實(shí)驗(yàn)報(bào)告-高效液相色譜法測(cè)定VE含量

實(shí)驗(yàn)四高效液相色譜法測(cè)定ve含量

E

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解高效液相色譜儀的基本操作；

了解高效液相色譜儀測(cè)定VE的原理。

實(shí)驗(yàn)原理

高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附—解吸的分配過(guò)程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)。

VE（維生素E）又名生育酚或產(chǎn)妊酚，在食油、水果、蔬菜及糧食中均存在。有抗氧化作用，能增強(qiáng)皮膚毛細(xì)血管抵抗力，并維持正常通透性；有改善血液循環(huán)及調(diào)整生育功能、抗衰老作用等。VE通過(guò)高效液相色譜柱進(jìn)行分離，PDA檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

實(shí)驗(yàn)器材

實(shí)驗(yàn)樣品

VE樣品溶液

實(shí)驗(yàn)試劑

濃度為50pg/ml的VE標(biāo)樣

實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀附PDA檢測(cè)器

色譜條件

色譜柱：C18柱；流動(dòng)相速度：0.3ml/min；

進(jìn)樣量：5pl；柱溫：30°C。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

5.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果本次實(shí)驗(yàn)采用的是單點(diǎn)法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1.液相色譜儀測(cè)定蘋(píng)果的VE含量

、tr.冃

進(jìn)樣量

保留時(shí)間

峰面積

標(biāo)樣

5卩1

3.59min

42217

待測(cè)樣品

5卩1

3.59min

17369

樣品中VE的濃度=乙烯標(biāo)樣的總量x蘋(píng)果的峰面積/乙烯標(biāo)樣的峰面積

_標(biāo)樣進(jìn)樣量X標(biāo)樣中VE的濃度X樣品峰面積

=樣品進(jìn)樣量X標(biāo)樣峰面積

=5plx50卩g/mLX17369/(5plx42217)=20.57卩g/mL

5.2實(shí)驗(yàn)討論

本次實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定標(biāo)樣溶液VE含量時(shí)，在指定的保留時(shí)間內(nèi)并未出峰。討

論分析原因：樣品溶液在上周實(shí)驗(yàn)后，一直置于離心管中，未避光低溫保存，導(dǎo)致樣品中VE氧化，液相測(cè)定時(shí)沒(méi)有在相應(yīng)的時(shí)間出峰。本次實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，且主要目的是了解高效液相色譜儀的基本操作，以及液相色譜儀測(cè)定VE的原理，故結(jié)合前組同學(xué)對(duì)VE含量的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行討論與分析。

因時(shí)間有限，實(shí)驗(yàn)采用了單點(diǎn)法進(jìn)行測(cè)量分析，且無(wú)平行重復(fù)，這樣誤差較

大。我們以后實(shí)驗(yàn)時(shí)，VE標(biāo)樣可以選擇5個(gè)濃度，每個(gè)濃度分別測(cè)定3-4次，取其峰面積的平均值后作標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣誤差更小。

6知識(shí)擴(kuò)展

6.1高效液相色譜儀包括哪幾個(gè)部分組成？

答：高效液相色譜儀主要由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜分離系統(tǒng)、檢測(cè)器這四個(gè)部分組成，其流程圖見(jiàn)圖1。

輸液系統(tǒng)包括貯液槽和輸液管道、高壓泵和梯度洗脫裝置。貯液槽，通常是由玻璃或不銹鋼等材料制成的，用來(lái)存貯足夠數(shù)量、符合分析要求流動(dòng)相的容器。輸液管道是管道內(nèi)徑很小的用于連接高效液相色譜儀各主要流路系統(tǒng)。高壓泵是將流動(dòng)相在高壓下連續(xù)送入色譜柱，使樣品在色譜柱內(nèi)完成分離過(guò)程。高效液相色譜儀采用的是往復(fù)式恒流泵，是具有輸出壓力高、流量穩(wěn)定、流量可調(diào)范圍寬、泵內(nèi)死體積小、具有梯度洗脫及耐酸堿腐蝕、溶劑更換迅速等性能。梯度洗脫裝

置是在分離過(guò)程中，隨時(shí)間函數(shù)程序改變流動(dòng)相組成，有分低壓梯度和高壓梯度兩種裝置。

流動(dòng)相

圖1高效液相?

管等

—?

混合器

程

A

高

壓■

—?

泵

制器

1

貯液槽

進(jìn)樣系統(tǒng)有由進(jìn)樣口、注射器、流通閥和定量

,其作用是使樣品有

效地送入色譜柱。進(jìn)樣系統(tǒng)是柱外效應(yīng)的重要來(lái)源之一，為了減少對(duì)柱高的影響，避免由柱外效應(yīng)而引起峰展寬。進(jìn)樣口要求死體積小，這樣能使樣品各組分幾乎同時(shí)進(jìn)入色譜柱。

色譜分離系統(tǒng)由色譜柱、柱恒溫器組成。色譜柱由柱管和固定相構(gòu)成，分為

普通分析柱（內(nèi)徑大約4?5mm）、半制備或制備柱（內(nèi)徑大于8mm）、窄柱（內(nèi)徑在2mm左右）以及微徑柱（內(nèi)徑小于1mm）,內(nèi)徑小的色譜柱相對(duì)更省溶劑,

相對(duì)靈敏度更高。柱恒溫箱是另一個(gè)重要的組成，柱溫是液相色譜的重要操作參數(shù)。高精度的溫度控制對(duì)保證色譜柱性能,進(jìn)行高精度、高重現(xiàn)性的分析是比不可少的。高效液相色譜儀的檢測(cè)器有紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器。

6.2操作高效液相色譜儀時(shí)需要注意哪些問(wèn)題？答：操作高效液相色譜儀時(shí)應(yīng)注意：

1）配置樣品時(shí)要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)配制對(duì)照品濃度（低濃度）,不可超過(guò)或低于一倍

2）所需玻璃儀器和容器,盡量選用棕色容量瓶進(jìn)行配制。每次臨用前需要用純水清洗干凈后,再用無(wú)水乙醇沖洗三次,陰（烤）干、冷卻后方可使用。

3）實(shí)驗(yàn)前要檢查儀器是否存在漏液現(xiàn)象、壓力是否穩(wěn)定、柱子是否安反。檢查完畢后,打開(kāi)電腦、工作站電源開(kāi)關(guān)后,再打開(kāi)泵電源開(kāi)關(guān)、控制面板上泵開(kāi)關(guān)。先用色譜甲醇沖洗柱子，等待機(jī)器平穩(wěn)后，再打開(kāi)檢測(cè)器電源開(kāi)關(guān)、控制面板上檢測(cè)器開(kāi)關(guān)。30分鐘后方可進(jìn)針做實(shí)驗(yàn)。

4）對(duì)照品與樣品進(jìn)樣量要盡量保持一致，樣品峰面積與對(duì)照品峰面積盡量保持一致（不要超過(guò)一倍，可適當(dāng)調(diào)整進(jìn)樣量或稀釋倍數(shù)）。

5）注意系統(tǒng)評(píng)價(jià)：理論板數(shù)（達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求）、分離度（大于1.5）、拖尾因子（0.95-1.05之間）。

6）平行進(jìn)針要求RSDV2%，進(jìn)樣針每次改進(jìn)不同樣品或?qū)φ掌窌r(shí)，需用色譜甲醇涮洗五次以上，涮洗位置要超過(guò)進(jìn)樣量位置。

7）操作過(guò)程中，應(yīng)注意機(jī)器異常情況的發(fā)生（聲音），壓力是否過(guò)高（超過(guò)200Bar不可再做實(shí)驗(yàn)），流動(dòng)相是否流空、廢液瓶是否已滿等等。

8）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用甲醇沖洗一小時(shí)，如果流動(dòng)相中含有酸或緩沖鹽，則先用新鮮純水沖洗0.5小時(shí)，再用甲醇沖洗一小時(shí)。

9）由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間加長(zhǎng)，導(dǎo)致對(duì)照品與樣品保留時(shí)間不一致時(shí)，在實(shí)驗(yàn)最后加進(jìn)一針對(duì)照品，或采用對(duì)照品加樣品同時(shí)進(jìn)樣的疊加法進(jìn)樣，對(duì)照峰面積是否為兩者之和。

簡(jiǎn)述高效液相色譜儀常用的檢測(cè)器及其特點(diǎn)。答：高效液相色譜儀常用的檢測(cè)器有紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器。其具有：①靈敏度高；②對(duì)各類組分化合物都有響應(yīng)或有特殊的選擇性；③線性范圍寬；④死體積??；⑤不破壞樣品；⑥性能穩(wěn)定，對(duì)溫度和流速的變化不敏感；⑦能連續(xù)工作，可靠方便。

紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器是高效液相色譜中應(yīng)用最廣的的檢測(cè)器，它對(duì)許多樣品具有高的靈敏度，最小檢測(cè)量可達(dá)10-9g。

熒光檢測(cè)器是選擇性檢測(cè)器，用于測(cè)定能發(fā)出熒光的物質(zhì)。示差折光檢測(cè)器是通用型檢測(cè)器，其利用純流動(dòng)相與含有被測(cè)組分的流動(dòng)相之間折射率的差別進(jìn)行檢測(cè)。凡具有與流動(dòng)相折射率不同的組分，均可適用這種檢測(cè)器。

二極管陣列檢測(cè)器是一種新型檢測(cè)器相當(dāng)于紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，進(jìn)入流動(dòng)池的不是單色光，得到的信號(hào)是在所有波長(zhǎng)上的三維色譜光譜信號(hào)。用以判別色譜分離的狀況及強(qiáng)化定量和定性分析。

6.4高效液相色譜的應(yīng)用——氨基酸分析答：氨基酸分析是生命科學(xué)研究中最重要的技術(shù)之一。多數(shù)氨基酸無(wú)紫外吸

收和熒光發(fā)射特性，示差折射檢測(cè)器對(duì)氨基酸也無(wú)足夠的靈敏度，為提高分析靈敏度和分離選擇性，需氨基衍生，衍生的方式有柱前衍生和柱后衍生。因此，反相高效液相色譜法與各種柱前衍生相結(jié)合的氨基酸分析技術(shù)，構(gòu)成了具有廣泛適用性的現(xiàn)代氨基酸分析技術(shù)

柱后衍生離子交換色譜儀具備很高的自動(dòng)化水平，分離氨基酸在特有柱后氧化及衍生中按固定程序與衍生試劑迅速反應(yīng)并檢測(cè)，消除由衍生時(shí)間、溫度等因素的差異帶來(lái)的測(cè)試誤差。衍生試劑不直接進(jìn)入色譜柱使柱