應(yīng)用變性高效液相色譜技術(shù)檢測肥大細胞病ckit基因突變

1、應(yīng)用變性高效液相色譜技能檢測胖大細胞病c-kit基因突變【摘要】本研究檢測7例胖大細胞病患者-kit基因激酶編碼區(qū)突變環(huán)境，以探究該基因變異在胖大細胞病診斷及治療中的意義。應(yīng)用PR測定、變性高效液相色譜技能及DNA測序要領(lǐng)對患者舉行-kit基因外顯子17外顯子19突變檢測。結(jié)果表白：1例患者外顯子17擴增產(chǎn)物在DHPL中出現(xiàn)非常色譜峰，測序結(jié)果表如今外顯子17出現(xiàn)AT突變，即D816V；另2例患者外顯子18/19經(jīng)DHPL檢測，結(jié)果表現(xiàn)1個分外的色譜峰，測序結(jié)果證著實外顯子18出現(xiàn)G改變，為同義突變L862L。結(jié)論：變性高效液相色譜技能是一種高效、可靠的突變檢測要領(lǐng)，-kit基因突變檢測對胖大

2、細胞病臨床治療有引導(dǎo)意義?！娟P(guān)鍵詞】變性高效液相色譜；-kit基因突變；D816V；L862L；胖大細胞病AppliatinfDenaturingHighPerfraneLiquidhratgraphytutatinDetetinfthe-kitGeneinastytsisKeyrdsdenaturinghighperfraneliquidhratgraphy;-kitgeneutatin;D816V;L862L;astytsis胖大細胞病是指體內(nèi)胖大細胞非常增生的一種疾病，包羅皮膚型胖大細胞并體系性胖大細胞并胖大細胞肉瘤及胖大細胞白血病等數(shù)種范例。體系性胖大細胞病systeiastelldi

3、sease,SD)以滿身多器官構(gòu)造中胖大細胞浸潤及增生為特性，少數(shù)患者可在慢性SD的底子上產(chǎn)生胖大細胞白血玻原癌基因-kit的編碼產(chǎn)物-kit卵白是干細胞/胖大細胞生長因子的受體ste/astellgrthfatrreeptr)，在胖大細胞的生長發(fā)育中有緊張作用。-kitD816V突變，即產(chǎn)生在外顯子17的腺嘌呤胸腺嘧啶點突變，導(dǎo)致肽鏈816位點的天冬氨酸D被纈氨酸V取代，是成人散發(fā)性胖大細胞病的特性和重要病因，產(chǎn)生于約莫60%的患者1。以往對該病無殊效治療要領(lǐng)，比年來部門胖大細胞病患者經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)按捺劑伊馬替尼治療后得到了精良結(jié)果，但有D816V突變的患者那么對伊馬替尼耐藥2。故檢測胖大細胞病

4、的-kit基因突變對付選擇治療方案、斷定預(yù)后有緊張意義。我們用變性高效液相色譜技能(denaturinghighperfraneliquidhratgraphy，DHPL)對7例體系性胖大細胞病患者的-kit基因外顯子17-19全上舉行突變掃描，以確定D816V的產(chǎn)生率，猜測患者對伊馬替尼的療效，并在這3個編碼激酶區(qū)的外顯子中檢測是否有其他的突變。質(zhì)料和要領(lǐng)病例7例體系性胖大細胞病患者系英國Haersith病院及Barthle病院患者。男4例，女3例，中位年事48歲29-74歲。DNA提取標本取自患者骨髓2l或外周血5l，通例酚/氯仿法提取基因組DNA，于-20保存?zhèn)溆?。突變檢測應(yīng)用DHPL技

5、能舉行突變檢測。DHPL技能是比年來用于挑選DNA布局變異的一項新技能，其原理是：在DNA部門變性環(huán)境下，當活動相緩沖液B中的乙腈梯度增長時，有錯配的異源雙鏈會早于同源雙鏈從AVE體系的結(jié)實相中被洗脫出來而被紫外檢測體系檢測到非常的色譜峰。但假設(shè)突變是純合子或半合子，那么無法形成異源雙鏈。以是我們將全部待測樣本別離與野生型的正凡人胎盤DNASiga公司產(chǎn)物等量混淆后變性及遲鈍復(fù)性，假設(shè)待測DNA中有突變存在，將在復(fù)性時形成自身同源雙鏈的同時與正常DNA形成異源雜合雙鏈，進而表現(xiàn)出非常的色譜峰。引物方案與合成各引物序列均選在內(nèi)含子部位且距剪接點40-60bp以包管擴增全長待測外顯子及剪接地區(qū)，因

6、內(nèi)含子18較短，故外顯子18、內(nèi)含子18及外顯子19利用1對引物同時擴增。引物由美國Siga公司合成。引物序列如下：外顯子17：上游5-GTGAAATATTAAGGGT-3；卑劣5-GTGTGATAT-TAGAAGG-3。外顯子18/19：上游5-GAAAGAGATTATAAG-3；卑劣5-ATAAATTGGGTTT-3。基因組DNA擴增反響體系為75l，構(gòu)成為：上游及卑劣引物(100pl/l)各0.375l，dNTP(20l/L)0.75l，10緩沖液7.5l，ApliTaqGldDNA聚合酶(5U/l)0.375l，DNA100ng,gl2(25l/L)4.5l。PR條件為：95預(yù)變性5分

7、鐘；94變性1分鐘，外顯子1758退火1分鐘、外顯子18/1962退火1分鐘，72延伸1分鐘，擴增33個循環(huán)；末了72延伸10分鐘。擴增產(chǎn)物長度外顯子17為412bp，外顯子18/19為495bp。取擴增產(chǎn)物5l1.5%瓊脂糖凝膠100V電泳30分鐘，溴化乙錠染色，紫外闡發(fā)成像體系不雅察電泳結(jié)果并打櫻DHPL檢測將上述擴增后的患者DNA20l別離與人胎盤正常比較DNA20l混淆，95變性5分鐘，然后遲鈍復(fù)性每分鐘低落1.5至室溫。之后將各待測樣本置于AVE色譜儀Transgen-i公司產(chǎn)物，美國的96孔板上，輸入DNA序列；按照軟件NavigatrTransgeni的提示選擇最正確運行溫度：外

8、顯子17為56及57，外顯子18/19為58及60，在該運行溫度下DNA片斷的1%-50%將解旋形成單鏈DNA即DNA部門變性?；顒酉嗟臉?gòu)成為緩沖液A：100l/LTEAA(三乙銨乙酸酯，triethylaniuaetate)，pH7.0，0.1l/LEDTA(色譜純)；緩沖液B：100l/LTEAA及25%乙腈(aetnitrile)，pH7.0，均為美國Transgeni公司產(chǎn)物。最正確緩沖液梯度亦由軟件Navigatr設(shè)定：外顯子17緩沖液B起始含量為57.3%，外顯子18/19緩沖液B起始含量為58.5%；每分鐘緩沖液B含量進步2%以形成緩沖液梯度，梯度形成時間為4分鐘。設(shè)定每份標本進

9、樣量為8l，以流速為0.9l/in運行樣本，分散柱保存時間為6.3分鐘。另取人胎盤DNA40l做為陰性比較。紫外線檢測波長為260n，運行結(jié)果在色譜儀上表現(xiàn)并打櫻對表現(xiàn)非常色譜峰的樣本將舉行DNA序列測定。測序結(jié)果討論-kit基因位于染色體412，全長約102.42kb，共包羅21個外顯子；其RNA全長4813bp，編碼由976個氨基酸構(gòu)成的145kD的卵白質(zhì)-kitD117。-kit是一種受體酪氨酸激酶(reeptrtyrsinekinase,RTK)，屬于第型RTK成員之一，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系中具有緊張作用，與細胞增殖分化嚴密相干。-kit的RNA可在造血干/祖細胞、胖大細胞、生殖細胞、玄色素

10、細胞及胃腸道起搏細胞中表達，激酶的活性對這些細胞的生長是必不成少的3。-kit與其配體干細胞因子結(jié)合后產(chǎn)生二聚體化及自身磷酸化，進而激活激酶及卑劣信號分子，通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)治核內(nèi)基因的運動。-kit基因的突變將導(dǎo)致-kit受體連續(xù)激活，進而使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路連續(xù)激活，細胞處于連續(xù)增殖狀態(tài)，是胖大細胞病產(chǎn)生的分子生物學(xué)基矗的產(chǎn)生于胖大細胞病的-kit激酶區(qū)的突變位于外顯子17，重要為D816V改變，尚有D816Y天冬氨酸酪氨酸、D816F天冬氨酸苯丙氨酸、D816H天冬氨酸組氨酸及D820G天冬氨酸甘氨酸突變4。D816V突變可導(dǎo)致-kit酪氨酸激酶活性增長10倍、激酶與ATP的結(jié)合本領(lǐng)增長9

11、倍。少數(shù)患者有-kit編碼細胞內(nèi)近膜區(qū)序列的突變4。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)按捺劑(signaltransdutininhibitr)伊馬替尼格列衛(wèi)，Gleeve,STI571對慢性粒細胞白血病的治療獲得了令人煽動的精良結(jié)果，創(chuàng)始了分子靶向治療腫瘤的新紀元5。伊馬替尼是由瑞士諾華公司開拓的一種酪氨酸激酶按捺劑，不但高效按捺全部的ABL激酶，還以相似的特異性及活性按捺-kit及PDGFR。-kit激活的胖大細胞并胃腸道基質(zhì)瘤gastrintestinalstraltuur等用該藥治療后均獲得了精良結(jié)果6，7。但胖大細胞病D816V突變者那么對伊馬替尼耐藥，而野生型及-kit細胞內(nèi)近膜區(qū)突變者對伊馬替尼敏感。D8

12、16V突變者對伊馬替尼耐藥的機制大概由于突變型-kit對ATP的過高的親和力或由于D816V改變了-kit激酶激活環(huán)的空間構(gòu)象，致使突變型-kit無法與伊馬替尼結(jié)合，因此伊馬替尼無法發(fā)揮作用。DHPL技能是一種高通量、主動化篩查DNA突變的技能，如今正以其高效、高特異性、敏感性及相對價廉的長處得到了日益普及的應(yīng)用8-10。在我們的研究中，DHPL色譜圖有改變的樣本經(jīng)測序均表現(xiàn)DNA有變異；在我們的前期事情中曾用該要領(lǐng)檢測了大量樣本，特異性及敏感性均靠近100%，提示該要領(lǐng)是一種高效、可靠的突變檢測要領(lǐng)。該要領(lǐng)的不敷之處是無法得出詳細的突變位點及突變范例，還需DNA測序要領(lǐng)證明。本組患者突變檢測結(jié)果表現(xiàn)，1例患者為D816V陽性，估計對伊馬替尼耐藥，故未用該藥予以治療；在別的6例中的5例患者用伊馬替尼治療后病情均獲得了差異程度的緩解，另1例患者因病癥較輕尚未用