2022年醫(yī)學(xué)專題-細(xì)菌的培養(yǎng)及鑒定

細(xì)菌(xìjūn)培養(yǎng)及鑒定

第一頁，共六十頁。標(biāo)本(biāoběn)采集原則1.及時(shí)采集微生物標(biāo)本作病原學(xué)檢查(jiǎnchá)2.在抗菌藥物使用前采集標(biāo)本3.采樣時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作4.標(biāo)本容器須無菌，但不得有消毒劑5.采樣后立即送檢6.送檢標(biāo)本應(yīng)注明來源和檢驗(yàn)?zāi)康牡诙摚擦??？忍捣椒?fāngfǎ)病人(bìngrén)先漱口，清潔口腔，去除表面的菌群病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液無痰可用3％～5％NaCl5ml霧吸約5min導(dǎo)痰以清晨第二口痰為佳標(biāo)本采集后放置時(shí)間不超過2小時(shí)

第三頁，共六十頁。清潔(qīngjié)中段尿液盡量取早晨(zǎochen)第一次尿液囑患者留取標(biāo)本的前一天晚上少飲水女性病人收集標(biāo)本前用肥皂水沖洗外陰，再以滅菌清水沖洗尿道口排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人翻轉(zhuǎn)包皮，清洗尿道口排出幾毫升后，不停止尿流,采集中段尿

采集標(biāo)本后立即送檢！第四頁，共六十頁。哥倫比亞血平板—營養(yǎng)(yíngyǎng)要求高的細(xì)菌巧克力平板—含V、X因子，主要培養(yǎng)嗜血桿菌、腦膜炎球菌和淋球菌用中國藍(lán)/麥康凱平板—G-桿菌用SS平板—沙門氏菌和志賀氏菌用M-H平板—細(xì)菌藥敏用TCBS平板—弧菌科細(xì)菌用沙包氏平板—真菌培養(yǎng)用真菌顯色平板—真菌培養(yǎng)用羅氏培養(yǎng)基—分枝桿菌用常用的培養(yǎng)基種類(zhǒnglèi)和用途第五頁，共六十頁。臨床標(biāo)本(biāoběn)培養(yǎng)基選擇血：血培養(yǎng)瓶中斷尿：血平板(píngbǎn)、mac平板(píngbǎn)腦脊液：血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板穿刺液：血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板、mac平板膽汁：血平板、巧克力平板、mac平板大便:.麥康凱、SS、血平板第六頁，共六十頁。細(xì)菌(xìjūn)接種的基本程序滅菌(mièjūn)接種環(huán)沾取標(biāo)本(biāoběn)接種滅菌接種環(huán)第七頁，共六十頁。細(xì)菌(xìjūn)接種法平板劃線接種法：

★目的(mùdì)：使混合的細(xì)菌呈單個(gè)分散生長，形成單個(gè)菌落，以便獲得純菌。

★方法：★分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本★連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本第八頁，共六十頁。分區(qū)(fēnqū)劃線法(3區(qū))第一(dìyī)區(qū)劃線滅菌(mièjūn)接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第九頁，共六十頁。連續(xù)(liánxù)劃線法第十頁，共六十頁。細(xì)菌(xìjūn)培養(yǎng)法一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：★培養(yǎng)溫度：35℃（采用恒溫培養(yǎng)箱）★培養(yǎng)時(shí)間(shíjiān)：18～24h二氧化碳培養(yǎng)法：燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等第十一頁，共六十頁。細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長(shēngzhǎng)現(xiàn)象菌落★定義：指單個(gè)細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單一肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)?！锞涮卣鳎捍笮?、形狀(xíngzhuàn)、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性★菌落類型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）菌苔：指多個(gè)菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物。第十二頁，共六十頁。菌落第十三頁，共六十頁。菌落(jūnluò)與菌苔第十四頁，共六十頁。菌落(jūnluò)的三個(gè)類型：

1.光滑(guānghuá)型菌落（SmoothtypeColony）：又稱S型2.粗糙型菌落（RoughtypeColony）：又稱R型3.粘液型菌落（MucoidtypeColony）又稱M型第十五頁，共六十頁。2022/10/2616S型菌落(jūnluò)

第十六頁，共六十頁。R型菌落(jūnluò)第十七頁，共六十頁。M型菌落(jūnluò)第十八頁，共六十頁。革蘭染色(rǎnsè)原理：通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙，，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量(hánliàng)高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)復(fù)紅等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。第十九頁，共六十頁。革蘭染色(rǎnsè)步驟

涂片(túpiàn)包括涂片(túpiàn)、干燥、固定三步。涂片干燥固定第二十頁，共六十頁。固定(gùdìng)的目的：使細(xì)菌的細(xì)胞凝固，使菌體與玻片粘得更牢固；可改變菌體對(duì)染料的通透性；加熱(jiārè)固定可殺死細(xì)菌，比較安全。第二十一頁，共六十頁。

結(jié)晶(jiéjīng)紫1’

碘液1’

95%乙醇

30”

復(fù)紅1’

沖洗濾紙干燥

油鏡觀察沖洗(chōngxǐ)沖洗(chōngxǐ)沖洗革蘭染色程序初染媒染脫色復(fù)染第二十二頁，共六十頁。紫色（G＋）革蘭氏染色(rǎnsè)步驟示意圖革蘭染色(rǎnsè)甲菌乙菌初染結(jié)晶(jiéjīng)紫媒染碘液脫色乙醇復(fù)染稀釋復(fù)紅紫色（G＋）紅色（G-）革蘭染色步驟示意圖第二十三頁，共六十頁?！窘Y(jié)果(jiēguǒ)】細(xì)菌(xìjūn)被染成紫色者，稱為革蘭陽性菌；而細(xì)菌染成紅色者，稱為革蘭陰性菌；陽性菌——紫色（G+b)陰性菌——紅色(hóngsè)（G-b)第二十四頁，共六十頁。G+球菌(qiújūn)第二十五頁，共六十頁。顯微鏡下的桿菌(gǎnjūn)G-桿菌(gǎnjūn)Figure2-GramstainofGram-E.colicells第二十六頁，共六十頁。痰標(biāo)本(biāoběn)涂片染色低倍鏡下分類分級(jí)白細(xì)胞（個(gè)）上皮細(xì)胞（個(gè)）A>25<10B>25<25C<10>25A、B兩種情況的痰適合做培養(yǎng)(péiyǎng)，C不合格，應(yīng)重新留標(biāo)本第二十七頁，共六十頁。革蘭染色(rǎnsè)注意事項(xiàng)標(biāo)本涂片不宜太厚固定不宜過熱(ɡuòrè)脫色不宜過度選用培養(yǎng)18--24小時(shí)菌齡的細(xì)菌為宜第二十八頁，共六十頁?？顾崛旧?rǎnsè)原理：分枝桿菌細(xì)胞壁含脂質(zhì)較多,其中主要成分為分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色時(shí)與石炭酸復(fù)紅結(jié)合(jiéhé)牢固,能抵抗酸性乙醇的脫色作用,因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色,達(dá)到染色目的。第二十九頁，共六十頁。抗酸染色(rǎnsè)步驟

1、涂片包括(bāokuò)涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定第三十頁，共六十頁?？顾崛旧?rǎnsè)步驟2、染色包括(bāokuò)初染、脫色、復(fù)染三步。

石炭酸復(fù)紅維持3-5’

3%鹽酸酒精(jiǔjīng)30’’

~1’

美藍(lán)復(fù)染1’

沖洗干燥

油鏡觀察沖洗沖洗初染脫色復(fù)染第三十一頁，共六十頁?？顾崛旧?rǎnsè)結(jié)果抗酸菌呈紅色，常堆積成團(tuán)，排列無序，偶呈分枝(fēnzhī)狀生長。背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色。第三十二頁，共六十頁?？顾釛U菌(gǎnjūn)報(bào)告300個(gè)視野(shìyě)僅見到1—8條抗酸桿菌填寫條數(shù)1+：鏡檢查見3-9條抗酸桿菌/100高倍鏡視野2+：鏡檢查見1—9條抗酸桿菌/10高倍鏡視野3+：鏡檢查見1-9條抗酸桿菌/高倍鏡視野4+:鏡檢查見>9條抗酸桿菌/高倍鏡視野第三十三頁，共六十頁?？顾崛旧?rǎnsè)注意事項(xiàng)染色充分脫色時(shí)間寧長勿短在涂抹痰標(biāo)本時(shí)嚴(yán)禁(yánjìn)對(duì)載玻片進(jìn)行加熱第三十四頁，共六十頁。臨床標(biāo)本(biāoběn)培養(yǎng)基選擇生殖道標(biāo)本(biāoběn)根據(jù)臨床醫(yī)生所寫的檢驗(yàn)項(xiàng)目接種相應(yīng)的平板及操作：

淋球菌培養(yǎng)接種淋球菌平板;念珠菌培養(yǎng)接種沙保羅培養(yǎng)基；支原體培養(yǎng)則按《支原體培養(yǎng)的操作規(guī)程》操作；作普通培養(yǎng)則接種血平板和巧克力平板

第三十五頁，共六十頁。觀察細(xì)菌在平板(píngbǎn)上的生長現(xiàn)象血平板：大小、形狀、邊緣(biānyuán)、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性mac平板：大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、黏度巧克力平板：大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、黏度第三十六頁，共六十頁。2022/10/2637革蘭陰性菌葡萄球菌(pútáoqiújūn)第三十七頁，共六十頁。細(xì)菌(xìjūn)的初步分類細(xì)菌的分離與純化：自血平板挑出待檢菌株的單菌落進(jìn)行初步的鑒定。如果混有雜菌，應(yīng)該重新轉(zhuǎn)種分純。染色與鏡檢：首先通過革蘭氏染色確定基本(jīběn)的分類：（1）G+球菌（2）G-球菌（3）G-桿菌（4）G+桿菌。此外，如果鏡下發(fā)現(xiàn)革蘭氏染色陽性、橢圓形、有芽孢狀的較大菌體，可能是真菌。第三十八頁，共六十頁。金黃色葡萄球菌(pútáoqiújūn)最重要的致病葡萄球菌血平板上菌落有明顯β溶血環(huán)，顏色呈金黃色、灰白色或檸檬色分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇血漿(xuèjiāng)凝固酶和DNA酶陽性

第三十九頁，共六十頁。第四十頁，共六十頁。2022/10/2641葡萄球菌(pútáoqiújūn)第四十一頁，共六十頁。第四十二頁，共六十頁。第四十三頁，共六十頁。念珠菌顯色(xiǎnsè)培養(yǎng)基

綠色—白色念珠菌藍(lán)色—熱帶念珠菌白色—其他，細(xì)菌(xìjūn)被抑制紫色—光滑粉色—克柔假絲酵母菌第四十四頁，共六十頁。第四十五頁，共六十頁。第四十六頁，共六十頁。嗜血桿菌(gǎnjūn)的鑒定途徑只能在營養(yǎng)條件高的巧克力平板上生長，菌落為中等(zhōngděng)大小、圓形、灰白色、透明革蘭染色：G-小桿菌衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)就可以幫助初步鑒定第四十七頁，共六十頁。2022/10/2648嗜血(shìxuè)桿菌第四十八頁，共六十頁。奈瑟氏菌屬鑒定(jiàndìng)在血平板和巧克力平板上生長，mac上不生長血平板形成灰色、濕潤、透明或半透明、不溶血的菌落巧克力平板上形成圓形、灰藍(lán)色的似露滴狀菌落革蘭染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆形，凹面相對(duì)(xiāngduì)氧化酶和觸酶都均為陽性第四十九頁，共六十頁。

奈瑟氏菌屬有11個(gè)種，臨床(línchuánɡ)就淋病奈

菌和腦膜炎奈瑟菌最為重要第五十頁，共六十頁。奈瑟氏菌屬鑒定(jiàndìng)流程

菌落觀察：灰色(huīsè)、濕潤、透明或半透明、不溶血

涂片染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆?fàn)?/p>

氧化酶試驗(yàn)+觸酶+

+麥芽糖--

腦膜炎奈瑟菌

淋病奈瑟菌第五十一頁，共六十頁。細(xì)菌(xìjūn)的鑒定與藥敏第五十二頁，共六十頁。衛(wèi)生部重點(diǎn)(zhòngdiǎn)監(jiān)控的6種MDRO

MASA:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌—判斷標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)苯唑西林耐藥或頭孢西丁誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)陽性(yángxìng)CRAB：耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌—判斷標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)亞胺培南或美羅培南耐藥

VER：耐萬古霉素腸球菌—判斷標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)萬古霉素耐藥第五十三頁，共六十頁。ESBLs：產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶細(xì)菌。包括：大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌等—判斷(pànduàn)標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)第3代和第4代頭孢菌素和氨曲南耐藥CRE:耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌—判斷標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)亞胺培南等碳青霉烯類耐藥MDR/XDROA:多重耐藥/泛耐藥銅綠假單胞菌—判斷標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)亞胺培南等碳青霉烯類耐藥第五十四頁，共六十頁。臨床(línchuánɡ)常見問題痰涂片與痰培養(yǎng)結(jié)果不一致？