王惠敏藥包材微生物檢驗(yàn)

微生物的基本知識(shí)回顧微生物:存在于自然界中的一群體型細(xì)小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、肉眼看不見(jiàn)，必須借助于特殊儀器放大后才能觀察到的微小生物。按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及生活習(xí)性可分為:原核類(lèi):僅有原始核質(zhì)，無(wú)核仁或核膜，細(xì)胞器很不完善，如細(xì)菌、放線菌、支原體、立克次氏體、衣原體、螺旋體。真核類(lèi):細(xì)胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體，細(xì)胞器完整，如真菌（酵母菌和霉菌）、原生動(dòng)物、藻類(lèi)。非細(xì)胞類(lèi):體積微小，能通過(guò)除菌過(guò)濾器，如病毒和朊病毒等。按其致病性可分為:

病原性微生物非病原性微生物第一頁(yè)，共五十二頁(yè)。微生物的特點(diǎn)個(gè)體小,面積大：小于0.1mm。肉眼不可見(jiàn)。分布廣,種類(lèi)多（10萬(wàn)多種）：自然界中到處都有，如水、空氣、土壤等,

土壤中的數(shù)量最多。代謝強(qiáng)，轉(zhuǎn)化快：發(fā)酵乳糖的細(xì)菌在1小時(shí)內(nèi)可分解其自重1000～10000倍的乳糖；產(chǎn)朊假絲酵母合成蛋白質(zhì)的能力比食用公牛強(qiáng)10萬(wàn)倍。生長(zhǎng)旺，繁殖快：微生物有驚人的繁殖速度，大多數(shù)微生物幾十分鐘內(nèi)就可以繁殖一代。適應(yīng)性強(qiáng)，易變異（耐藥性產(chǎn)生的原因）。第二頁(yè)，共五十二頁(yè)。葡萄球菌

酵母菌（芽痕）棒狀桿菌大腸桿菌弧狀菌鏈球菌第三頁(yè)，共五十二頁(yè)。菌落單位菌落單位---CFU:由單個(gè)菌細(xì)胞或幾個(gè)同種菌細(xì)胞在培養(yǎng)基上長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的菌落，每個(gè)菌落就是1CFU細(xì)菌菌落霉菌菌落第四頁(yè)，共五十二頁(yè)。包材的微生物污染包材微生物污染：微生物的產(chǎn)生、附著而給包材及生產(chǎn)環(huán)境帶來(lái)不良影響。污染包材的細(xì)菌：常見(jiàn)污染包材的細(xì)菌是一些生命力較強(qiáng)的細(xì)菌，如：葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌及一些霉菌，抵抗力弱的細(xì)菌一般不易造成污染。包材的微生物污染源：空氣、水、廠房與設(shè)備、生產(chǎn)用原輔料、包裝材料、生產(chǎn)操作人員等第五頁(yè)，共五十二頁(yè)。微生物檢驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備二、培養(yǎng)基的制備三、人流、物流程序四、檢驗(yàn)步驟方法五、培養(yǎng)觀察與結(jié)果判斷第六頁(yè)，共五十二頁(yè)。潔凈室的啟用

微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。在檢驗(yàn)開(kāi)始前，應(yīng)確保：a.潔凈室房間、臺(tái)面等已清潔消毒b.潔凈室已臭氧滅菌不少于半小時(shí)c.潔凈室凈化空調(diào)系統(tǒng)持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)不少于1小時(shí)，紫外燈已開(kāi)啟d.潔凈室中有壓差要求的房間壓差達(dá)到規(guī)定實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備第七頁(yè)，共五十二頁(yè)。實(shí)驗(yàn)器材、消耗品的準(zhǔn)備a.無(wú)菌衣、手套、口罩、試管、瓶子、培養(yǎng)皿、消毒劑配制缸、脫脂棉花球b.一次性薄膜過(guò)濾濾器、微生物檢查薄膜過(guò)濾儀c.消毒劑、酒精燈第八頁(yè)，共五十二頁(yè)。培養(yǎng)基是微生物試驗(yàn)的基礎(chǔ)，直接影響微生物試驗(yàn)結(jié)果。培養(yǎng)基的制備是檢驗(yàn)的重要一環(huán)。培養(yǎng)基的制備第九頁(yè)，共五十二頁(yè)。培養(yǎng)基制備過(guò)程中的注意事項(xiàng)培養(yǎng)基的水化培養(yǎng)基水化使用的容器應(yīng)是玻璃器皿或搪瓷器皿如三角燒瓶。蒸餾水洗凈，烘干后方可使用。不得用銅鍋或鐵鍋,以防有離子混入培養(yǎng)基中,影響微生物的生長(zhǎng)；配制培養(yǎng)基最常用的溶劑是純化水,不能含有任何可能抑制或影響微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)；培養(yǎng)基的溶解在培養(yǎng)基分裝滅菌前,應(yīng)溶解均勻,使用電爐等設(shè)備煮沸培養(yǎng)基時(shí),應(yīng)用小火加熱,并邊加熱邊攪拌,避免培養(yǎng)基焦化或爆沸溢出。培養(yǎng)基的滅菌已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌濕熱滅菌必須嚴(yán)格控制滅菌溫度和時(shí)間（121度，15-30分鐘，20分鐘）第十頁(yè)，共五十二頁(yè)。培養(yǎng)基制備過(guò)程中的注意事項(xiàng)培養(yǎng)基的保溫培養(yǎng)基滅菌后應(yīng)立即取出，不得儲(chǔ)藏在高壓滅菌器中，避免造成過(guò)度滅菌,影響培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分或選擇性效果。建議用45℃—55℃水浴鍋保溫不得超過(guò)8小時(shí)（60℃的培養(yǎng)箱，溫度不同，長(zhǎng)時(shí)間高溫影響培養(yǎng)基質(zhì)量）。培養(yǎng)基的貯藏配制好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在避光的環(huán)境。一般在三周內(nèi)使用（瓊脂培養(yǎng)基不得在0℃或0℃以下存放，防止冷凍破壞凝膠特性）。固體培養(yǎng)基滅菌后的再融化應(yīng)在加熱的水浴中或采用流通蒸汽進(jìn)行，只允許一次，不得再滅菌。第十一頁(yè)，共五十二頁(yè)。人流、物流程序物流

將樣品、滅菌后的物品、集菌過(guò)濾器等轉(zhuǎn)移入傳遞窗內(nèi)，打開(kāi)傳遞窗內(nèi)的紫外燈，照射不少于0.5小時(shí)。人流檢驗(yàn)人員在物品紫外消毒即將結(jié)束時(shí)，開(kāi)始進(jìn)入潔凈室。在更衣室脫去外衣和鞋。清洗雙手后，在物品柜內(nèi)取口罩和手套，戴上口罩。打開(kāi)滅菌后的無(wú)菌衣外包裝，取出無(wú)菌衣，穿戴整齊，要求嚴(yán)格覆蓋頭發(fā)、胡須和頸部。打開(kāi)手套外包裝，取出手套戴上，無(wú)菌衣袖口應(yīng)包裹在手套內(nèi)。用更衣室內(nèi)的消毒劑浸泡雙手后，自然揮干。進(jìn)入緩沖走廊，關(guān)閉傳遞窗內(nèi)的紫外燈后，打開(kāi)傳遞窗的門(mén)，取出樣品和其他實(shí)驗(yàn)物品，經(jīng)二級(jí)緩沖，進(jìn)入操作間。開(kāi)啟超凈工作臺(tái)工作電源，關(guān)閉紫外燈，并用75%的酒精噴灑擦拭消毒工作臺(tái)面。第十二頁(yè)，共五十二頁(yè)。檢驗(yàn)步驟方法檢驗(yàn)方法：平皿法、薄膜過(guò)濾法

藥品檢驗(yàn)三種方法，包材檢驗(yàn)兩種方法的選用僅與最后結(jié)果的報(bào)告有關(guān),不影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。以鋁箔為例，若無(wú)菌生長(zhǎng)，薄膜法結(jié)果為＜1cfu/100cm2，平皿法結(jié)果為＜30cfu/100cm2。薄膜法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但目前標(biāo)準(zhǔn)要求。第十三頁(yè)，共五十二頁(yè)。藥典要求：采用薄膜過(guò)濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45um，直徑一般為50mm。經(jīng)過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用75mm濾膜，菌落計(jì)數(shù)更方便、清晰。檢驗(yàn)過(guò)程（以常用的薄膜過(guò)濾法為例）第十四頁(yè)，共五十二頁(yè)。75MM濾器第十五頁(yè)，共五十二頁(yè)。５０MM、75MM薄膜過(guò)濾器

第十六頁(yè)，共五十二頁(yè)。黑曲霉在75MM膜玫瑰紅鈉形態(tài)

第十七頁(yè)，共五十二頁(yè)。2022/11/918金葡菌在75MM薄膜形態(tài)75mm薄膜過(guò)濾器

第十八頁(yè)，共五十二頁(yè)。供試液的制備：略過(guò)濾：取出三聯(lián)過(guò)濾器，將其固定在集菌儀底座上。在火焰附近打開(kāi)過(guò)濾器的針頭，插入供試液瓶中。運(yùn)行集菌儀調(diào)節(jié)泵速，一般在150左右。（供試液過(guò)濾前先少量的滅菌水過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜）細(xì)菌、霉菌、酵母菌的檢驗(yàn)：過(guò)濾后取出濾膜（水要濾干，防止菌成片生長(zhǎng)），菌面朝上貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。

陰性對(duì)照試驗(yàn)：提取用水代替供試液同法操作。不得有菌生長(zhǎng)。檢驗(yàn)步驟第十九頁(yè)，共五十二頁(yè)。

培養(yǎng)基的澆注：澆注好的平板搖勻后冷卻備用（不要把平板壘起來(lái)，這樣不利于冷卻）可以在細(xì)菌培養(yǎng)基中加0.1‰的TTC（利于觀察計(jì)數(shù)）第二十頁(yè)，共五十二頁(yè)。4.控制菌檢查

大腸埃希菌（常用，一般內(nèi)用藥包裝材料）、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（一般外用藥包裝材料，如聚丙烯藥用滴眼劑瓶）直接將相應(yīng)培養(yǎng)基加入過(guò)濾后的濾筒中培養(yǎng)。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)：同相應(yīng)控制菌的檢查，加入10-100cfu的對(duì)照菌，應(yīng)檢出相應(yīng)控制菌。陰性對(duì)照試驗(yàn)：提取用水代替供試液同法操作，不得有菌生長(zhǎng)。第二十一頁(yè)，共五十二頁(yè)。在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動(dòng)作；使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放；在火焰上方操作；帶有菌液的吸管等應(yīng)及時(shí)置于盛有5%來(lái)蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒；使用完畢后，用消毒液擦拭工作臺(tái)面，關(guān)閉工作電源，重新開(kāi)啟紫外燈照射15min。注意事項(xiàng)第二十二頁(yè)，共五十二頁(yè)。培養(yǎng)觀察與結(jié)果判斷培養(yǎng)

培養(yǎng)皿應(yīng)倒置培養(yǎng)。2010年藥典培養(yǎng)時(shí)間溫度的變化：時(shí)間修訂為：細(xì)菌為3天（原48小時(shí)）；霉菌、酵母菌為5天（原72小時(shí)），必要時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)?？刂凭囵B(yǎng)溫度修改為30℃～35℃（原35℃～37℃）第二十三頁(yè)，共五十二頁(yè)。菌落計(jì)數(shù)每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過(guò)100個(gè)（否則要稀釋后過(guò)濾）。若濾膜上無(wú)菌數(shù)生長(zhǎng)，以＜1報(bào)告菌數(shù)。若兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上（例20，40需重新檢驗(yàn)）。第二十四頁(yè)，共五十二頁(yè)。控制菌的判斷第二十五頁(yè)，共五十二頁(yè)。大腸埃希菌的鑒定靛基質(zhì)試驗(yàn)MUG試驗(yàn)第二十六頁(yè)，共五十二頁(yè)。大腸埃希菌的鑒定曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)瓊脂平板上菌落形態(tài)呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心圓形稍凸起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤(rùn)，常有金屬光澤。第二十七頁(yè)，共五十二頁(yè)。在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中經(jīng)35℃培養(yǎng)18-24h后，呈均勻渾濁生長(zhǎng)。分離培養(yǎng)：甘露醇氯化鈉瓊脂平板上菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)。卵黃氯化鈉瓊脂平板上菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈。生化反應(yīng)：

血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果：＋

金黃色葡萄球菌的鑒定第二十八頁(yè)，共五十二頁(yè)。金黃色葡萄球菌的鑒定金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉瓊脂上第二十九頁(yè)，共五十二頁(yè)。金黃色葡萄球菌的鑒定血漿凝固酶試驗(yàn)第三十頁(yè)，共五十二頁(yè)。金黃色葡萄球菌的鑒定血漿凝固酶試驗(yàn)第三十一頁(yè)，共五十二頁(yè)。分離培養(yǎng)：十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基生化反應(yīng)：

氧化酶試驗(yàn)（＋）

（培養(yǎng)物呈粉紅色漸變?yōu)樽霞t色）綠膿菌素試驗(yàn)（＋）

（鹽酸溶液呈粉紅色）銅綠假單胞菌的鑒定第三十二頁(yè)，共五十二頁(yè)。銅綠假單胞菌的鑒定銅綠假單胞菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂第三十三頁(yè)，共五十二頁(yè)。菌種的相關(guān)知識(shí)菌種是一個(gè)國(guó)家的重要資源，世界各國(guó)對(duì)菌種的保藏都極為重視。世界上有700多家菌菌種保藏機(jī)構(gòu)，其中國(guó)際知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織承認(rèn)的法定的保藏機(jī)構(gòu)僅有28家。第三十四頁(yè)，共五十二頁(yè)。1、我國(guó)的微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)1）普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京，中科院武漢病毒研究所2）農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，北京（ISF）3）工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究院，北京，（IFFI）4）醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC）中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，南京衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所5）抗生素菌種保藏管理中心（CACC）中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院抗生素研究所，北京四川抗生素工業(yè)研究所，成都華北制藥廠抗生素研究所，石家莊6）獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品檢察所，北京第三十五頁(yè)，共五十二頁(yè)。2、國(guó)外主要的微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)1）美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（ATCC）2）美國(guó)冷泉港研究所（CSH）3）日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所（IAM）4）日本東京科研化學(xué)有限公司（KCC）5）日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）6）英國(guó)國(guó)立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（NCTC）7）美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所（NIH）8）美國(guó)農(nóng)業(yè)部北方開(kāi)發(fā)利用研究部（NRRL）第三十六頁(yè)，共五十二頁(yè)。我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)菌種統(tǒng)一由中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)（CCCCM）管理，涉及藥品微生物檢驗(yàn)的菌種由醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC）提供美國(guó)ATCC、NRRL，荷蘭的CBS第三十七頁(yè)，共五十二頁(yè)。

中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株第三十八頁(yè)，共五十二頁(yè)。

美國(guó)國(guó)家菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株第三十九頁(yè)，共五十二頁(yè)。菌種的采購(gòu)菌種的復(fù)蘇菌種的傳代菌種的使用菌種的保藏菌種的銷(xiāo)毀第四十頁(yè)，共五十二頁(yè)。菌種的采購(gòu)向指定的菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)置。所購(gòu)菌種均為冷凍干燥菌種。

購(gòu)入菌種后，應(yīng)及時(shí)移交實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室菌種管理人員應(yīng)仔細(xì)核對(duì)菌種發(fā)放單和冷凍干燥菌種管標(biāo)簽等各項(xiàng)信息，確認(rèn)無(wú)誤后，置4～6℃暫存。第四十一頁(yè)，共五十二頁(yè)。菌種的復(fù)蘇

菌種在打開(kāi)前應(yīng)仔細(xì)核對(duì)標(biāo)簽上菌名、菌號(hào)。并注意一株菌種使用一套打開(kāi)用具，嚴(yán)防交叉污染。

菌種復(fù)蘇應(yīng)在生物安全柜內(nèi)操作。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、可同時(shí)接種液體培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基斜面。

取瓊脂培養(yǎng)基斜面上的菌苔按要求對(duì)菌種的純度進(jìn)行鑒定。第四十二頁(yè)，共五十二頁(yè)。菌種的復(fù)蘇干燥菌種(安瓿)的開(kāi)啟

第四十三頁(yè)，共五十二頁(yè)。菌種的傳代應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行菌種的傳代。美國(guó)藥典（USP）中規(guī)定：“將微生物接種至一新鮮培養(yǎng)基上/內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱(chēng)為一代，”并規(guī)定“菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過(guò)5代”。我國(guó)的GMP認(rèn)證中也如此要求，并且中國(guó)藥典2005年版藥典也已做出“菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過(guò)5代”這個(gè)明確的規(guī)定。第四十四頁(yè)，共五十二頁(yè)。常用的傳代方法斜面接種劃線接種液體接種穿刺接種

第四十五頁(yè)，共五十二頁(yè)。菌種的傳代斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作第四十六頁(yè)，共五十二頁(yè)。微生物的環(huán)境器皿及培養(yǎng)基的無(wú)菌操作者的外界環(huán)境及操作過(guò)程的無(wú)菌（環(huán)境及操作的無(wú)菌）劃線接種第四十七頁(yè)，共五十二頁(yè)。

平板劃線法（streakplatemethod）

第四十八頁(yè)，共五十二頁(yè)。菌種的使用菌液的制備：

取銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置35～37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h。

取上述液體培養(yǎng)物1ml，加入9ml0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，分別10倍稀釋至10-5～10-9，制成含菌數(shù)小100cfu/ml的溶液，備用。

菌懸液制備后應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2～8℃的菌懸液可以在24小時(shí)內(nèi)使用。第四十九頁(yè)，共五十二頁(yè)。菌種的使用銅綠假單胞菌相關(guān)：