核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制(王鳳鳴)課件

1、核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制(王鳳鳴)核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制(王鳳鳴)目 錄一、PCR實驗技術(shù)操作要點二、質(zhì)量控制要點三、實驗室生物安全管理目 錄一、PCR實驗技術(shù)操作要點一、PCR實驗技術(shù)操作要點一、PCR實驗技術(shù)操作要點常用儀器設(shè)備常用儀器設(shè)備加樣器PCR實驗室應(yīng)備有4套連續(xù)可調(diào)加樣器，分別用于試劑準備、樣本處理、擴增和產(chǎn)物檢測四個試驗區(qū)。加樣器PCR實驗室應(yīng)備有4套連續(xù)可調(diào)加樣器，分別用于試劑準備加樣器的類型單道連續(xù)可調(diào)式移液器多通道連續(xù)可調(diào)式移液器單道連續(xù)移液器單道移液管配合使用的移液器加樣器的類型單道連續(xù)可調(diào)式移液器加樣器的使用加樣器的使用核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制(王鳳鳴)加樣器的校準校準方

2、式 計量局 廠家 自較時間 視使用頻率定（6個月-1年）加樣器的校準校準方式加樣器-注意事項 根據(jù)所需取液量選擇相應(yīng)的移液器及吸頭，基因擴增實驗要求使用帶濾芯的吸頭，防止交叉污染。加樣器-注意事項 根據(jù)所需取液量選擇相應(yīng)的移液器及吸頭，基吸取液體時應(yīng)緩慢勻速吸取，避免液體濺到移液器頭上；打出液體后拇指不應(yīng)松開按鈕，將吸液嘴壓掉后再將拇指松開，避免液體回吸。在調(diào)整取液量的旋鈕時，不要用力過猛，并應(yīng)注意計數(shù)器顯示的數(shù)值不要超過其可調(diào)范圍。連續(xù)可調(diào)式移液器不可在無吸頭時使用，吸頭有液體時不可平放或倒置。加樣器-注意事項 吸取液體時應(yīng)緩慢勻速吸取，避免液體濺到移液器頭上；打出液體后（一）高速（冷凍）離

3、心機電機轉(zhuǎn)速 最低轉(zhuǎn)速 最高轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)頭消毒方式標準配件系統(tǒng)噪音（一）高速（冷凍）離心機電機高速（冷凍）離心機-使用方法離心機應(yīng)放置在水平堅固的地板或平臺上，并力求使機器處于水平位置以免離心時造成機器震動。打開電源開關(guān)，按要求裝上所需的轉(zhuǎn)頭，將預(yù)先平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上，關(guān)閉機蓋。按功能選擇鍵，設(shè)置各項要求：溫度、速度、時間、加速度及減速度，帶電腦控制的機器還需按儲存鍵，以便記憶輸入的各項信息。待離心機完全停止轉(zhuǎn)動時打開機蓋，取出離心樣品，用柔軟干凈的布擦凈轉(zhuǎn)頭和機腔內(nèi)壁，待離心機腔內(nèi)溫度與室溫平衡后方可蓋上機蓋。高速（冷凍）離心機-使用方法離心機應(yīng)放置在水平堅固的地板或平機體應(yīng)始終處于水

4、平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線。開機前應(yīng)檢查轉(zhuǎn)頭按裝是否牢固，機腔有無異物掉入。離心機運行時，離心機周圍30cm范圍內(nèi)不能有人和危險物品。揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時，應(yīng)使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機腔或造成事故。高速（冷凍）離心機-使用方法機體應(yīng)始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良易燃易爆以及易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)不能離心。在沒有相應(yīng)的防護措施時，不能離心有毒的、放射性的物質(zhì)或病原微生物。離心機運行時不可人為地打開蓋子。如果轉(zhuǎn)頭和蓋子有可見的腐蝕或磨損的痕跡，則應(yīng)立即停止使用。使用的玻璃或塑料離心管應(yīng)能承受相應(yīng)的離心力并大小合適。非金屬

5、轉(zhuǎn)頭不可用紫外照射。高速（冷凍）離心機-使用方法易燃易爆以及易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)不能離心。高速（冷凍）全自動核酸提取儀全自動核酸提取儀全自動核酸提取儀全自動核酸提取儀核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制(王鳳鳴)核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制(王鳳鳴)核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制(王鳳鳴)基于核酸的分子診斷技術(shù)基于核酸的分子診斷技術(shù)病毒顆粒DNARNAFQ-PCRRT-FQ PCR裂解熒光信號檢測核酸提取熒光PCR檢測系統(tǒng)熒光定量PCR檢測加樣病毒顆粒DNARNAFQ-PCRRT-FQ PCR裂解熒光信病毒熒光定量PCR反應(yīng)內(nèi)容1份樣品的量DEPCH2O2.875ulMaster MIX6.25ulRT-MIX0.

6、125ul引物0.25ul探針0.25ul程序循環(huán)數(shù)溫度反應(yīng)時間115030min219515min3459515sec601min反應(yīng)體系配置反應(yīng)條件設(shè)置對照設(shè)置：陰性對照：滅菌雙蒸水代替標本陽性對照：提取好的陽性核酸標本病毒熒光定量PCR反應(yīng)內(nèi)容1份樣品的量DEPCH2O2.8典型熒光定量PCR結(jié)果 陽性標本擴增曲線 陰性標本擴增曲線典型熒光定量PCR結(jié)果 陽性標本擴增曲線 二、質(zhì)量控制要點 二、質(zhì)量控制要點PCR實驗技術(shù)的質(zhì)量控制要點 分子生物學實驗室的質(zhì)量控制涉及到整個基因檢測擴增的所有階段，確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性，嚴禁各類交叉污染事故的發(fā)生。PCR實驗技術(shù)的質(zhì)量控制要點 分子生

7、物學實驗PCR實驗技術(shù)的質(zhì)量控制要點 PCR實驗的過程主要包括：標本處理與核酸提取擴增試劑的準備核酸擴增與產(chǎn)物分析測定后的結(jié)果報告PCR實驗技術(shù)的質(zhì)量控制要點 PCR實驗的過程主要包括：PCR實驗技術(shù)的質(zhì)量控制要點 高質(zhì)量無污染無降解的核酸制備嚴格實行分區(qū)操作試劑儲存和準備區(qū)標本處理和核酸制備區(qū)核酸擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)實驗人員的操作技能PCR實驗技術(shù)的質(zhì)量控制要點 高質(zhì)量無污染無降解的核酸制備理想的PCR實驗室分區(qū)設(shè)計模式產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴增區(qū)標本制備區(qū)試劑準備區(qū)各區(qū)獨立注意風向因地制宜方便工作“十六字口訣”PCR實驗室設(shè)計的一般原則

8、理想的PCR實驗室分區(qū)設(shè)計模式產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣標本處理與核酸提取的質(zhì)量控制核酸提取試劑的選擇核酸擴增試劑的選擇試劑的分裝保存試劑的配置對照的設(shè)立核酸擴增儀器擴增參數(shù)的設(shè)定標本處理與核酸提取的質(zhì)量控制核酸提取試劑的選擇擴增產(chǎn)物的檢測與分析熒光定量普通凝膠電泳毛細管電泳擴增產(chǎn)物的檢測與分析污染的控制和預(yù)防常見污染的來源控制污染的措施消除污染的措施污染的控制和預(yù)防常見污染的來源三、實驗室生物安全管理三、實驗室生物安全管理為什么關(guān)注實驗室生物安全？ 三起SARS疫情后期的實驗室感染事件2003年9月8日：新加坡國立大學實驗室，在P3實驗室同時開展西尼羅病毒與SARS病毒的研究，一位27歲

9、華人研究員感染；2003年12月6日：臺灣省國防大學預(yù)防醫(yī)學研究所，一名47歲的中校研究員，在P3實驗室內(nèi)清理SARS實驗后的廢棄物時，未戴手套，因而感染；2004年4月22日：中國CDC病毒所，跨室開展SARS病毒研究，并引發(fā)三代、9例 病例、1例死亡；另有兩例 “隱性”感染者。為什么關(guān)注實驗室生物安全？ 三起SARS疫情后期的實驗室引起實驗室生物污染的原因很多很多人員生物安全概念薄弱和技術(shù)操作不當；生物安全柜和高壓滅菌容器的不正常使用或使用不當；樣品傳遞、接受和使用、裝有凍干感染性物質(zhì)安瓿的打開；勻漿器、組織研磨器、搖床、攪拌器和超聲處理器的使用；離心機內(nèi)裝有潛在感染性物質(zhì)的離心管發(fā)生破裂

10、引起實驗室生物污染的原因很多很多人員生物安全概念薄弱和技術(shù)操生物安全的概念實驗室生物安全 避免危險生物因子造成實驗室人員暴露、向?qū)嶒炇彝鈹U散并導(dǎo)致危害的綜合措施。生物安全三個方面： 一指人類的健康安全；二指人類賴以生存的農(nóng)業(yè)生物安全；三指與人類生存有關(guān)的環(huán)境生物安全。生物安全的概念實驗室生物安全微生物實驗室生物安全三項技術(shù)措施樣品隔離技術(shù)（機械、氣幕)：防止傳染因子進入環(huán)境接觸人體定向氣流技術(shù)（負壓系統(tǒng))：防止傳染因子擴散消毒滅菌技術(shù)（物理、化學)：滅活傳染因子微生物實驗室生物安全三項技術(shù)措施實驗室可以分為基礎(chǔ)實驗室 一級生物安全水平基礎(chǔ)實驗室 二級生物安全水平防護實驗室 三級生物安全水平最高

11、防護實驗室 四級生物安全水平根據(jù)操作不同危險度等級微生物所需的實驗室設(shè)計特點、建筑構(gòu)造、防護設(shè)施、儀器、操作以及操作程序來決定實驗室的生物安全水平。實驗室可以分為基礎(chǔ)實驗室 一級生物安全水平實驗室生物安全防護屏障一級防護屏障生物安全柜和個人防護裝備等構(gòu)成的防護屏障。實驗室生物安全防護屏障一級防護屏障生物安全柜 高效空氣過濾器。生物安全柜 高效空氣過濾器。核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制(王鳳鳴)核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制(王鳳鳴)核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制(王鳳鳴)李燕44實驗室生物安全防護屏障二級防護屏障設(shè)施結(jié)構(gòu)和通風系統(tǒng)等構(gòu)成的防護屏障?！昂兄泻小钡慕Y(jié)構(gòu)李燕46實驗室生物安全防護屏障二級防護屏障“盒中盒”的

12、結(jié)構(gòu)實驗室生物安全防護水平分級生物安全水平分級根據(jù)生物因子危害程度和采取的防護措施，將生物安全防護水平（biosafety level，BSL）分為4級（BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示）；動物實驗室以ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4表示。實驗室生物安全防護水平分級生物安全水平分級與一般生物潔凈室的區(qū)別1.工作目的BSL實驗室： 保護工作人員和環(huán)境為主，也保護產(chǎn)品。安全是首要考慮因素。生物潔凈室：以保護產(chǎn)品（工作對象）為主。潔凈是首要考慮因素2.污染物的種類和來源BSL實驗室：為目標微生物。內(nèi)部產(chǎn)生。生物潔凈室：粉塵（可能的熱源）和微生物。外部進入以及人

13、的活動產(chǎn)生。與一般生物潔凈室的區(qū)別1.工作目的2.污染物的種類和來源與一般生物潔凈室的區(qū)別3.空氣污染物處理方式BSL實驗室：平面布局和氣流流向的作用, 產(chǎn)生環(huán)節(jié)在一級屏障內(nèi)進行個體防護。生物潔凈室：主要通過進氣凈化 減少活動。4.潔、污概念BSL實驗室：凡有目標微生物即視為污； 凡無目標微生物即視為潔；對各環(huán)節(jié)潔、污應(yīng)仔細分析。生物潔凈室：粉塵、微生物（特別是超標者）和廢棄物均視為污。與一般生物潔凈室的區(qū)別3.空氣污染物處理方式4.潔、污概念與一般生物潔凈室的區(qū)別5.排氣處理方式BSL實驗室：不允許室內(nèi) 室外； 排氣須凈化，不許回風。生物潔凈室：一般室內(nèi) 室外；排氣可回風。6.實驗室軟、硬件

14、的作用BSL實驗室：對工作人員保護，實驗室軟件應(yīng)是決定性的； 對環(huán)境保護，實驗室硬件應(yīng)是決定性的；生物潔凈室：均很重要，但硬件設(shè)施作用比較大。與一般生物潔凈室的區(qū)別5.排氣處理方式6.實驗室軟、硬件的作與一般生物潔凈室的區(qū)別7.壓力遞增方向BSL實驗室：緩沖室準備室主實驗室生物潔凈室：緩沖室準備室主潔凈室與一般生物潔凈室的區(qū)別7.壓力遞增方向 保護對象 操作區(qū) 壓力 氣體排 放方式 設(shè)備 結(jié)構(gòu) 設(shè)備 造價 生物安全柜 操作者、 樣品、環(huán)境 負壓 凈化后排放 復(fù)雜 較貴 潔凈工作臺 樣品 正壓 直接排放 簡單 便宜 生物安全柜與潔凈工作臺的區(qū)別 保護對象 操作區(qū) 壓力 氣體排 放方式 設(shè)備 結(jié)構(gòu)

15、 設(shè)備BSL-1實驗室1) 實驗室的門應(yīng)有可視窗并可鎖閉。2) 實驗室門口設(shè)掛衣裝置，個人便裝與工作服分開。3) 實驗室各表面平整、易清潔、不滲水、耐腐蝕。4) 實驗臺面防水，耐腐蝕、耐熱。5) 櫥柜和實驗臺牢固，保持一定距離以便于清潔。6) 實驗室可以利用自然通風。如果采用機械通風，應(yīng)避免交叉污染。BSL-1實驗室1) 實驗室的門應(yīng)有可視窗并可鎖閉。BSL-1實驗室7) 如有可開啟的窗戶，應(yīng)設(shè)置紗窗。8) 保證工作照明，避免不必要的反光和強光。9) 有適當?shù)南驹O(shè)備。10) 若操作有毒、刺激性、放射性揮發(fā)物質(zhì)，應(yīng)在風險評估的基礎(chǔ)上，配備適當?shù)呢搲号棚L柜。11) 應(yīng)設(shè)應(yīng)急照明裝置；應(yīng)有足夠的電

16、力供應(yīng)。12) 應(yīng)有防止節(jié)肢動物和嚙齒動物進入的措施。BSL-1實驗室7) 如有可開啟的窗戶，應(yīng)設(shè)置紗窗。核酸檢測技術(shù)及質(zhì)量控制(王鳳鳴)典型的一級生物安全水平實驗室典型的一級生物安全水平實驗室BSL-2實驗室1) 滿足BSL-1的要求。2) 實驗室門可自動關(guān)閉,門禁系統(tǒng)。3) 應(yīng)在實驗室工作區(qū)配備洗眼裝置。4) 應(yīng)在實驗室或其所在的建筑內(nèi)配備高壓蒸汽滅菌器或其他適當?shù)南緶缇O(shè)備。5) 應(yīng)在操作病原微生物的實驗間內(nèi)配備生物安全柜。6) 應(yīng)有可靠的電力供應(yīng)。BSL-2實驗室1) 滿足BSL-1的要求。BSL-2實驗室生物危害警告標志。BSL-2實驗室生物危害警告標志。典型的二級生物安全水平實驗室典型的二級生物安全水平實驗室生物安全柜生物安全柜的要求:顆粒經(jīng)HEPA過濾去除氣流為層流氣流有方向生物安全柜生物安全柜的要求:生物安全柜的分級I級生物安全柜：保護工作人員和環(huán)境II級生物安全柜：保護工作人員、環(huán)境和試樣（產(chǎn)品）III級生物安全柜：采用手套箱更嚴格地保護工作人員、環(huán)境和試樣（產(chǎn)品）Class II 生物安全柜生物安全