生物化學(xué)與分子生物學(xué)-第一章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能課件

1、Wang-Kai Fang, PhD（方王楷）Department of biochemistry and Molecular BiologyShantou University Medical College Biochemistry生物化學(xué) 緒 論什么是生物化學(xué)？ 就是研究生命化學(xué)的科學(xué)，它運(yùn)用化學(xué)原理和方法從分子水平探討生命現(xiàn)象的本質(zhì)研究方法： 主要采用化學(xué)的原理和方法，同時(shí)也與生理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)相聯(lián)系和交叉研究內(nèi)容 一、生物分子的結(jié)構(gòu)與功能：探討生物體的物質(zhì)組成以及分子結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能二、物質(zhì)代謝及其調(diào)節(jié)：物質(zhì)代謝的規(guī)律、能量轉(zhuǎn)化及其調(diào)節(jié)控制 屬靜態(tài)生化三、基因信息傳遞規(guī)律及其調(diào)控

2、：DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、基因表達(dá)調(diào)控等通常將生物大分子結(jié)構(gòu)、功能及其代謝調(diào)控的研究稱為分子生物學(xué)（生物大分子的來龍去脈） 屬動(dòng)態(tài)生化生物化學(xué)的發(fā)展簡史起始階段（18世紀(jì)-20世紀(jì)初）：研究了脂類、糖類及氨基酸；發(fā)現(xiàn)了核酸；酵母發(fā)酵中的“可溶性催化劑”酶的概念等快速發(fā)展階段（20世紀(jì)初-下葉）：必需氨基酸、維生素的發(fā)現(xiàn)；酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)揭示；多種激素的發(fā)現(xiàn)；主要物質(zhì)代謝途徑的確定等分子生物學(xué)的崛起階段（20世紀(jì)下葉-）：分子生物學(xué)的重要事件 50年代：蛋白質(zhì)-螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)； 53年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型分子生物學(xué)的里程碑；中心法則的提出；遺傳密碼的破譯

3、70年代：DNA重組技術(shù)(基因工程)、基因診斷、基因治療的發(fā)展 80年代：核酶（ribozyme）、PCR技術(shù)等 90年代：人類基因組計(jì)劃（約3.0109堿基、2-3萬個(gè)基因）、后基因組時(shí)代（蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)）第一篇生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能一、蛋白質(zhì) （protein）二、核酸（nuclear acids）三、酶 （enzyme）第 一 章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能Structure and Function of Protein第一節(jié) 蛋白質(zhì)的化學(xué)組成第二節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)第三節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、分離、純化二、蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要性1. 蛋白質(zhì)是生物體重要組成成分

4、分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細(xì)胞的各個(gè)部分都含有蛋白質(zhì)。含量高：蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)最豐富的有機(jī)分子，占人體干重的45，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達(dá)80。Proteins make up all living materials1）作為生物催化劑（酶）2）代謝調(diào)節(jié)作用3）免疫保護(hù)作用4）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲5）運(yùn)動(dòng)與支持作用6）參與細(xì)胞間信息傳遞2. 蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能 一、氨基酸(amino acid) 蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子（building blocks）H N3+HAmino groupCarboxylic group氨基酸結(jié)構(gòu)通式COO-CaR group氨基酸的種類1

5、809年發(fā)現(xiàn)Asp，1938年發(fā)Thr，目前已發(fā)現(xiàn)300多種構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 1.均為L-氨基酸，各種aa的R側(cè)鏈各不相同 2.-碳原子上均連有一個(gè)氨基(脯氨酸除外) 3.-碳原子為手性碳原子(甘氨酸除外）脯氨酸屬于L-亞氨基酸，而甘氨酸則屬于-氨基酸（一）氨基酸的分類根據(jù)氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，分為4類：1.非極性疏水性氨基酸2.極性中性氨基酸3.酸性氨基酸4.堿性氨基酸 1） 7個(gè)非極性疏水性氨基酸 甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）2） 8個(gè)極性中性氨基酸R-基含有極

6、性基團(tuán)；生理pH條件下不解離, 即不帶電荷酪氨酸(Tyr)色氨酸(Trp)絲氨酸(Ser)半胱氨酸(Cys)蛋氨酸(Met)天冬酰胺(Asn) 谷氨酰胺(Gln)蘇氨酸(Thr)極性最強(qiáng)組氨酸（His）CHCHCH2CHNH3+COO-NHNH+CH咪唑基精氨酸（Arg）+胍基CNH2NH2NHCH2CH2CH2CHNH3+COO-3） 2個(gè)酸性氨基酸R-基有COOH/COO-；帶負(fù)電荷 脯氨酸 Pro （亞氨基酸） 半胱氨酸 Cys +胱氨酸二硫鍵-HH苯丙氨酸Phe、酪氨酸Tyr 和色氨酸Trp蛋白質(zhì)分子中Phe, Tyr和Trp殘基的存在使得蛋白質(zhì)在近紫外區(qū)(220-300nm)有特征性

7、吸收苯丙氨酸的max257nm酪氨酸的max275nm色氨酸的max280nm 名 稱 三字符 單字符 名 稱 三字符單字符 丙氨酸（alanine） Ala A 亮氨酸（leucine） Leu L 精氨酸（arginine） Arg R 賴氨酸(lysine) Lys K 天冬酰胺（asparagine） Asn N 甲硫氨酸（methionine） Met M 天冬氨酸（aspartic acid） Asp D 苯丙氨酸（phenylalanine） Phe F 半胱氨酸（cysteine） Cys C 脯氨酸（proline） Pro P 谷氨酰胺（glutanine） Gln Q 絲

8、氨酸（serine） Ser S 谷氨酸（glutamic acid） Glu E 蘇氨酸（threonine） Thr T 甘氨酸（Glicine） Gly G 色氨酸（tryptophan） Trp W 組氨酸（histidine） His H 酪氨酸（tyrosine） Tyr Y 異亮氨酸（isoleucine） Ile I 纈氨酸（valine） Val V 氨基酸殘基側(cè)鏈修飾 有些氨基酸沒有相應(yīng)的遺傳密碼，而是在肽鏈從核糖體釋放后經(jīng)化學(xué)修飾形成的。如膠原蛋白中含有大量的羥脯氨酸和羥賴氨酸，分別是脯氨酸和賴氨酸經(jīng)羥化而成的。有些蛋白質(zhì)中的天冬酰胺、絲氨酸和蘇氨酸發(fā)生糖基化形成糖蛋白，

9、絲氨酸磷酸化成為磷酸絲氨酸。 蛋白質(zhì)共價(jià)修飾Group AddedTarget Residue(s)ReversibilityPhosphorylSer, Thr, Tyr, HisYesMethylLys, ArgYesAcetylLys, N-terminusYes (Lys)HydroxylPro, LysNoCarboxylGluNoSugarsSer, Thr, hydroxypro, AsnNoMyristylCys, HisNoGlycophospholipidC-terminusNoPrenylCysNoADP-riboseGlu, Asp, COOH-LysYesDiptha

10、mideHisNoUbiquitinLysYesSumoLysYes蛋白質(zhì)磷酸化 Phosphorylation is a highly effective means of regulating the activity of target proteins. 30% eukaryotic proteins are phosphorylated. Protein kinases: The enzymes that catalyze phosphorylation reactions. one of the largest protein families 100 in yeast 500 i

11、n human beings Kinases: specificitySer/Thr kinases: acceptor is -OH of Ser or Thr Tyr kinases: acceptor is -OH of Tyr Tyr kinases are unique to multicellular organisms, important in growth regulation. Tyr kinase mutations often occur in cancer cellsProtein PhosphorylationDephosphorylationPhosphoryla

12、tion磷酸化使蛋白質(zhì)帶上強(qiáng)烈負(fù)電基團(tuán)Protein Glycosylation Common in Eukaryotic ProteinsN-連接糖蛋白的糖基化位點(diǎn)為Asn-X-Ser/ThrO-連接糖蛋白：糖蛋白糖鏈與蛋白部分的絲/蘇氨酸殘基的羥基相連（二） 氨基酸的理化性質(zhì)+ OH+ H+ OH+ H+pH pIpH = pI1. 氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。陽離子陰離子氨基酸的兼性離子 K1K2除堿性氨基酸外，其余氨基酸等電點(diǎn)均小于7pI=1/2（pK1+pK2）若一個(gè)aa有3個(gè)解離基因，則其pI為兼性離子兩邊pK的平均值等電點(diǎn)(isoelectric poi

13、nt, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時(shí)溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。氨基酸的解離常數(shù)可通過測定滴定曲線求得2.紫外吸收性質(zhì) 色氨酸和酪氨酸在280nm波長附近對紫外光有最大吸收峰 據(jù)此可以通過測定蛋白質(zhì)溶液280nm的吸光值快速測定其蛋白質(zhì)含量3.茚三酮反應(yīng)aa與水合茚三酮一起加熱，生成藍(lán)紫色的化合物，在570nm處有最大吸收。據(jù)此亦可用作aa含量分析（一） 肽與肽鍵二、肽 一個(gè)氨基酸的-羧基與另一個(gè)氨基酸的-氨基脫去一分子水縮合形成的鍵稱肽鍵(peptide bond)COHOCH3NH2HC+HOCOCH2NH2HC

14、丙氨酸苯丙氨酸COHOCH3HCCH2NH2HC肽鍵NCOH二肽丙苯氨丙氨酸肽peptide氨基酸借肽鍵相連而形成的化合物HisPhe二肽CysThrLysMetHis五肽寡肽(oligopeptide ):10個(gè)以內(nèi)氨基酸連成多肽(polypeptide )：多個(gè)氨基酸連成的肽，其形 狀為一條沒有分支的長鏈，又稱多肽鏈或肽鏈氨基端(端)羧基端(C端)CysMetHisLysSerThrLeuNH2COOH氨基酸在形成肽鏈時(shí)失去了一分子水，肽鏈中的氨基酸分子不再完整，稱為氨基酸殘基(amino acid residue)氨基酸殘基蛋白質(zhì)與多肽的區(qū)別：Protein空間構(gòu)象相對穩(wěn)定氨基酸殘基數(shù)較

15、多Peptide空間構(gòu)象不穩(wěn)定氨基酸殘基數(shù)較少（二）生物活性肽 1. 谷胱甘肽(glutathione，GSH)構(gòu)成第一個(gè)肽鍵的羧基是谷氨酸的r羧基半胱氨酸(Cys)甘氨酸(Gly)谷氨酸(Glu)GSH過氧化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH還原酶NADPH+H+ NADP+ GSH上的氫，在谷胱甘肽過氧化物酶的催化下，能還原細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，使其變成H2O，同時(shí)GSH成為氧化型即GSSG，后者又在谷胱甘肽還原酶催化下，再生成GSH。因此，GSH是細(xì)胞內(nèi)十分重要的還原劑。種類較多，生理功能各異。多肽類激素主要見于垂體及下丘腦分泌的激素，如催產(chǎn)素（9肽）、加壓素（9肽）、促

16、腎上腺皮質(zhì)激素（39肽）、促甲狀腺素釋放激素（3肽）。 神經(jīng)肽主要與神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用相關(guān)，包括腦啡肽（5肽）、-內(nèi)啡肽（31肽）、強(qiáng)啡肽（17肽）等。2. 多肽類激素及神經(jīng)肽由下丘腦分泌，其功能是促進(jìn)腺垂體釋放促甲狀腺素(調(diào)節(jié)糖代謝)促甲狀腺素釋放激素(1) 組成pyro-GluHisPro-NH2(2) 功能焦谷氨酸組氨酸脯氨酰胺神經(jīng)肽甲硫氨酸腦啡肽Tyr-Gly-Gly-phe-Met 亮氨酸腦啡肽Tyr-Gly-Gly-phe-Leu 臨床應(yīng)用：鎮(zhèn)痛 例如 腦啡肽 ： Responsible for signal transduction (信號轉(zhuǎn)導(dǎo)) in neurotransmiss

17、ion 腦啡肽；內(nèi)啡肽；強(qiáng)啡肽； 神經(jīng)肽Y三、蛋白質(zhì)的分類1. 根據(jù)組成成分分為：單純蛋白質(zhì)全部由aa組成結(jié)合蛋白質(zhì)除蛋白部分外，還含非蛋 白部分結(jié)合蛋白質(zhì)中的非蛋白部分稱為輔基，常以 共價(jià)鍵與蛋白部分相連輔基：包括色素、寡糖、脂類、磷酸、金屬 離子乃至核酸等2. 根據(jù)其形狀分為：纖維蛋白質(zhì)分子狀如纖維，其長軸 比縱軸大于10：1球狀蛋白質(zhì)分子狀如球形或橢圓形結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，難溶于水，常作為細(xì)胞支架和細(xì)胞連接，如大量存在于結(jié)締組織中的膠原蛋白可溶于水，如:酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白質(zhì)類激素及免疫球蛋白等3. 根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分類：蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)域（domain）或模體（motif）常與某種生物學(xué)功能相

18、聯(lián)系將具有相同或類似結(jié)構(gòu)域或模體的蛋白質(zhì)歸類，分別稱為超家族（superfamily）、家族（family）或亞家族（subfamily）居于同一類別中的蛋白質(zhì)/多肽同源性越高，即相似的結(jié)構(gòu)成分越多，功能越接近第二節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 一級結(jié)構(gòu) (primary structure)二級結(jié)構(gòu) (secondary structure)三級結(jié)構(gòu) (tertiary structure)四級結(jié)構(gòu) (quaternary structure)空間結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的概念：蛋白質(zhì)分子中所有氨基酸的排列順序，主要化學(xué)鍵：肽鍵，二硫鍵氨基酸序列書寫：以氨基端開始,羧基末端結(jié)束依次編1、

19、2、3 蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序稱為蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)CysMetPheLysSerThrVal NH2COOH胰島素的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是其空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)，但不是唯一因素牛胰核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)概念：是指蛋白質(zhì)分子中一段多肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及到aa側(cè)鏈R基團(tuán)的構(gòu)象肽單元（肽平面）：肽鍵的6個(gè)原子C1 、C、N、O、H、 C 2位于同一平面，構(gòu)成所謂的肽單元肽鍵中，與-相連的O和H呈反式構(gòu)型（反式）（順式）CNOHCNOH肽鍵的特點(diǎn)：C-N單鍵為0.149nmC=N雙鍵為0.12

20、7nm具有部分雙鍵性質(zhì)不能自由旋轉(zhuǎn)肽鍵中鍵長為0.132nmCNOH肽鍵為共價(jià)鍵，具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。參與肽鍵組成的6個(gè)原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，此同一平面上的6個(gè)原子構(gòu)成了所謂的肽單元（酰氨平面） 。 多肽鏈的主鏈由許多酰胺平面組成，平面之間以碳原子相隔。 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式 -螺旋 ( -helix ) -折疊 ( -pleated sheet ) -轉(zhuǎn)角 ( -turn ) 無規(guī)卷曲 ( random coil ) 主要的化學(xué)鍵：氫鍵 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是以一級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，其形成受氨基酸殘基側(cè)鏈的影響。 （一） -螺旋 (- helix)由肽鍵平面盤旋形成

21、的螺旋狀構(gòu)象2. -螺旋的結(jié)構(gòu)特征以肽鍵平面為單位,以-碳原子為轉(zhuǎn)折盤旋形成右手螺旋(2) 每3.6個(gè)氨基酸殘基 繞成一個(gè)螺圈(3600)螺距為0.54nm每個(gè)氨基酸上升0.15nm肽鍵平面與中心軸平行(3)主鏈原子構(gòu)成螺旋的主體,側(cè)鏈在其外部(4)每個(gè)肽鍵的N-H和第四個(gè)肽鍵C-O都形成氫鍵是穩(wěn)定螺旋的主要作用力氫鍵的方向與中心軸大致平行,Ala, Glu, Leu和Met比Gly，Pro，Ser和Tyr更常見；Pro的氮原子不能形成氫鍵（二）-折疊 (-pleated sheet) 肽鍵平面呈伸展的鋸齒狀排列,形成的結(jié)構(gòu)稱-折疊。常為兩條或兩條以上伸展的多肽鏈側(cè)向聚集在一起形成扇面狀，故又

22、稱-折疊片或-片層1.概念 多肽鏈主鏈走向呈折紙狀，而氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)交替地位于折紙狀結(jié)構(gòu)上下方。在兩條相鄰的肽鏈或一條肽鏈內(nèi)的若干肽段之間形成氫鍵。2. -折疊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(1) 相鄰肽鍵平面的夾角為1100 ，呈鋸齒狀排列;側(cè)鏈基團(tuán)交錯(cuò)地分布在片層平面的兩側(cè)()由氫鍵維持穩(wěn)定。其方向與折疊的長軸 接近垂直 ()條肽段平行排列構(gòu)成，肽段之間 可順向平行(均從N-C)，也可反向平行（三）-轉(zhuǎn)角(-turn)肽鏈出現(xiàn)1800回折的轉(zhuǎn)角處結(jié)構(gòu)稱為-轉(zhuǎn)角1.概念2.結(jié)構(gòu)特征 第一個(gè)殘基的C=O與第四個(gè)殘基的N-H形成氫鍵 第二個(gè)殘基常為脯氨酸* 常見于球狀蛋白質(zhì)分子表面（四）無規(guī)卷曲(random coi

23、l)1.概念沒有確定規(guī)律性的肽鍵構(gòu)象常見于球狀蛋白質(zhì)分子中，在其它類型二級結(jié)構(gòu)肽段之間起活節(jié)作用，有利于整條肽鏈盤曲折疊H2NCOOH超二級結(jié)構(gòu)(模體motif)由幾個(gè)具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近、相互作用，所形成的折疊模樣.* 類型* 概念 、 、 相互作用主要由非極性氨基酸殘基參與鋅指結(jié)構(gòu)由一個(gè)-螺旋和兩個(gè)反平行的-折疊三個(gè)肽段組成。形似手指，具有結(jié)合鋅離子的功能。三、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)疏水鍵（最主要）、離子鍵、氫鍵和范德華力等。 主要的化學(xué)鍵:定義: 整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，即多肽鏈的整體構(gòu)象。 維系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力1. 肽鍵共價(jià)鍵2. 二硫鍵共價(jià)鍵3. 次級鍵非

24、共價(jià)鍵維系蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)維系蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)次級鍵的種類：氫鍵、疏水相互作用、離子鍵和范德華力氫鍵負(fù)電性很強(qiáng)的原子（如氧或氮）和與氧或氮共價(jià)結(jié)合的氫原子相互吸引，這種作用力稱為氫鍵。疏水相互作用由非極性基團(tuán)受到水分子排斥相互聚集在一起的作用力離子鍵由異性電荷間的靜電吸引形成的鍵側(cè)鏈基團(tuán)之間形的 氫 鍵、離子鍵、疏水作用、分子引力、二硫鍵疏水核：疏水區(qū)從位于分子內(nèi)部，往往是與輔酶/基或底物結(jié)合位點(diǎn)維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素親水區(qū)：親水區(qū)多位于分子表面，故球形蛋白質(zhì)水溶性較好蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的意義： 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能1963年Kendrew等通過鯨肌紅蛋白的x-射線衍射分析，

25、測得了它的空間結(jié)構(gòu)。 肌紅蛋白 (Mb) Mb是一個(gè)只有三級結(jié)構(gòu)的單鏈蛋白質(zhì)，有8段-螺旋結(jié)構(gòu)。整條多肽鏈折疊成緊密球形分子，氨基酸側(cè)鏈上的疏水側(cè)鏈大都在分子內(nèi)部，富極性及電荷的則在分子表面。Mb分子內(nèi)部有一個(gè)袋形空穴，血紅素居與其中。血紅素輔基與蛋白質(zhì)部分穩(wěn)定結(jié)合。 視紫紅質(zhì)分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊分子伴侶是細(xì)胞中一類保守蛋白質(zhì)，可識別肽鏈的非天然構(gòu)象，促進(jìn)各功能域和整體蛋白質(zhì)的正確折疊。 封閉待折疊蛋白暴露的疏水區(qū)段，創(chuàng)建一個(gè)隔離的環(huán)境，促進(jìn)折疊與去聚集（1）核糖體結(jié)核性分子伴侶，包括觸發(fā)因子和新生鏈相關(guān)復(fù)合物； （2）非核糖體結(jié)合性分子伴侶，包括熱激蛋白、伴侶蛋白等。熱休克蛋白促進(jìn)蛋白質(zhì)

26、折疊的基本作用：結(jié)合保護(hù)待折疊多肽片段，再釋放該片段進(jìn)行折疊。形成HSP70和多肽片段依次結(jié)合、解離的循環(huán)。 熱休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和GrpE族 HSP40結(jié)合待折疊多肽片段 HSP70-ATP復(fù)合物 HSP40- HSP70-ADP-多肽復(fù)合物 ATP水解GrpE ATPADP復(fù)合物解離，釋出多肽鏈片段進(jìn)行正確折疊 HSP70反應(yīng)循環(huán)伴侶蛋白的主要作用:為非自發(fā)性折疊蛋白質(zhì)提供能折疊形成天然空間構(gòu)象的微環(huán)境。 伴侶蛋白(chaperonins) GroEL和GroES家族GroEL and GroEs pathway in E.

27、colinon-folded peptidefolded peptideGroELGroES14亞基7亞基ATPADPATPADP通過消除不正確折疊，增加功能性蛋白折疊產(chǎn)率，不改變折疊反應(yīng)速度四、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)分子的二、三級結(jié)構(gòu)而言，只涉及一條多肽鏈卷曲而成的蛋白質(zhì)。而有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，其中每一個(gè)具有獨(dú)立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱為蛋白質(zhì)的亞基 。蛋白質(zhì)分子中各亞基之間的相對空間位置，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。由一條肽鏈形成的蛋白質(zhì)沒有四級結(jié)構(gòu)。主要的化學(xué)鍵主要是疏水鍵、氫鍵和離子鍵。血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu) 血紅蛋白：具有個(gè)亞基組成的四級結(jié)構(gòu)，可結(jié)合分子氧。成人由兩條-肽鏈和兩條-

28、肽鏈組成 Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.195 第三節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一） 一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 以124個(gè)氨基酸殘基組成的牛胰核糖核酸酶（4對二硫鍵）為例說明牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)二硫鍵 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 -巰基乙醇 去除尿素、-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性牛胰核糖核酸酶的變性與復(fù)性空間構(gòu)象遭破壞的蛋白質(zhì)，只要一級結(jié)構(gòu)未被破壞，即可能回復(fù)到原來的高級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的功能與其空間構(gòu)象密切相關(guān)一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)及功能相似一級結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)及功能不同胰島素的一級結(jié)構(gòu)及種屬差異（

29、二）一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系A(chǔ)CTH 促腎上腺素皮質(zhì)激素MSH 促黑激素兩者均可促進(jìn)皮下黑色素生成氨基酸序列提供重要的生物進(jìn)化信息物種越相近，細(xì)胞色素C的一級結(jié)構(gòu)越相似，其空間構(gòu)象和功能也相似鐮刀狀紅細(xì)胞貧血N-val his leu thr pro glu glu C(146) HbS 肽鏈HbA 肽 鏈N-val his leu thr pro val glu C(146) 正常人血紅蛋白鏈的第6位氨基酸是Glu，而鐮刀狀細(xì)胞貧血病人的血紅蛋白中， Glu變成了Val，僅此一個(gè)氨基酸之差，本是水溶性的血紅蛋白，就聚集成不溶性的纖維束，并引起紅細(xì)胞變形成鐮刀狀而極易破裂，產(chǎn)生貧血。這種由蛋白質(zhì)分

30、子一級結(jié)構(gòu)發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。重要蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變可引起疾病Observed Normal range Red cell count 2.6106/ml 4.66.2106/ml Hemoglobin content 8g/100ml 1418g/100ml White cell count 15,250/ml 4,00010,000/ml HbA -鏈：Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS -鏈：Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys HbA（ adult hemoglobin） HbS（sickle-cell

31、hemoglobin） 二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）肌紅蛋白Mb與血紅蛋白Hb蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定生物學(xué)功能肌紅蛋白（1個(gè)亞基）與血紅蛋白（4個(gè)亞基）雖然一級結(jié)構(gòu)有較大差異，但均具有與氧可逆地結(jié)合的能力其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是，都與血紅素（輔基）共價(jià)結(jié)合HemoglobinMyoglobin肌紅蛋白和血紅蛋白是兩個(gè)研究得最透徹的蛋白質(zhì)，它們是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的范例。肌紅蛋白是哺乳動(dòng)物肌肉中儲氧的蛋白質(zhì)，它和血紅蛋白的亞基在空間構(gòu)象和功能上十分相似。肌紅蛋白Mb是一個(gè)只有三級結(jié)構(gòu)的單鏈蛋白質(zhì)，有8段-螺旋結(jié)構(gòu)。易與氧氣結(jié)合，氧解離曲線呈直角雙曲線。整條多肽鏈折疊成緊密球形分子，氨基酸側(cè)鏈上的疏水側(cè)鏈

32、大都在分子內(nèi)部，富極性及電荷的則在分子表面。Mb分子內(nèi)部有一個(gè)袋形空穴，血紅素居與其中。血紅素輔基與蛋白質(zhì)部分穩(wěn)定結(jié)合。血紅蛋白血紅蛋白具有4個(gè)亞基組成的四級結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞基中間有一個(gè)疏水袋形空穴，可結(jié)合一個(gè)血紅素并攜帶1分子氧， 因此1分子Hb共結(jié)合4分子氧。Hb各亞基的三級結(jié)構(gòu)與Mb極為相似。Hb各亞基之間通過8對鹽健，緊密結(jié)合成親水的球狀蛋白。成人紅細(xì)胞中Hb主要是由兩條肽鏈和兩條肽鏈組成（22）。 血紅蛋白在氧分壓較低時(shí)，與氧氣結(jié)合較難，氧解離曲線呈狀曲線。 但當(dāng)氧與血紅蛋白分子中一個(gè)亞基的血紅素輔基的鐵結(jié)合后，即引起該亞基構(gòu)象的改變，一個(gè)亞基構(gòu)象的改變又會(huì)引起其余亞基的構(gòu)象相繼發(fā)生改變

33、，亞基間的次級鍵被破壞，結(jié)果整個(gè)分子從緊密的構(gòu)象變成比較松散的構(gòu)象，易于與氧結(jié)合，從而使血紅蛋白與氧結(jié)合的速度大大加快。（二）血紅蛋白的構(gòu)象變化與結(jié)合氧肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線氧飽和度靜脈血?jiǎng)用}血氧分壓P50100% - HbMb Mb易與O2結(jié)合，而Hb在O2分壓較低時(shí)較難結(jié)合O2 Hb氧解離曲線為S狀曲線，而Mb的為雙曲線。因?yàn)椋?Hb第一個(gè)亞基與氧氣結(jié)合以后，促進(jìn)第二及第三個(gè)亞基與氧氣的結(jié)合，當(dāng)前三個(gè)亞基與氧氣結(jié)合后，又大大促進(jìn)第四個(gè)亞基與氧氣結(jié)合。即Hb各亞基間存在正協(xié)同效應(yīng)。特點(diǎn)：血紅蛋白中血紅素輔基的結(jié)構(gòu) 鐵卟啉化合物，由4個(gè)吡咯環(huán)通過4個(gè)甲炔基相連成為環(huán)形F

34、e2+有6個(gè)配位鍵，其中4個(gè)與吡咯環(huán)的N配位結(jié)合，一個(gè)與組氨酸殘基結(jié)合，一個(gè)結(jié)合氧O2血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進(jìn)入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動(dòng)。 氧合作用顯著改變Hb的四級結(jié)構(gòu)，血紅素鐵的微小移動(dòng)導(dǎo)致血紅蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)換（從T態(tài)R態(tài)）T態(tài)（tense state）緊張態(tài)R態(tài)（relaxed state）松馳態(tài)。變構(gòu)效應(yīng) (allosteric effect)蛋白質(zhì)因與小分子物質(zhì)相互作用而發(fā)生空間結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的變化，稱為變構(gòu)效應(yīng)。* 協(xié)同效應(yīng) (cooperativity) 一個(gè)寡聚體蛋白質(zhì)的一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個(gè)亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)

35、象，稱為協(xié)同效應(yīng)。 如果是促進(jìn)作用則稱為正協(xié)同效應(yīng) 如果是抑制作用則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng) （三）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病 蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯(cuò)誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生。蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機(jī)理：有些蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病。這類疾病包括： 瘋牛病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、老年癡呆癥、亨廷頓舞蹈病等。瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一種人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白

36、質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為-折疊的PrPsc，從而致病。PrPc-螺旋PrPsc-折疊正常瘋牛病PrPsc對蛋白酶不敏感，水溶性差，對熱穩(wěn)定，可以互相聚集，形成淀粉樣纖維沉淀而致病第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、分離純化一 、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（一）兩性解離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在溶液中的帶電狀況主要取決于溶液的pH值PrCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2+OH-+H+OH-+H+pH=pIpHpI* 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) ( pI ) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)除兩端的氨基和羧基可

37、以解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈的某些基團(tuán)，如谷氨酸、天冬氨酸殘基中的羧基，賴氨酸殘基中的氨基，精氨酸殘基的胍基和組氨酸殘基的咪唑基，在一定溶液pH條件下都可以解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。大多數(shù)蛋白等電點(diǎn)接近pH5.0，帶負(fù)電荷；少數(shù)蛋白含堿性氨基酸較多，等電點(diǎn)偏堿性，被稱為堿性蛋白質(zhì)，如魚精蛋白、組蛋白等。少數(shù)等電點(diǎn)偏酸性，被稱為酸性蛋白質(zhì)，如胃蛋白酶和絲蛋白。蛋白質(zhì)分子顆粒大小1-100nm之間,屬膠體顆粒范圍，在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體蛋白質(zhì)的膠體原因： 表面形成水化層 表面同種電荷的斥力（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)會(huì)吸引它周圍的水分子，使水分子定向排列在它的周圍蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)

38、帶有同種電荷蛋白質(zhì)的聚沉（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀與凝固 變性后的蛋白稱為變性蛋白質(zhì)1. 蛋白質(zhì)的變性作用 在某些理化因素作用下.蛋白質(zhì)的構(gòu)象被破壞，失去其原有的性質(zhì)和生物活性，稱為蛋白質(zhì)的變性作用(denaturation)概念: 造成變性的因素如加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑、超聲波、紫外線、震蕩等。 變性的本質(zhì) 主要為二硫鍵和非共價(jià)鍵的破壞，不涉及一級結(jié)構(gòu)的改變。變性后，其溶解度降低，粘度增加，結(jié)晶能力消失，生物活性喪失，易被蛋白酶水解。 應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。此外, 防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。 除去變

39、性因素后，有的變性蛋白質(zhì)又可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性，這一現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation)* 蛋白質(zhì)沉淀在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，溶解度降低，甚至肽鏈相互聚集，而從溶液中析出的現(xiàn)象。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。 鹽析法：加入大量的中性鹽（如硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉 ），脫去水化層而沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法：加入極性的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，破壞水化層而沉淀。重金屬鹽沉淀法：當(dāng)pH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶凈負(fù)電荷，易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。生物堿或酸類沉淀法：當(dāng)pH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶凈正電荷，易與生物堿或酸根負(fù)離子結(jié)合

40、成不溶性鹽而沉淀。加熱變性沉淀法：蛋白質(zhì)因加熱變性而凝固。蛋白質(zhì)沉淀法（四）蛋白質(zhì)的紫外吸收由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。（五）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng) 茚三酮反應(yīng)蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。 雙縮脲反應(yīng) 蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。二、蛋白質(zhì)的分離和純化蛋白質(zhì)的分離純化方法分子大小透析和超過濾密度梯度離心凝膠過濾溶解度等電點(diǎn)沉淀和pH控制鹽溶和鹽析有機(jī)溶劑分級分離法溫度沉淀電

41、荷離子交換層析等電聚焦層析聚焦電泳區(qū)帶電泳聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）毛細(xì)管電泳蛋白質(zhì)分離純化方法吸附：吸附層析特異親和力：親和層析其它：如高效液相層析（HPLC）（一）透析及超濾法* 透析 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。透析是利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜而與小分子分離。* 超濾法 應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜（半透膜） ，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。（二）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀 *使用丙酮沉淀時(shí)，必須在04低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 *鹽析是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)

42、表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。 * 免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。 （三）蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳 (elctrophoresis) 。幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。（四）層析層

43、析分離蛋白質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 。帶正電荷多蛋白緊密結(jié)合帶負(fù)電荷多蛋白流過層析柱陽離子交換樹脂工作示意圖分子篩層析親和層析工作示意圖蛋白質(zhì)載體介質(zhì)配體結(jié)合洗脫洗脫介質(zhì)(六)超速離心三、多肽鏈中氨基酸的順序分析第一步： 分離提純蛋白質(zhì) ，測定NH2末端的數(shù)目，確定蛋白質(zhì)分子是 由幾條肽鏈構(gòu)成的，并分離出 每條肽鏈。測定肽鏈的分子量,計(jì)算組成該肽鏈的氨基酸殘基數(shù)及每種aa的百分組成。一般過程：肽鏈分子中氨基酸殘基數(shù)=肽鏈

44、的分子量120 （各種的氨基酸殘基的平均分子量為120）再將肽鏈徹底水解，用離子交換層析法將各種的氨基酸分離。a.丹磺酰氯法 丹磺酰氯是一種強(qiáng)熒光劑，它能專一地與鏈N-端-氨基反應(yīng)生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很強(qiáng)的熒光，可直接用電泳法或?qū)游龇ㄨb定出N-端是何種氨基酸。 第二步 測定肽鏈的氨基末端和羧基末端1.N末端的測定b.二硝基苯氟法 ：過時(shí)2.C末端的測定常用羧基肽酶法 羧基肽酶專一地將肽鏈水解成片斷，分別進(jìn)行順序分析第三步 肽鏈的局部水解胰蛋白酶的作用原理1. 酶解法CNBr與Met反應(yīng)測定Pr的一級結(jié)構(gòu) 2.化學(xué)法層析鑒定就可N-端開始確定被測肽段的氨基酸排列順序第

45、四步 肽段氨基酸順序分析一般采用 Edman降解法弱堿條件異硫氰酸苯酯+N端-氨基苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽）酸性條件環(huán)化水解苯乙內(nèi)酰硫氨基酸(PTH-aa)失去原N-端氨基酸的肽剩下的肽可反復(fù)進(jìn)行上述處理，依次生成各種PTH-aa，Edman降解法的示意圖 一般常用多種方法使肽鏈斷裂，并分析出各肽段中的氨基酸順序。由于在不同部位斷鏈，只要找出多套肽段的重疊部位，然后組合排列對比，即可推斷肽段的排列順序，從而得出完整肽鏈中氨基酸的順序第五步 肽鏈一級結(jié)構(gòu)的確定則其氨基酸排列順序?yàn)椋篢hr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys如測一個(gè)九肽測得N端氨基酸殘基為Thr又分別測得片段

46、: Ala-Ala-Trp-Gly-Lys Val-Lys-Ala-Ala-TrpThr-Asn-Val-Lys另外，亦可以通過基因中核苷酸順序推測蛋白質(zhì)的氨基酸順序四、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的測定 1. X射線晶體衍射法 X-衍射圖代表射線穿過（蛋白質(zhì)）晶體的一系列平行剖面的各原子的電子密度，然后再借助計(jì)算機(jī)繪制出三維的電子密度圖2.二維磁共振技術(shù)3. 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測（1）根據(jù)分子力學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)、物理化學(xué)原理，從理論上計(jì)算推測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)（2）從已知蛋白空間結(jié)構(gòu)規(guī)律，從一級結(jié)構(gòu)推測空間結(jié)構(gòu)血漿蛋白是血漿中的蛋白質(zhì)，是血液中除了血紅蛋白以外的蛋白質(zhì)。維持血漿的膠體滲透壓平衡：由血漿清蛋白所決定的，清蛋白分子量較?。?9kD），帶負(fù)電荷量多，總含量大，濃度高，吸引水分子聚集在其表面，起到維持膠體滲透壓的作用。維持血漿的pH值穩(wěn)定：與血漿蛋白電離后形成蛋白質(zhì)鹽。運(yùn)輸作用：前清蛋白（視黃醇）、脂蛋白（運(yùn)輸脂類）、結(jié)合珠蛋白（運(yùn)輸血紅蛋白）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（運(yùn)輸鐵）、血清銅藍(lán)蛋白（銅）等。免疫作用：血漿中含有許