基因工程04課件

1、第4章 人工染色體載體 黏粒載體酵母人工染色體載體細(xì)菌人工染色體載體P1噬菌體載體和P1人工染色體載體表4-1 5種常見高容量克隆載體及其基本特性載體容量（kb）復(fù)制子宿主拷貝數(shù)重組DNA導(dǎo)入宿主的方式篩選標(biāo)記克隆DNA獲取方法黏粒30-45ColE1大腸桿菌高轉(zhuǎn)導(dǎo)堿抽提P170-100P1大腸桿菌1轉(zhuǎn)導(dǎo)sacBPAC130-150P1大腸桿菌1電轉(zhuǎn)化sacBBAC120-300F大腸桿菌1電轉(zhuǎn)化-互補(bǔ)YAC250-400ARS酵母菌1轉(zhuǎn)化ade2脈沖場(chǎng)電泳4.1 黏粒載體4.1.1 黏粒的結(jié)構(gòu)特征和用途黏粒（cosmid）是質(zhì)粒的衍生物，是帶有cos序列的質(zhì)粒。cos序列是噬菌體DNA中將D

2、NA包裝到噬菌體顆粒中所需的DNA序列。黏粒的組成包括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（ColE1）、抗性標(biāo)記（ampr）、cos位點(diǎn)，能像質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。它的大小:5-7kb，用來克隆大片段DNA，克隆的最大DNA片段可達(dá)45kb。4.1.2 黏粒載體的工作原理圖4-1黏粒載體克隆DNA的一般原理和步驟4.1.3 黏?？寺≥d體 1黏粒pJB8大小為5.4kb，由ampr，ColE1復(fù)制起點(diǎn)（ori），cos位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)組成，可容納33-46.5kb外源DNA片段（圖4-2），主要用來在細(xì)菌中克隆真核DNA。圖4-2 pJB8圖譜圖4-4 Supercos-1克隆的原理和步驟Supercos-1大小為7.

3、94kb，含有在真核細(xì)胞中起作用的來自猿猴病毒SV40的復(fù)制起點(diǎn)ori-SV40和新霉素抗性基因（neor）。 4.2 酵母人工染色體載體YAC:酵母人工染色體載體是利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中。YAC:Yeast Artificial ChromosomeYAC載體必須含有元件YAC載體為能夠滿足自主復(fù)制、染色體在子代細(xì)胞間的分離及保持染色體穩(wěn)定的需要，必須含有以下元件：端粒重復(fù)序列（telomeric repeat， TEL），定位于染色體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形

4、成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。著絲粒（centromere， CEN），有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)人工染色體的作用。如pYAC4使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。自主復(fù)制序列（autonomously replication sequences，ARS）一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號(hào)。YAC載體的選擇標(biāo)記采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突變抑制基因sup4。與YAC載體配套工作的宿主酵母菌（如AB1380

5、）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個(gè)赭石突變ade2-1。帶有這個(gè)突變的酵母菌在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當(dāng)帶有赭石突變抑制基因sup4的載體存在于細(xì)胞中時(shí)，可抑制ade2-1基因的突變效應(yīng)，形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，可用于篩選載體中含有外源DNA片段插入的重組子。宿主菌：赭石突變:突變?yōu)?UAA，紅色菌落載體上：赭石突變抑制基因sup44.2.2 YAC載體的工作原理YAC載體主要是用來構(gòu)建大片段DNA文庫(kù)，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫(kù)。 圖4-5 酵母人工染色體載體 4.3 細(xì)菌人工染色體載體細(xì)菌人工染色體是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的高通量低拷貝的質(zhì)粒載體。F質(zhì)粒是一

6、個(gè)約100kb的質(zhì)粒，編碼60多種參與復(fù)制、分配和接合過程的蛋白質(zhì)。雖然F質(zhì)粒通常以雙鏈閉環(huán)DNA（1-2拷貝/細(xì)胞）的形式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少30個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)行隨機(jī)整合。攜帶F質(zhì)粒的細(xì)胞（以游離狀態(tài)或以整合狀態(tài)）可表達(dá)發(fā)樣狀的性菌毛，通過性菌毛F質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)移給受體細(xì)胞。4.3.1 BAC載體及其結(jié)構(gòu)組成約7.5kb，其本質(zhì)實(shí)際上是一個(gè)質(zhì)?？寺≥d體。復(fù)制單元的特殊性:來自F質(zhì)粒，包括嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制區(qū)oriS，啟動(dòng)DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動(dòng)的解旋酶（RepE）以及3個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座（parA、parB和parC）。低拷貝性可以減小外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)

7、胞的毒副作用。標(biāo)記基因:氯霉素抗性基因4.3.2 BAC載體工作原理BAC文庫(kù)的構(gòu)建關(guān)鍵步驟有兩步 （1）大片段DNA的制備 （2）高質(zhì)量BAC載體的制備和處理。目的細(xì)胞用瓊脂糖凝膠包埋，包埋塊作破細(xì)胞處理，并對(duì)其總DNA作原位限制性酶切，經(jīng)脈沖場(chǎng)凝膠電泳分離出目的大小的酶切DNA片段。載體與目的DNA片段連接，電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌（常使用的是DH10B菌株）中，在氯霉素抗性和IPTG誘導(dǎo)平板上挑選白色菌落。白色菌落構(gòu)成了目的生物基因組的BAC文庫(kù)。4.4 P1噬菌體載體和P1人工染色體載體4.4.1 P1噬菌體載體的分子遺傳特征P1噬菌體感染性顆粒中的噬菌體基因組為雙鏈線狀DNA，大小約為11

8、0 kb，兩端各有約10 kb的末端冗余序列。當(dāng)噬菌體基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞后，在冗余序列之間發(fā)生重組，形成環(huán)狀基因組。其后噬菌體由c基因調(diào)節(jié)進(jìn)入溶原或裂解狀態(tài)。 裂解生長(zhǎng)和噬菌體的包裝當(dāng)C阻遏物濃度不足以維持溶原狀態(tài)時(shí)，噬菌體進(jìn)入裂解生長(zhǎng)狀態(tài)。此時(shí)噬菌體基因組通過裂解性復(fù)制子進(jìn)行復(fù)制，繼而轉(zhuǎn)為滾環(huán)復(fù)制，產(chǎn)生頭尾相連的基因組多聯(lián)體。該多聯(lián)體可作為噬菌體顆粒包裝的底物。由于基因組的大小是90 kb，多聯(lián)體的重復(fù)間距是90 kb，而包裝的大小卻為100 kb，因此，被包裝的DNA中除了基因組DNA外還有末端冗余，而且在同一個(gè)多聯(lián)體中被包裝的DNA片段的末端都是不一樣的，在噬菌體顆粒中基因組的基因是循環(huán)

9、排列的。包裝從多聯(lián)體一端的pac位點(diǎn)開始，每100 kb被包裝到噬菌體顆粒中去，一個(gè)多聯(lián)體可供包裝大約4個(gè)噬菌體。 圖4-8 P1噬菌體DNA多聯(lián)體的包裝 P1噬菌體的溶原狀態(tài)P1噬菌體DNA在環(huán)化以后進(jìn)入溶原狀態(tài)，但其前噬菌體的存在與前噬菌體的存在狀態(tài)完全不同。前噬菌體是整合到宿主的基因組中，而P1前噬菌體卻是以附加體的形式，就像質(zhì)粒一樣游離于宿主的染色體之外，以單拷貝質(zhì)粒的形式進(jìn)行復(fù)制并分配到子細(xì)胞中去。此時(shí)，除控制溶原狀態(tài)的c等少數(shù)基因表達(dá)外，P1噬菌體中的絕大多數(shù)處于沉默狀態(tài)。 4.4.2 P1噬菌體載體與黏粒載體工作原理比較相似的一種高容量載體。它含有很多P1噬菌體的順式作用元件，能

10、容納70-100kb大小的基因組DNA片段。圖4-9 P1噬菌體載體pAd10sacBII圖譜 P1噬菌體載體的工作原理用Sca將P1噬菌體載體切成線狀，再用BamH消化，同時(shí)基因組DNA用Sau3A或Mob部分酶切，回收70-100 kb的酶切片段。將酶切片段與酶切后的載體連接，然后用P1噬菌體包裝蛋白進(jìn)行包裝，再感染大腸桿菌。重組DNA注射到Cre重組酶的大腸桿菌中，線狀DNA分子通過重組于載體的兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的重組而發(fā)生環(huán)化。將感染的細(xì)胞置于含卡那霉素和5%蔗糖的培養(yǎng)基上篩選，只有含載體分子且sacB基因中插入了外源片段的細(xì)胞才能生長(zhǎng)。(插入失活）4.4.3 P1人工染色體載體P1人工染色體載體結(jié)合了P1載體和BAC載體的最佳特性，相當(dāng)于P1噬菌體載體的改進(jìn)載體。PAC載體pCYPAC1（圖4-11），與pAd10sacBII相比，去掉了填充片段和pac位點(diǎn)，而且