜抗菌活性，是機(jī)體天然免疫的重要組成部分。（五）抗菌肽肽類抗生素又名抗菌肽，機(jī)體天然產(chǎn)生的抗菌肽由于其29（五）抗菌肽研究結(jié)果表明，抗菌肽可以在亞毒性濃度下抑制HIV-1的基因表達(dá)，減少HIV-1的增殖。而人源溶菌酶除了具有一般溶菌酶的抗菌活性外，也具有抗病毒的特性，已有研究證實(shí)人源溶菌酶具有抗HIV-1的作用。（五）抗菌肽研究結(jié)果表明，抗菌肽可以在亞毒性濃度下抑制HI30（五）抗菌肽目前已有人構(gòu)建了抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白表達(dá)載體。并成功表達(dá)出了具有抗菌和抗病毒雙重活性的重組蛋白。（五）抗菌肽目前已有人構(gòu)建了抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白表達(dá)31四、常見的幾種融合蛋白

（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白（二）甲狀旁腺激素（PTH）融合蛋白（三）細(xì)胞因子重組融合蛋白四、常見的幾種融合蛋白（一）32（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白Ig融合蛋白是指在基因水平將目的基因同Ig部分片段基因相連，并在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)出的具有上述兩部分結(jié)構(gòu)域的重組蛋白。據(jù)目的蛋白與Ig不同片斷相連，可將其分為二大類：一類為Fab(Fv)融合蛋白；另一類為Fc融合蛋白。

（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白Ig融合蛋白是指在基因水平將331、Fab(Fv)融合蛋Fab(Fv)融合蛋白主要是將Fab(Fv)段與其他生物活性蛋白結(jié)合，利用抗體對抗原的特異識(shí)別功能將活性蛋白導(dǎo)向特定部位。使活性蛋白在特定部位發(fā)揮生物作用。常見的與Fab融合的蛋白有毒素、細(xì)胞因子、受體、酶等。1、Fab(Fv)融合蛋Fab(Fv)融合蛋白主要是將34腫瘤靶向免疫治療將一些生物活性蛋白(如毒素、細(xì)胞因子等)與抗腫瘤抗體的Fab段融合，利用抗體對腫瘤抗原的識(shí)別作用而進(jìn)行靶向免疫治療。腫瘤靶向免疫治療將一些生物活性蛋白(如毒素、細(xì)胞因子等)與35腫瘤靶向免疫治療如ForsbergG等利用抗癌胚抗原(CEA)抗體的Fab段與葡萄球菌腸毒素(SEA)融合組成一個(gè)超抗原，融合超抗原可導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞并激活T細(xì)胞殺死表達(dá)有癌胚抗原腫瘤細(xì)胞。腫瘤靶向免疫治療如ForsbergG等利用抗癌胚抗原(C36腫瘤靶向免疫治療而將T細(xì)胞共刺激分子B7與抗瘤抗體結(jié)合就可將B7導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞。B7-抗瘤抗體，一方面與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合，一方面提供共刺激信號(hào)給T細(xì)胞能有效觸發(fā)腫瘤特異細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)。腫瘤靶向免疫治療而將T細(xì)胞共刺激分子B7與抗瘤抗體結(jié)合就可將372、Fc融合蛋白Fc融合蛋白主要是將生物活性蛋白與Ig的絞鏈區(qū)及CH2、CH3區(qū)結(jié)合。與Fc段融合的蛋白種類很多，其作用也各不相同，歸納起來有如下幾方面：2、Fc融合蛋白Fc融合蛋白主要是將生物活性蛋白與Ig的絞38（1）抗病毒感染目前發(fā)現(xiàn)使用DNA疫苗加上IL-2-Ig融合蛋白注射到實(shí)驗(yàn)用的恒河猴，然后高劑量靜脈內(nèi)給恒河猴注射SHIV病毒。雖然它們不能阻止猴被SHIV病毒感染，但確實(shí)可控制病毒血癥到幾乎測不到的水平，并預(yù)防免疫缺陷和臨床癥狀。（1）抗病毒感染目前發(fā)現(xiàn)使用DNA疫苗加上IL-2-Ig融39（1）抗病毒感染目前IL-2已用于臨床治療HIV和癌癥，但由于IL-2在活體內(nèi)半衰期短，有毒性作用及成本高，其臨床治療作用受限。而用IL2-Ig融合蛋白，它有IL-2的免疫刺激活性且半衰期長，用它注入健康恒河猴可誘導(dǎo)T細(xì)胞數(shù)目增加并表達(dá)CD25。（1）抗病毒感染目前IL-2已用于臨床治療HIV和癌癥，但由40（2）治療痛覺過敏Etanercept，一個(gè)重組TNFR-Fc融合蛋白，可競爭性抑制TNF，它已成功用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人，能減少疼痛和炎癥，在神經(jīng)損傷后，由于局部產(chǎn)生前炎性細(xì)胞因子對疼痛產(chǎn)生起一個(gè)主要作用。給坐骨神經(jīng)慢性壓縮性損傷的鼠注射Etanercept可減少熱痛覺過敏和機(jī)械性異常性疼痛。（2）治療痛覺過敏Etanercept，一個(gè)重組TNF41（2）治療痛覺過敏實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)豬神經(jīng)根損傷，同時(shí)給豬注射Etanercept7天后顯示Etanercept能預(yù)防神經(jīng)傳導(dǎo)速度的減低，限制神經(jīng)纖維損傷，防止毛細(xì)血管內(nèi)血栓和神經(jīng)內(nèi)水腫形成。預(yù)示Etanercept可用于治療椎間盤突出和坐骨神經(jīng)痛。（2）治療痛覺過敏實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)豬神經(jīng)根損傷，同時(shí)給豬注射Et42（3）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一個(gè)系統(tǒng)性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥反應(yīng)為特征并有軟骨變性和關(guān)節(jié)旁骨的侵蝕。（3）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一個(gè)系統(tǒng)43（3）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療已知TNF與RA的發(fā)病機(jī)理有很大關(guān)系，許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)用人可溶性重組TNF受體與IgFc段蛋白融合可完全競爭性抑制TNF結(jié)合到細(xì)胞表面受體，使TNF無生物活性。給病人注射Etanercept可減少關(guān)節(jié)腫脹及炎癥，減少關(guān)節(jié)腔狹窄。臨床上已用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。（3）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療已知TNF與RA的發(fā)病機(jī)理有很大關(guān)44（4）用于其他科學(xué)研究融合蛋白還可以作為一種研究工具應(yīng)用于許多方面的研究，如人表皮生長因子受體2蛋白(HER2)向上調(diào)節(jié)血管促白細(xì)胞生成素(Ang-2)的表達(dá)，而利用酪氨酸蛋白激酶受體-2-Fc(Tie-2/Fc)融合蛋白將減少腫瘤細(xì)胞釋放血管促白細(xì)胞生成素，這樣就可研究HER2對微血管的折除(dismantle)作用。（4）用于其他科學(xué)研究融合蛋白還可以作為一種研究工具應(yīng)用于45（二）PTH融合蛋白甲狀旁腺激素(ParathyroidHormone，PTH)是由甲狀旁腺主細(xì)胞合成和分泌的一種單鏈多肽激素，成熟PTH含84個(gè)氨基酸殘基，分子量約為9500，是人體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷代謝及骨轉(zhuǎn)換的最為重要的激素之一。它主要通過作用于靶細(xì)胞膜上腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，增加胞漿內(nèi)cAMP及焦磷酸鹽(PPi)的水平來發(fā)揮作用。（二）PTH融合蛋白甲狀旁腺激素(Parathyroid46蛋白類藥物的分子量若小于20kD在代謝過程中易被腎小球?yàn)V過，且在體內(nèi)的半衰期較短，皮下給藥或肌肉注射的半衰期一般在12h左右。因此，長效蛋白藥物的研制已成為對第一代基因工程產(chǎn)品進(jìn)行二次開發(fā)的一個(gè)重要方向，而增加分子量則是一個(gè)通用的策略。人們已經(jīng)采用多種方法來對PTH的性質(zhì)進(jìn)行改進(jìn)，以在保留它的活性的同時(shí)提高半衰期。其中包括構(gòu)建突變體、化學(xué)修飾以及基因融合等，而基因融合技術(shù)為最突出的。蛋白類藥物的分子量若小于20kD在代謝過程中易被腎小球?yàn)V過47常用的融合蛋白的載體有人血清白蛋白(Humaserumalbumin，HSA)融合蛋白、β-半乳糖苷酶融合蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白以及硫氧還蛋白(Trx)融合蛋白等。而人血清白蛋白(HSA)則由于本身特殊的優(yōu)點(diǎn)，更適合于充當(dāng)長效融合蛋白類藥物的融合載體。常用的融合蛋白的載體有人血清白蛋白(Humaseru48HSA是包含585個(gè)氨基酸殘基的單鏈無糖基化的球形蛋白質(zhì)，分子量65kD。它是人血漿中含量最高的單一蛋白質(zhì)(達(dá)40g/L)，在體內(nèi)有維持血液滲透壓，運(yùn)輸營養(yǎng)和其它重要生物物質(zhì)的作用。HSA本身是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體。藥物和血清白蛋白結(jié)合后。可以減少其生物利用度，增加在體內(nèi)的半衰期至19d之久。HSA是包含585個(gè)氨基酸殘基的單鏈無糖基化49人血清白蛋白融合技術(shù)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，包括：HSA與目標(biāo)蛋白在胞內(nèi)經(jīng)蛋白翻譯系統(tǒng)通過肽鍵連接，不需額外的體外處理；HSA表達(dá)水平較高，融合后可以提高目的蛋白的表達(dá)水平；HSA是一個(gè)穩(wěn)定的“惰性”蛋白，融合后可以提高目的蛋白的穩(wěn)定性；HAS融合蛋白具有比PEG修飾的蛋白藥物更長的半衰期。人血清白蛋白融合技術(shù)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，包括50（三）細(xì)胞因子重組融合蛋白細(xì)胞因子重組融合蛋白是一類利用基因工程的方法將編碼細(xì)胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列連接并表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)融合產(chǎn)物。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為將細(xì)胞因子功能活性域與其他分子的活性域融合，各組分可發(fā)揮協(xié)同作用，使融合蛋白的生物學(xué)活性較各單體大大增強(qiáng)。（三）細(xì)胞因子重組融合蛋白細(xì)胞因子重組融合蛋白是一類利用基因51按生物學(xué)功能的不同可分為：細(xì)胞因子與抗體的融合蛋白、細(xì)胞因子與毒素的融合蛋白、不同細(xì)胞因子的融合蛋白、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的融合蛋白以及細(xì)胞因子與其他分子的融合蛋白。這些兼具特異性與高效性的新型重組融合蛋白有些已走向臨床，在抗腫瘤、抗風(fēng)濕病、抗HIV感染等領(lǐng)域發(fā)揮作用，為人類疾病的治療提供新的手段。

按生物學(xué)功能的不同可分為：細(xì)胞因子與抗體521、細(xì)胞因子與毒素的融合蛋白在一些腫瘤細(xì)胞表面存在許多細(xì)胞因子受體，可利用細(xì)胞因子作為靶向載體將細(xì)胞毒素運(yùn)送到腫瘤微環(huán)境以殺傷腫瘤細(xì)胞。白喉毒素與細(xì)胞因子的重組融合蛋白便是這樣一類能直接殺傷靶細(xì)胞的免疫制劑。1、細(xì)胞因子與毒素的融合蛋白在一些腫瘤細(xì)胞表面存在許多細(xì)胞因53體外試驗(yàn)表明，白喉毒素-IL-2的融合蛋白(DAB389IL-2)對表達(dá)高親和力IL-2受體的細(xì)胞株起毒性作用，而缺乏完整的高親和力受體的細(xì)胞株(有p55亞單位而無p75亞單位)則對該融合毒素相對耐受。細(xì)胞結(jié)合該融合毒素后，可觀察到類似于IL-2刺激之后的情況，即IL-2、IL-2受體的mRNA的表達(dá)增高，蛋白合成在4-6h內(nèi)開始受抑制，繼發(fā)的凋亡則在40-72h內(nèi)發(fā)生。體外試驗(yàn)表明，白喉毒素-IL-2的融合蛋白(DAB389I54Saleh等報(bào)道DAB389IL-2在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(cutaneousTcelllymphoma，CTCL)1期臨床試驗(yàn)中單獨(dú)使用顯示出顯著的臨床治療效果。DAB389IL-2已成為美國食品與藥品管理局(FDA)核準(zhǔn)的臨床治療藥物。

Saleh等報(bào)道DAB389IL-2在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(c552、細(xì)胞因子與細(xì)胞因

子受體的融合蛋白通過將在體內(nèi)發(fā)揮作用時(shí)相互依賴或者所具有的協(xié)同作用細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體基因重組，可大大促進(jìn)其生物學(xué)活性的發(fā)揮。IL-6在肝細(xì)胞的增殖中起著增強(qiáng)作用。IL-6和IL-6Rα(gp80)的結(jié)合使其易于和另一個(gè)受體IL-6Rβ(gpl30)結(jié)合。2、細(xì)胞因子與細(xì)胞因

子受體的融合蛋白通過將在體內(nèi)56Fischer等用基因重組的方法構(gòu)建了一種IL-6-slL-6R融合蛋白hyper-IL-6。在gpl30細(xì)胞上，該融合蛋白表現(xiàn)出了完全的生物學(xué)活性，而所需濃度僅為非融合形式的IL-6和slL-6R的100至1000分之一，因而被用于在體外有效的擴(kuò)增造血祖細(xì)胞，且該作用具有劑量依賴關(guān)系。進(jìn)一步的大鼠體內(nèi)試驗(yàn)表明，hyper-IL-6可逆轉(zhuǎn)亞致死性或致死性肝毒性損傷，且此作用不可被IL-6替代。Fischer等用基因重組的方法構(gòu)建了一種IL-6-slL573、細(xì)胞因子與其他

分子的融合蛋白細(xì)胞因子還被設(shè)計(jì)與其他生物活性分子如某些腫瘤相關(guān)抗原，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的相關(guān)分子等融合。Aqeilan等報(bào)道了一個(gè)新的人融合蛋白IL-2-Bax用于靶向治療。Bax屬于Bcl-2蛋白家族，為促凋亡因子。3、細(xì)胞因子與其他

分子的融合蛋白細(xì)胞因子還被設(shè)計(jì)58誘導(dǎo)Bax表達(dá)便可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡而不需要附加的細(xì)胞死亡刺激信號(hào)，且通過凋亡途徑殺傷靶細(xì)胞可使組織損傷和全身性反應(yīng)降至最低。研究表明，該融合蛋白介導(dǎo)的靶細(xì)胞凋亡呈劑量依賴關(guān)系。靶向性細(xì)胞因子和凋亡蛋白融合產(chǎn)物在體內(nèi)及體外可選擇性殺傷特定類型細(xì)胞，開創(chuàng)了疾病靶向治療新視野。誘導(dǎo)Bax表達(dá)便可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡而不需要附加的細(xì)胞死亡刺激信59目前，細(xì)胞因子融舍蛋白在腫瘤治療研究中取得了很大進(jìn)展，已成為細(xì)胞因子研究中的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域。由于機(jī)體很多功能是由細(xì)胞因子共同作用、相互協(xié)調(diào)完成的。因此，雙因子的協(xié)同作用能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞因子與其它功能分子之間作用的優(yōu)化，為腫瘤治療提供了新的途徑。目前，細(xì)胞因子融舍蛋白在腫瘤治療研究中取得了很大進(jìn)展，60

THANKYOU

61融合蛋白及其應(yīng)用融合蛋白及其應(yīng)用62主要內(nèi)容融合蛋白的概念融合蛋白技術(shù)概況融合蛋白技術(shù)的臨床應(yīng)用常見的幾種融合蛋白主要內(nèi)容融合蛋白的概念63一、融合蛋白的概念

在基因工程迅速發(fā)展的基礎(chǔ)上，有目的地把兩段或多段編碼功能蛋白的基因連接在一起，進(jìn)而表達(dá)所需蛋白，這種通過在人工條件下將兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾連接，由同一調(diào)控序列控制構(gòu)成的基因表達(dá)后所得的蛋白質(zhì)產(chǎn)物稱為融合蛋白(fusionprotein，F(xiàn)P)。一、融合蛋白的概念在基因工程迅速發(fā)展的基64二、融合蛋白技術(shù)概況

融合蛋白技術(shù)是為獲得大量標(biāo)準(zhǔn)融合蛋白而進(jìn)行的有目的性的基因融合和蛋白表達(dá)方法。利用融合蛋白技術(shù)，可構(gòu)建和表達(dá)具有多種功能的新型目的蛋白。二、融合蛋白技術(shù)概況融合蛋白技術(shù)是為65（一）融合蛋白技術(shù)的特點(diǎn)融合基因可在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)也可在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)是時(shí)程短，費(fèi)用低，是科研中的主要工具。其缺點(diǎn)是真核蛋白表達(dá)沒有得到確切修飾；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵體聚合物，需要復(fù)雜的變性和復(fù)性過程；大量蛋白的分泌較困難。（一）融合蛋白技術(shù)的特點(diǎn)融合基因可在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)66（一）融合蛋白技術(shù)的特點(diǎn)真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)是蛋白翻譯后加工機(jī)會(huì)多，甚至可被改造成人源型；真核細(xì)胞易被轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性；產(chǎn)物可被分泌，提純簡單，成本低。

（一）融合蛋白技術(shù)的特點(diǎn)真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)是蛋白翻譯后加工機(jī)67（二）融合蛋白技術(shù)的內(nèi)容構(gòu)建融合蛋白的基本原則是，將第一個(gè)蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白基因，以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的共同表達(dá)。具體步驟有：1.進(jìn)行目的基因的克隆：根據(jù)基因序列互補(bǔ)原則，設(shè)計(jì)合適的引物序列，以cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的目的DNA片段。（二）融合蛋白技術(shù)的內(nèi)容構(gòu)建融合蛋白的基本原則是，將第一個(gè)68（二）融合蛋白技術(shù)的內(nèi)容2.在載體中進(jìn)行重組：通過限制內(nèi)切酶將兩個(gè)DNA片段進(jìn)行酶切并回收，然后通過連接酶將兩個(gè)具有相同末端酶切位點(diǎn)的基因片段進(jìn)行體外連接，并克隆到高表達(dá)質(zhì)粒載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。（二）融合蛋白技術(shù)的內(nèi)容2.在載體中進(jìn)行重組：通過限制內(nèi)切酶69（二）融合蛋白技術(shù)的內(nèi)容3.將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并利用選擇標(biāo)志進(jìn)行篩選及測序。4.融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)蛋白的純化。（二）融合蛋白技術(shù)的內(nèi)容3.將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并利用70（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵在構(gòu)建融合蛋白中，一個(gè)關(guān)鍵的問題是兩蛋白間的接頭序列(Linker)，即連接肽。它的長度對蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性非常重要。如果接頭序列太短，可能影響兩蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊，從而相互干擾；如果接頭序列太長，又涉及免疫原性的問題，因?yàn)榻宇^序列本身就是新的抗原。（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵在構(gòu)建融合蛋白中，一個(gè)關(guān)鍵的問題是兩71（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵

一般來說，3-5個(gè)氨基酸的Linker可滿足大部分融合蛋白的正確折疊的要求。有人嘗試在融合蛋白間加入一段有疏水性和一定伸展性的較長肽鏈，如(Gly4Ser1)，目的是將兩者分開，以緩解相互干擾作用，并獲得了滿意的結(jié)果。（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵一般來說，3-5個(gè)氨基酸的Li72（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵

但具體涉及到每種蛋白時(shí)，需具體分析。當(dāng)我們構(gòu)建融合蛋白時(shí)，應(yīng)多選擇幾種融合方式，從中優(yōu)化出理想的連接方式。另外，大量研究表明連接肽的柔性和疏水性對不擾亂蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域是十分重要的。（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵但具體涉及到每種蛋白時(shí)，需具體分析73（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵遺憾的是，目前對于連接肽序列的設(shè)計(jì)還沒有可靠的選擇標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)在，大多數(shù)連接肽序列的設(shè)計(jì)和選擇仍主要依賴于直覺。盡管依賴于蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)來預(yù)測其二級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)產(chǎn)生了重大的進(jìn)步，但是我們對于序列和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系的了解還是很有限的。（三）融合蛋白技術(shù)的關(guān)鍵遺憾的是，目前對于連接肽序列的設(shè)計(jì)還74三、融合蛋白技術(shù)的臨床

應(yīng)用DNA疫苗雙功能酶（多功能酶）定向藥物溶栓劑抗菌肽三、融合蛋白技術(shù)的臨床

75

（一）DNA疫苗

目前，疫苗已經(jīng)經(jīng)歷了三代：第一代疫苗是用減毒或殺死的病原體來激活機(jī)體免疫系統(tǒng)；第二代疫苗是用生物技術(shù)和重組DNA技術(shù)研制的組分疫苗注射機(jī)體誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；第三代疫苗是直接注射基因重組的抗原基因來激活人體免疫系統(tǒng)，即DNA疫苗。（一）DNA疫苗目前，疫苗76

（一）DNA疫苗DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯的優(yōu)勢，如易于生產(chǎn)，穩(wěn)定性強(qiáng)，成本低廉等，并可同時(shí)誘導(dǎo)體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答。（一）DNA疫苗DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯77

（一）DNA疫苗DNA疫苗的免疫方法是將帶有目的基因并能在真核細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)菌質(zhì)粒直接導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，通過在體內(nèi)表達(dá)目的蛋白以引起機(jī)體對該蛋白的免疫應(yīng)答。

（一）DNA疫苗DNA疫苗的免疫方法是將帶有目78

（一）DNA疫苗目前利用基因工程成功制成的多價(jià)重組抗體融合蛋白CYF196(國內(nèi)尚未上市)就是一種DNA疫苗，它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因?yàn)镃YF196對病毒的主要受體-位于呼吸道上皮中的細(xì)胞間黏附分子有高度親和力，對鼻病毒感染有較強(qiáng)的防御功能。（一）DNA疫苗目前利用基因工程成功制成的多價(jià)79（二）雙功能酶（多功能酶）

以往研究發(fā)現(xiàn)，在利用基因融合所構(gòu)建的大的酶分子中，如果用以構(gòu)成融合蛋白的各個(gè)酶分子的整個(gè)編碼序列均保留于新的酶分子中，則融合蛋白一般均保留所構(gòu)成的酶分子各自的酶活性。（二）雙功能酶（多功能酶）以往研究發(fā)現(xiàn)80（二）雙功能酶（多功能酶）

并且發(fā)現(xiàn)在這些新構(gòu)建的融合蛋白中，蛋白的正確折疊以及各個(gè)酶的活性部位均未受到影響，與單個(gè)酶相比，融合蛋白的酶的比活力為50%-100%，對于催化連續(xù)反應(yīng)的兩種或幾種酶，利用基因融合的方法構(gòu)成的融合蛋白可產(chǎn)生“鄰近效應(yīng)”（proximityeffect）。（二）雙功能酶（多功能酶）并且發(fā)現(xiàn)在這些新81（二）雙功能酶（多功能酶）目前研究發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶-半乳糖脫氫酶融合蛋白在一定條件下，其偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生NADH的速度是同時(shí)加入這兩種酶的反應(yīng)速度的兩倍以上。同時(shí)過渡態(tài)時(shí)間縮短近四倍。（二）雙功能酶（多功能酶）目前研究發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶-半82（三）定向藥物定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結(jié)合的配基。通過融合蛋白技術(shù)將這兩部分融合在一起，即可構(gòu)成一個(gè)具有獨(dú)特構(gòu)象與功能的蛋白質(zhì)。（三）定向藥物定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部83（三）定向藥物特點(diǎn)：它可以特異性地與靶細(xì)胞或致病因子結(jié)合，并把藥物引導(dǎo)至病灶處，從而大大提高藥物的效力?？梢赃x擇性地殺傷相應(yīng)的抗原相關(guān)細(xì)胞或受體相關(guān)細(xì)胞，對其他無關(guān)細(xì)胞影響較少或無影響。（三）定向藥物特點(diǎn)：它可以特異性地與靶細(xì)胞或致病因子結(jié)合，并84（三）定向藥物配基常是腫瘤特異性抗體、細(xì)胞因子或激素等導(dǎo)向物質(zhì)，藥物常是毒性分子（如動(dòng)植物毒素、放療、化療藥物或細(xì)菌毒素等）。

（三）定向藥物配基常是腫瘤特異性抗體、細(xì)胞因子或激素等導(dǎo)向物85（四）溶栓劑新型溶栓劑的要求是具有多種功能，既有較高的溶栓活性，又有較強(qiáng)的纖維蛋白的親和性或抑制血栓的功能，從而使溶栓劑具有較高的纖維蛋白專一性，減少出血副作用，降低溶栓藥物使用后再栓塞形成的可能性。（四）溶栓劑新型溶栓劑的要求是具有多種功能，既有較高的溶栓活86（四）溶栓劑

凝血酶在血小板激活后促進(jìn)纖維蛋白酶原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，在凝血過程中起主要作用，在動(dòng)物模型和人體中，肝素是凝血酶間接抑制劑，水蛭素則是其直接抑制劑。單克隆抗體mAb59D能靶向血塊，mAb59D8與纖溶酶原活化因子偶合能達(dá)到靶向治療和有效溶栓的目的。（四）溶栓劑凝血酶在血小板激活后促進(jìn)纖維87（四）溶栓劑但兩者化學(xué)結(jié)合不僅產(chǎn)量低，而且在生產(chǎn)過程中部分損失了水蛭素的溶栓活性。利用基因融合技術(shù)，把水蛭素和mAb59D8的纖維蛋白原片段融合，融合蛋白在穩(wěn)態(tài)時(shí)無作用，只有用凝血酶原激酶(Ax)對它進(jìn)行切割激活后，才有活性。（四）溶栓劑但兩者化學(xué)結(jié)合不僅產(chǎn)量低，而且在生產(chǎn)過程中部分損88（四）溶栓劑利用分子克隆技術(shù)，這種融合蛋白能成功轉(zhuǎn)錄并高效表達(dá)于59D8雜交瘤細(xì)胞系，這種策略結(jié)合了靶向溶栓和Ax因子激活，有效地在血栓處發(fā)揮作用，對全身的副作用很小。（四）溶栓劑利用分子克隆技術(shù)，這種融合蛋白能成功轉(zhuǎn)錄并高89（五）抗菌肽肽類抗生素又名抗菌肽，機(jī)體天然產(chǎn)生的抗菌肽由于其對耐藥菌的強(qiáng)大抗菌作用而受到人們關(guān)注。它廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，是由生物體特定基因編碼的一類陽離子小分子多肽，具有廣譜抗菌活性，是機(jī)體天然免疫的重要組成部分。（五）抗菌肽肽類抗生素又名抗菌肽，機(jī)體天然產(chǎn)生的抗菌肽由于其90（五）抗菌肽研究結(jié)果表明，抗菌肽可以在亞毒性濃度下抑制HIV-1的基因表達(dá)，減少HIV-1的增殖。而人源溶菌酶除了具有一般溶菌酶的抗菌活性外，也具有抗病毒的特性，已有研究證實(shí)人源溶菌酶具有抗HIV-1的作用。（五）抗菌肽研究結(jié)果表明，抗菌肽可以在亞毒性濃度下抑制HI91（五）抗菌肽目前已有人構(gòu)建了抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白表達(dá)載體。并成功表達(dá)出了具有抗菌和抗病毒雙重活性的重組蛋白。（五）抗菌肽目前已有人構(gòu)建了抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白表達(dá)92四、常見的幾種融合蛋白

（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白（二）甲狀旁腺激素（PTH）融合蛋白（三）細(xì)胞因子重組融合蛋白四、常見的幾種融合蛋白（一）93（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白Ig融合蛋白是指在基因水平將目的基因同Ig部分片段基因相連，并在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)出的具有上述兩部分結(jié)構(gòu)域的重組蛋白。據(jù)目的蛋白與Ig不同片斷相連，可將其分為二大類：一類為Fab(Fv)融合蛋白；另一類為Fc融合蛋白。

（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白Ig融合蛋白是指在基因水平將941、Fab(Fv)融合蛋Fab(Fv)融合蛋白主要是將Fab(Fv)段與其他生物活性蛋白結(jié)合，利用抗體對抗原的特異識(shí)別功能將活性蛋白導(dǎo)向特定部位。使活性蛋白在特定部位發(fā)揮生物作用。常見的與Fab融合的蛋白有毒素、細(xì)胞因子、受體、酶等。1、Fab(Fv)融合蛋Fab(Fv)融合蛋白主要是將95腫瘤靶向免疫治療將一些生物活性蛋白(如毒素、細(xì)胞因子等)與抗腫瘤抗體的Fab段融合，利用抗體對腫瘤抗原的識(shí)別作用而進(jìn)行靶向免疫治療。腫瘤靶向免疫治療將一些生物活性蛋白(如毒素、細(xì)胞因子等)與96腫瘤靶向免疫治療如ForsbergG等利用抗癌胚抗原(CEA)抗體的Fab段與葡萄球菌腸毒素(SEA)融合組成一個(gè)超抗原，融合超抗原可導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞并激活T細(xì)胞殺死表達(dá)有癌胚抗原腫瘤細(xì)胞。腫瘤靶向免疫治療如ForsbergG等利用抗癌胚抗原(C97腫瘤靶向免疫治療而將T細(xì)胞共刺激分子B7與抗瘤抗體結(jié)合就可將B7導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞。B7-抗瘤抗體，一方面與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合，一方面提供共刺激信號(hào)給T細(xì)胞能有效觸發(fā)腫瘤特異細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)。腫瘤靶向免疫治療而將T細(xì)胞共刺激分子B7與抗瘤抗體結(jié)合就可將982、Fc融合蛋白Fc融合蛋白主要是將生物活性蛋白與Ig的絞鏈區(qū)及CH2、CH3區(qū)結(jié)合。與Fc段融合的蛋白種類很多，其作用也各不相同，歸納起來有如下幾方面：2、Fc融合蛋白Fc融合蛋白主要是將生物活性蛋白與Ig的絞99（1）抗病毒感染目前發(fā)現(xiàn)使用DNA疫苗加上IL-2-Ig融合蛋白注射到實(shí)驗(yàn)用的恒河猴，然后高劑量靜脈內(nèi)給恒河猴注射SHIV病毒。雖然它們不能阻止猴被SHIV病毒感染，但確實(shí)可控制病毒血癥到幾乎測不到的水平，并預(yù)防免疫缺陷和臨床癥狀。（1）抗病毒感染目前發(fā)現(xiàn)使用DNA疫苗加上IL-2-Ig融100（1）抗病毒感染目前IL-2已用于臨床治療HIV和癌癥，但由于IL-2在活體內(nèi)半衰期短，有毒性作用及成本高，其臨床治療作用受限。而用IL2-Ig融合蛋白，它有IL-2的免疫刺激活性且半衰期長，用它注入健康恒河猴可誘導(dǎo)T細(xì)胞數(shù)目增加并表達(dá)CD25。（1）抗病毒感染目前IL-2已用于臨床治療HIV和癌癥，但由101（2）治療痛覺過敏Etanercept，一個(gè)重組TNFR-Fc融合蛋白，可競爭性抑制TNF，它已成功用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人，能減少疼痛和炎癥，在神經(jīng)損傷后，由于局部產(chǎn)生前炎性細(xì)胞因子對疼痛產(chǎn)生起一個(gè)主要作用。給坐骨神經(jīng)慢性壓縮性損傷的鼠注射Etanercept可減少熱痛覺過敏和機(jī)械性異常性疼痛。（2）治療痛覺過敏Etanercept，一個(gè)重組TNF102（2）治療痛覺過敏實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)豬神經(jīng)根損傷，同時(shí)給豬注射Etanercept7天后顯示Etanercept能預(yù)防神經(jīng)傳導(dǎo)速度的減低，限制神經(jīng)纖維損傷，防止毛細(xì)血管內(nèi)血栓和神經(jīng)內(nèi)水腫形成。預(yù)示Etanercept可用于治療椎間盤突出和坐骨神經(jīng)痛。（2）治療痛覺過敏實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)豬神經(jīng)根損傷，同時(shí)給豬注射Et103（3）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一個(gè)系統(tǒng)性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥反應(yīng)為特征并有軟骨變性和關(guān)節(jié)旁骨的侵蝕。（3）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一個(gè)系統(tǒng)104（3）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療已知TNF與RA的發(fā)病機(jī)理有很大關(guān)系，許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)用人可溶性重組TNF受體與IgFc段蛋白融合可完全競爭性抑制TNF結(jié)合到細(xì)胞表面受體，使TNF無生物活性。給病人注射Etanercept可減少關(guān)節(jié)腫脹及炎癥，減少關(guān)節(jié)腔狹窄。臨床上已用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。（3）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療已知TNF與RA的發(fā)病機(jī)理有很大關(guān)105（4）用于其他科學(xué)研究融合蛋白還可以作為一種研究工具應(yīng)用于許多方面的研究，如人表皮生長因子受體2蛋白(HER2)向上調(diào)節(jié)血管促白細(xì)胞生成素(Ang-2)的表達(dá)，而利用酪氨酸蛋白激酶受體-2-Fc(Tie-2/Fc)融合蛋白將減少腫瘤細(xì)胞釋放血管促白細(xì)胞生成素，這樣就可研究HER2對微血管的折除(dismantle)作用。（4）用于其他科學(xué)研究融合蛋白還可以作為一種研究工具應(yīng)用于106（二）PTH融合蛋白甲狀旁腺激素(ParathyroidHormone，PTH)是由甲狀旁腺主細(xì)胞合成和分泌的一種單鏈多肽激素，成熟PTH含84個(gè)氨基酸殘基，分子量約為9500，是人體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷代謝及骨轉(zhuǎn)換的最為重要的激素之一。它主要通過作用于靶細(xì)胞膜上腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，增加胞漿內(nèi)cAMP及焦磷酸鹽(PPi)的水平來發(fā)揮作用。（二）PTH融合蛋白甲狀旁腺激素(Parathyroid107蛋白類藥物的分子量若小于20kD在代謝過程中易被腎小球?yàn)V過，且在體內(nèi)的半衰期較短，皮下給藥或肌肉注射的半衰期一般在12h左右。因此，長效蛋白藥物的研制已成為對第一代基因工程產(chǎn)品進(jìn)行二次開發(fā)的一個(gè)重要方向，而增加分子量則是一個(gè)通用的策略。人們已經(jīng)采用多種方法來對PTH的性質(zhì)進(jìn)行改進(jìn)，以在保留它的活性的同時(shí)提高半衰期。其中包括構(gòu)建突變體、化學(xué)修飾以及基因融合等，而基因融合技術(shù)為最突出的。蛋白類藥物的分子量若小于20kD在代謝過程中易被腎小球?yàn)V過108常用的融合蛋白的載體有人血清白蛋白(Humaserumalbumin，HSA)融合蛋白、β-半乳糖苷酶融合蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白以及硫氧還蛋白(Trx)融合蛋白等。而人血清白蛋白(HSA)則由于本身特殊的優(yōu)點(diǎn)，更適合于充當(dāng)長效融合蛋白類藥物的融合載體。常用的融合蛋白的載體有人血清白蛋白(Humaseru109HSA是包含585個(gè)氨基酸殘基的單鏈無糖基化的球形蛋白質(zhì)，分子量65kD。它是人血漿中含量最高的單一蛋白質(zhì)(達(dá)40g/L)，在體內(nèi)有維持血液滲透壓，運(yùn)輸營養(yǎng)和其它重要生物物質(zhì)的作用。HSA本身是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體。藥物和血清白蛋白結(jié)合后?？梢詼p少其生物利用度，增加在體內(nèi)的半衰期至19d之久。HSA是包含585個(gè)氨基酸殘基的單鏈無糖基化110人血清白蛋白融合技術(shù)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，包括：HSA與目標(biāo)蛋白在胞內(nèi)經(jīng)蛋白翻譯系統(tǒng)通過肽鍵連接，不需額外的體外處理；HSA表達(dá)水平較高，融合后可以提高目的蛋白的表達(dá)水平；HSA是一個(gè)穩(wěn)定的“惰性”蛋白，融合后可以提高目的蛋白的穩(wěn)定性；HAS融合蛋白具有比PEG修飾的蛋白藥物更長的半衰期。人血清白蛋白融合技術(shù)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，包括111（三）細(xì)胞因子重組融合蛋白細(xì)胞因子重組融合蛋白是一類利用基因工程的方法將編碼細(xì)胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列連接并表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)融合產(chǎn)物。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為將細(xì)胞因子功能活性域與其他分子的活性