基因工程04課件

1、第4章 人工染色體載體 黏粒載體酵母人工染色體載體細菌人工染色體載體P1噬菌體載體和P1人工染色體載體表4-1 5種常見高容量克隆載體及其基本特性載體容量（kb）復制子宿主拷貝數(shù)重組DNA導入宿主的方式篩選標記克隆DNA獲取方法黏粒30-45ColE1大腸桿菌高轉(zhuǎn)導堿抽提P170-100P1大腸桿菌1轉(zhuǎn)導sacBPAC130-150P1大腸桿菌1電轉(zhuǎn)化sacBBAC120-300F大腸桿菌1電轉(zhuǎn)化-互補YAC250-400ARS酵母菌1轉(zhuǎn)化ade2脈沖場電泳4.1 黏粒載體4.1.1 黏粒的結(jié)構(gòu)特征和用途黏粒（cosmid）是質(zhì)粒的衍生物，是帶有cos序列的質(zhì)粒。cos序列是噬菌體DNA中將D

2、NA包裝到噬菌體顆粒中所需的DNA序列。黏粒的組成包括質(zhì)粒復制起點（ColE1）、抗性標記（ampr）、cos位點，能像質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。它的大小:5-7kb，用來克隆大片段DNA，克隆的最大DNA片段可達45kb。4.1.2 黏粒載體的工作原理圖4-1黏粒載體克隆DNA的一般原理和步驟4.1.3 黏?？寺≥d體 1黏粒pJB8大小為5.4kb，由ampr，ColE1復制起點（ori），cos位點，多克隆位點組成，可容納33-46.5kb外源DNA片段（圖4-2），主要用來在細菌中克隆真核DNA。圖4-2 pJB8圖譜圖4-4 Supercos-1克隆的原理和步驟Supercos-1大小為7.

3、94kb，含有在真核細胞中起作用的來自猿猴病毒SV40的復制起點ori-SV40和新霉素抗性基因（neor）。 4.2 酵母人工染色體載體YAC:酵母人工染色體載體是利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色體的復制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中。YAC:Yeast Artificial ChromosomeYAC載體必須含有元件YAC載體為能夠滿足自主復制、染色體在子代細胞間的分離及保持染色體穩(wěn)定的需要，必須含有以下元件：端粒重復序列（telomeric repeat， TEL），定位于染色體末端一段序列，用于保護線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形

4、成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。著絲粒（centromere， CEN），有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細胞中。在YAC中起到保證一個細胞內(nèi)只有一個人工染色體的作用。如pYAC4使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。自主復制序列（autonomously replication sequences，ARS）一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進行雙向復制所必須的信號。YAC載體的選擇標記采用營養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突變抑制基因sup4。與YAC載體配套工作的宿主酵母菌（如AB1380

5、）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變ade2-1。帶有這個突變的酵母菌在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當帶有赭石突變抑制基因sup4的載體存在于細胞中時，可抑制ade2-1基因的突變效應，形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，可用于篩選載體中含有外源DNA片段插入的重組子。宿主菌：赭石突變:突變?yōu)?UAA，紅色菌落載體上：赭石突變抑制基因sup44.2.2 YAC載體的工作原理YAC載體主要是用來構(gòu)建大片段DNA文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫。 圖4-5 酵母人工染色體載體 4.3 細菌人工染色體載體細菌人工染色體是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的高通量低拷貝的質(zhì)粒載體。F質(zhì)粒是一

6、個約100kb的質(zhì)粒，編碼60多種參與復制、分配和接合過程的蛋白質(zhì)。雖然F質(zhì)粒通常以雙鏈閉環(huán)DNA（1-2拷貝/細胞）的形式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少30個位點處進行隨機整合。攜帶F質(zhì)粒的細胞（以游離狀態(tài)或以整合狀態(tài)）可表達發(fā)樣狀的性菌毛，通過性菌毛F質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)移給受體細胞。4.3.1 BAC載體及其結(jié)構(gòu)組成約7.5kb，其本質(zhì)實際上是一個質(zhì)?？寺≥d體。復制單元的特殊性:來自F質(zhì)粒，包括嚴謹型控制的復制區(qū)oriS，啟動DNA復制的由ATP驅(qū)動的解旋酶（RepE）以及3個確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細胞的基因座（parA、parB和parC）。低拷貝性可以減小外源基因的表達產(chǎn)物對宿主細

7、胞的毒副作用。標記基因:氯霉素抗性基因4.3.2 BAC載體工作原理BAC文庫的構(gòu)建關(guān)鍵步驟有兩步 （1）大片段DNA的制備 （2）高質(zhì)量BAC載體的制備和處理。目的細胞用瓊脂糖凝膠包埋，包埋塊作破細胞處理，并對其總DNA作原位限制性酶切，經(jīng)脈沖場凝膠電泳分離出目的大小的酶切DNA片段。載體與目的DNA片段連接，電轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌（常使用的是DH10B菌株）中，在氯霉素抗性和IPTG誘導平板上挑選白色菌落。白色菌落構(gòu)成了目的生物基因組的BAC文庫。4.4 P1噬菌體載體和P1人工染色體載體4.4.1 P1噬菌體載體的分子遺傳特征P1噬菌體感染性顆粒中的噬菌體基因組為雙鏈線狀DNA，大小約為11

8、0 kb，兩端各有約10 kb的末端冗余序列。當噬菌體基因組進入宿主細胞后，在冗余序列之間發(fā)生重組，形成環(huán)狀基因組。其后噬菌體由c基因調(diào)節(jié)進入溶原或裂解狀態(tài)。 裂解生長和噬菌體的包裝當C阻遏物濃度不足以維持溶原狀態(tài)時，噬菌體進入裂解生長狀態(tài)。此時噬菌體基因組通過裂解性復制子進行復制，繼而轉(zhuǎn)為滾環(huán)復制，產(chǎn)生頭尾相連的基因組多聯(lián)體。該多聯(lián)體可作為噬菌體顆粒包裝的底物。由于基因組的大小是90 kb，多聯(lián)體的重復間距是90 kb，而包裝的大小卻為100 kb，因此，被包裝的DNA中除了基因組DNA外還有末端冗余，而且在同一個多聯(lián)體中被包裝的DNA片段的末端都是不一樣的，在噬菌體顆粒中基因組的基因是循環(huán)

9、排列的。包裝從多聯(lián)體一端的pac位點開始，每100 kb被包裝到噬菌體顆粒中去，一個多聯(lián)體可供包裝大約4個噬菌體。 圖4-8 P1噬菌體DNA多聯(lián)體的包裝 P1噬菌體的溶原狀態(tài)P1噬菌體DNA在環(huán)化以后進入溶原狀態(tài)，但其前噬菌體的存在與前噬菌體的存在狀態(tài)完全不同。前噬菌體是整合到宿主的基因組中，而P1前噬菌體卻是以附加體的形式，就像質(zhì)粒一樣游離于宿主的染色體之外，以單拷貝質(zhì)粒的形式進行復制并分配到子細胞中去。此時，除控制溶原狀態(tài)的c等少數(shù)基因表達外，P1噬菌體中的絕大多數(shù)處于沉默狀態(tài)。 4.4.2 P1噬菌體載體與黏粒載體工作原理比較相似的一種高容量載體。它含有很多P1噬菌體的順式作用元件，能

10、容納70-100kb大小的基因組DNA片段。圖4-9 P1噬菌體載體pAd10sacBII圖譜 P1噬菌體載體的工作原理用Sca將P1噬菌體載體切成線狀，再用BamH消化，同時基因組DNA用Sau3A或Mob部分酶切，回收70-100 kb的酶切片段。將酶切片段與酶切后的載體連接，然后用P1噬菌體包裝蛋白進行包裝，再感染大腸桿菌。重組DNA注射到Cre重組酶的大腸桿菌中，線狀DNA分子通過重組于載體的兩個loxP位點之間的重組而發(fā)生環(huán)化。將感染的細胞置于含卡那霉素和5%蔗糖的培養(yǎng)基上篩選，只有含載體分子且sacB基因中插入了外源片段的細胞才能生長。(插入失活）4.4.3 P1人工染色體載體P1人工染色體載體結(jié)合了P1載體和BAC載體的最佳特性，相當于P1噬菌體載體的改進載體。PAC載體pCYPAC1（圖4-11），與pAd10sacBII相比，去掉了填充片段和pac位點，而且