高三生物一輪復習知識點整理必背 課題2土壤中分離尿素的細菌的分離和計數(shù)

1、專題二：微生物的培養(yǎng)和應用課題2：土壤中分離尿素的細菌的分離與計數(shù)一、尿素的基礎知識1、尿素（又稱脲）的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物利用。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌能利用尿素的原因：土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶，分解尿素為二氧化碳和氨氣。3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素二、課題目的從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌用選擇培養(yǎng)基來篩選統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌用活菌計數(shù)法計數(shù)三、研究思路1、篩選菌株如實例： PCR技術(shù)DNA多聚酶鏈式反應

2、是一種在體外將少量DNA大量復制(PCR)的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用耐高溫（93）的DNA聚合酶。1966年美國微生物學家魯克在黃石國家公園的熱泉中發(fā)現(xiàn)一種耐熱細菌Taq；并從該細菌體內(nèi)分離出了耐高泉中溫的DNA聚合酶。（1）Taq細菌能從熱泉中被篩選出來的原因：熱泉溫度70800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細菌被篩選出來（2）Taq酶的發(fā)現(xiàn)對微生物的篩選有何啟示？啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。四、實驗室中微生物的篩選原理1、（選擇培養(yǎng)基）篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長2、根據(jù)微生物在

3、營養(yǎng)、生理、生長條件等方面的特點：（1）抑制大多數(shù)微生物的生長（2）促進目的菌株的生長（3）結(jié)果：培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純化培養(yǎng)分離。3、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理在以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基上，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。以尿素作為氮源，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，這些微生物因缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。思考：（1）利用尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基分離出只有一種微生物嗎？ 不是，芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。（2）分離出

4、來的都是能分解尿素的微生物嗎？不一定。因為有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物進行生長繁殖，因此要進行進一步的鑒定。五、實驗結(jié)果的檢測方法1、檢測氨氣的產(chǎn)生：方法：在以尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，接種培養(yǎng)該細菌，若指示劑變紅，說明該種菌分解了尿素。方法：細菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基堿性增強，pH升高，因此可通過檢測培養(yǎng)基的pH的變化來判斷該化學反應是否發(fā)生。2、統(tǒng)計菌落（1）顯微鏡直接計數(shù)：利用血球計數(shù)板(血細胞計數(shù)板），在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。缺點：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以

5、觀察；（2）活菌計數(shù)法稀釋涂布平板法原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。方法：稀釋涂布平板法計算：每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。例：兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。a、甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。b、乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數(shù)的

6、平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。你認為這兩位同學的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？甲：沒有重復實驗（至少涂布3個平板）乙：A組結(jié)果誤差過大，不應用于計算平均值以上實驗（1）說明設置重復組的重要性：在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性。（2）計數(shù)原則：一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進行計數(shù)（50個左右為最佳），每個稀釋度取3個平板取其平均值。（3）統(tǒng)計結(jié)果：因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，所以統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低，因此統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)表示。（4）在一定的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，包括菌落的形狀。

7、大小、隆起程度和顏色等方面。（5）實驗需要設置對照：對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。六、實驗操作實驗步驟：獲取土樣，配制土壤溶液樣品系列稀釋涂布平板與培養(yǎng)菌落計數(shù)（一）土壤取樣（土壤是“微生物的天然培養(yǎng)基”，土壤中的微生物大約70%90%是細菌）（1）取樣位置：從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣先鏟去表層土38cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中（2）取樣要求：鏟去表層土。注意：取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌（二）制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。（三）樣品稀釋應在火焰旁稱取土壤10g。在稀釋土壤溶液的過

8、程中，每一步都要在火焰旁進行分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間適于計數(shù)的平板取樣涂布注意：實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。（四）微生物的培養(yǎng)和觀察1、培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度：細菌：3037 培養(yǎng)12d放線菌：2528 培養(yǎng)57d霉菌：2528 培養(yǎng)34d2、在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目。（五）結(jié)果分析與評價1.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個平板上長有30300個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確3鑒定在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。延伸：測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后將濾膜放到伊紅-美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)深紫色，通過記算得出水樣中大腸桿