實(shí)驗(yàn)二 高效液相色譜法測(cè)定飲料中的咖啡因

實(shí)驗(yàn)二高效液相色譜法測(cè)定飲料中的咖啡因

一、目的要求

1、學(xué)習(xí)高效液相色譜儀的操作。

2、了解高效液相色譜法測(cè)定咖啡因的基本原理。

3、掌握高效液相色譜法進(jìn)行定性及定量分析的基本方法。

二、基本原理

/CH

N

咖啡因又稱(chēng)咖啡堿，是由茶葉或咖啡中提取而得的一種生物堿，它屬黃嘌呤衍生物，化學(xué)名稱(chēng)為1,3,7-三甲基黃嘌呤。咖啡因能興奮大腦皮層，使人精神興奮?？Х戎泻Х纫蚣s為1.2T.8%,茶葉中約含2.0~4.7%?？蓸?lè)飲料、APC藥片等中均含咖啡因。其分子式為c8h10o2n4，結(jié)構(gòu)式為：

3

CH3

定量測(cè)定咖啡因的傳統(tǒng)分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色譜法將飲料中的咖啡因與其它組分（如：?jiǎn)螌幩帷⒖Х人?、蔗糖等）分離后，將已配制的濃度不同的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)入色譜系統(tǒng)。如流動(dòng)相流速和泵的壓力在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是恒定的，測(cè)定它們?cè)谏V圖上的保留時(shí)間tR和峰面積A后，可直接用tR定性，用峰面積A作為定量測(cè)定的參數(shù)，采用工作曲線(xiàn)法（即外標(biāo)法）測(cè)定飲料中的咖啡因含量。

三、儀器和試劑

1、Agilent1100高效液相色譜儀。

2、色譜柱：KromasilC18，5卩150X4.6mm。

3、流動(dòng)相：30%甲醇（色譜純）+70%高純水；流動(dòng)相進(jìn)入色譜系統(tǒng)前，用超聲波發(fā)生器脫氣10min。

4、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：將咖啡因在110°C下烘干lh。準(zhǔn)確稱(chēng)取O.lOOOg咖啡因，用二次蒸餾水溶解，定量轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，并稀釋至刻度。標(biāo)樣濃度1000pgmL-1。

5、測(cè)飲料試液：可樂(lè)，茶葉，速溶咖啡。

6、20卩L平頭微量注射器。

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1、標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80Ag-mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

（1mL，2mL，3mL、4mL稀釋為50mL）

2、譜儀器條件：

泵的流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm；進(jìn)樣量：10"；柱溫：室溫。

3、儀器基線(xiàn)穩(wěn)定后，進(jìn)咖啡因標(biāo)準(zhǔn)樣，濃度由低到高。

4、品處理如下：（1）將約25mL可口可樂(lè)置于一100mL潔凈、干燥的燒杯中，劇烈攪拌30min或用超聲波脫氣5min,以趕盡可樂(lè)中二氧化碳。（2）準(zhǔn)確稱(chēng)取0.04g速溶咖啡，用90°C蒸餾水溶解，冷卻后待用。（3）準(zhǔn)確稱(chēng)取0.04g茶葉，用20mL蒸餾水煮沸10min,冷卻后，將上層清液，并按此步驟再重復(fù)一次。將上述三種樣品分別轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。

5、上述三份樣品溶液分別進(jìn)行干過(guò)濾（即用干漏斗、干濾紙過(guò)濾），棄去前過(guò)濾液，取后面的過(guò)濾液，備用。

6、別取5mL可樂(lè)、咖啡飲料和茶葉水用0.45ym的過(guò)濾膜過(guò)濾后，注入2mL樣品瓶中備用。

7、“島津LC-20AT高效液相色譜儀操作規(guī)程”分析飲料試液。

五、結(jié)果處理

測(cè)定每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣的保留時(shí)間（進(jìn)樣標(biāo)記至色譜峰頂尖的時(shí)間）。

確定未知樣中咖啡因的出峰時(shí)間。

求取樣品中咖啡因的濃度。

記得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

序號(hào)

標(biāo)樣濃度Ug?mL-1

保留時(shí)間t

R

色譜峰面積S

色譜峰高度H

1

20

5.037

706020

41674

2

40

5.037

1297842

71167

3

60

5.086

1737510

96272

4

80

5.071

2073782

110623

5

茶葉

5.120

1646966

94330

6

百事可樂(lè)

5.098

2148124

117964

7

速溶咖啡

5.185

431571

25125

將標(biāo)樣的數(shù)據(jù)利用EXCEL軟件繪圖，并計(jì)算回歸方程，如下:

色譜峰面積Sy二22715x+318050R2=0.9843

將茶葉、百事可樂(lè)、速溶咖啡測(cè)試所得的峰面積代入回歸方程計(jì)算濃度：

標(biāo)樣

色譜峰面積S

濃度Ag?mL-1

茶葉

1646966

58.5039

百事可樂(lè)

2148124

80.56676

速溶咖啡

431571

4.997623

六、注意事項(xiàng)

1、不同的可樂(lè)、茶葉、咖啡中咖啡因含量不大相同，稱(chēng)取的樣品量可酌量增減

2、若樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液需保存，應(yīng)置于冰箱中。

3、為獲得良好結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)和樣品的進(jìn)樣量要嚴(yán)格保持一致。

七、思考題

1、用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？

答：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法的優(yōu)點(diǎn)是：繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)后測(cè)定工作就變得相當(dāng)簡(jiǎn)單，可直接從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)上讀出含量，因此特別適合于大量樣品的分析。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法的缺點(diǎn)是：每次樣品分析的色譜條件（檢測(cè)器的響應(yīng)性能，柱溫，流動(dòng)相流速及組成，進(jìn)樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。此外，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)繪制時(shí)，一般使用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品（或已知準(zhǔn)確含量的樣品），而實(shí)際樣品的組成卻千差萬(wàn)別，因此必將給測(cè)量帶來(lái)一定的誤差。

2、根據(jù)結(jié)構(gòu)式，咖啡因能用離子交換色譜法分析嗎？為什么？

答：不行。因?yàn)殡x子交換色譜以離子交換樹(shù)脂作為固定相，樹(shù)脂上具有固定離子基團(tuán)及可交換的離子基團(tuán)。當(dāng)流動(dòng)相帶著組分電離生成的離子通過(guò)固定相時(shí)，組分離子與樹(shù)脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆變換。平衡常數(shù)K值越大，表示組分的離子與離子交換樹(shù)脂的相互作用越強(qiáng)。由于不同的物質(zhì)在溶劑中離解后，對(duì)離子交換中心具有不同的親合力，因此具有不同的平衡常數(shù)。親合力大的，在柱中的停留時(shí)間長(zhǎng)，具有高的保留值。依據(jù)咖啡因的結(jié)構(gòu)式1,3,7-三甲基黃嘌吟或3,7-二氫-1,3,7三甲基-1H-嘌吟-2,6-二酮，其解離常數(shù)很小，不符合離子交換色譜的要求。

4、在樣品干過(guò)濾時(shí)，為什么要棄去前過(guò)濾液？這樣做會(huì)不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果？為什么？

答：干過(guò)濾主要是保持溶液濃度不變而采取的一種過(guò)濾方