醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)培訓(xùn)課件

1、醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)原理正常紅細(xì)胞的G6PD能使6磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?磷酸葡萄糖酸，同時(shí)又能使其輔酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)還原為還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，高鐵血紅蛋白在NADPH供氫條件下還原成還原血紅蛋白。氧化型亞甲基藍(lán)可作為遞氫體加速磷酸戊糖旁路代謝中此種作用的速度，當(dāng)G6PD缺乏時(shí)，在遞氫體亞甲基藍(lán)加速磷酸戊糖旁路的條件下，高鐵血紅蛋白還原速度顯著降低，因此，可根據(jù)高鐵血紅蛋白還原的速度來了解紅細(xì)胞有無G6PD缺乏。2醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)原理正常紅細(xì)胞的G6PD能使6磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?磷酸葡萄G6PD的缺陷不能

2、提供足夠的NADPH以維持還原型谷胱甘肽（GSH）的還原性（抗氧化作用），在遇到蠶豆中某種因子后更誘發(fā)了紅細(xì)胞膜被氧化，紅細(xì)胞膜上的磷脂分子中的不飽和脂肪酸氧化生成過氧化脂質(zhì)，損害細(xì)胞膜。G-6-PD有保護(hù)正常紅細(xì)胞免遭氧化破壞的作用，新鮮蠶豆是很強(qiáng)的氧化劑，當(dāng)G-6-PD缺乏時(shí)則紅細(xì)胞被破壞而致病。亞甲基藍(lán)與血紅蛋白結(jié)合能力強(qiáng)亞硝酸鈉能使血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)意義 當(dāng)紅細(xì)胞G-6-PD活性正常時(shí)，還原率75%；如G-6-PD缺陷，形成高鐵血紅蛋白，還原速度遠(yuǎn)較正常紅細(xì)胞慢，還原率顯著降低。3醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)G6PD的缺陷不能提供足夠的NADPH以維持還原型谷胱甘

3、肽（實(shí)驗(yàn)試劑高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)法試劑(自制，有效期內(nèi)使用)：018 mo1 亞硝酸鈉一028 molI 葡萄糖溶液(亞硝酸鈉125 g，葡萄糖5o g，加蒸餾水至100 mL，貯存于棕色瓶中，放4冰箱可保存1個(gè)月) 04 mmolI 亞甲基藍(lán)溶液(先將0.15 g含3個(gè)結(jié)晶水的亞甲基藍(lán)放入乳缽中，加蒸餾水少量研磨，待溶解后移到100 mL容量瓶中再加蒸餾水至100 mL，混勻過濾，此液可貯存3個(gè)月)、生理鹽水、蒸餾水。4醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)試劑高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)法試劑(自制，有效期內(nèi)使用)：醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)培訓(xùn)課件實(shí)驗(yàn)步驟1 將抗凝血以1000 rmin離心沉淀1 5 mi

4、n，取出調(diào)整血細(xì)胞與血漿比側(cè)為1：l后再混勻。2 將018 molL 亞硝酸鈉一028 molL葡萄糖溶液與04 mmolL亞甲基藍(lán)溶液等量混合形成混合試劑3 取1 5 mm150 mm 試管3支，標(biāo)明A、B、S，按表1順序進(jìn)行操作表1 高軼血紅蛋白還原試驗(yàn)操作步驟6醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟1 將抗凝血以1000 rmin離心沉淀1 5 mABC混合試劑/ml 0.01_生理鹽水/ml_0.01_0.18mol/l亞硝酸鈉,-0.28mol/l葡萄糖溶液_0.017醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)ABC混合試劑/ml 0.01_生理鹽水/ml_0經(jīng)調(diào)整的全血/ml0.10.10.1來回?fù)u動15

5、-20次,置37水浴箱靜置3 h 蒸餾水mL 10.0010.0010.008醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)調(diào)整的全血/ml0.10.10.1來回?fù)u動15-20次,置4 顛倒混勻，以“B”管為空白管，在波長635 nm 處測定“A”管及“ S”管吸光度。5 高鐵血紅蛋白還原率(MHb% )=(1一AS)100 ，MHb%在3174 之間(中間值，雜合子)或30 (純臺子)，即為G 6PD活性缺乏，均判斷為陽性。MHb% 75 ，則為G6PD活性正常，判斷為陰性。9醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4 顛倒混勻，以“B”管為空白管，在波長635 nm 處測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果朗伯比爾定律A=lg（1/T）=Kbc（A-

6、吸光度，T-透射比，K-摩爾吸收系數(shù)，c-吸光物質(zhì)的濃度，b-收層厚度） 高鐵血紅蛋白還原率(MHb% )=(1一AS)100 ，MHb%在3174 之間(中間值，雜合子)或30 (純臺子)，即為G 6PD活性缺乏，均判斷為陽性。MHb% 75 ，則為G6PD活性正常，判斷為陰性。10醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果朗伯比爾定律A=lg（1/T）=Kbc（A-吸光度，思考題1.根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查，初步判斷患兒是何種疾病？（必答）面色蒼白貧血伴血尿血紅蛋白尿惡心、嘔吐說明有溶血性貧血尿呈醬油色蠶豆病典型體征姐姐有過類似情況符合蠶豆病具有遺傳性這一特點(diǎn)11醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思

7、考題1.根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查，初步判斷患兒是相關(guān)知識蠶豆病是由于遺傳性紅細(xì)胞六磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD酶)缺乏者進(jìn)食蠶豆后，隨后發(fā)生的急性溶血性疾病。通過性聯(lián)不全顯性遺傳，G-6-PD基因在X染色體上，病人大多為男性，男女之比約為71，在生吃蠶豆后數(shù)小時(shí)至數(shù)日（13天）內(nèi)突然發(fā)熱、頭暈、煩躁、惡心，尿呈醬油樣或葡萄酒色，一般發(fā)作26天后能自行恢復(fù)，但重者若不及時(shí)搶救，會因循環(huán)衰竭危及生命。 12醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相關(guān)知識蠶豆病是由于遺傳性紅細(xì)胞六磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD3.從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。（必答）蠶豆病遺傳性葡萄糖-6磷-酸脫氫酶 急性溶血

8、性貧血13醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。（必答）蠶1，G6PD的缺陷不能提供足夠的NADPH以維持還原型谷胱甘肽（GSH）的還原性（抗氧化作用），在遇到蠶豆中某種因子后更誘發(fā)了紅細(xì)胞膜被氧化，紅細(xì)胞膜上的磷脂分子中的不飽和脂肪酸氧化生成過氧化脂質(zhì)，損害細(xì)胞膜發(fā)生溶血。故臨床表現(xiàn)為黃疸，精神萎靡，低熱。溶血嚴(yán)重發(fā)生心力衰竭，造成食欲不振、惡心、嘔吐 這些臨床癥狀，心衰最典型的癥狀是程度不同的呼吸困難，所以病人呼吸急促。14醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1，G6PD的缺陷不能提供足夠的NADPH以維持還原型谷胱甘2，還原型谷胱甘肽（GSH）是體內(nèi)重要的抗氧化劑

9、，可以保護(hù)一些含SH(氫硫基)的蛋白質(zhì)或酶免受氧化劑尤其是過氧化物的損害。因G6PD的缺陷不能提供足夠的NADPH以維持還原型谷胱甘肽（GSH）的還原性（抗氧化作用），高鐵血紅蛋白還原成血紅蛋白降低。3，高鐵血紅蛋白還原率(MHb% )在3174 之間(中間值，雜合子)或30 (純臺子)，即為G 6PD活性缺乏，均判斷為陽性。MHb% 75 ，則為G6PD活性正常，判斷為陰性。15醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2，還原型谷胱甘肽（GSH）是體內(nèi)重要的抗氧化劑，可以保護(hù)一 4, 急性溶血性貧血起病急驟、可突發(fā)寒戰(zhàn)、高熱、面色蒼白、腰酸背痛、氣促、乏力、煩躁、亦可出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛 等胃腸道癥狀。這是

10、由于紅細(xì)胞大量破壞，其分解產(chǎn)物對機(jī)體的毒性作用所致。游離血紅蛋白在血漿內(nèi)濃度加深時(shí)，即由尿液排出，出現(xiàn)血紅蛋白尿，尿色如濃紅茶或醬油樣，12小時(shí)后可出現(xiàn)黃疸，溶血產(chǎn)物損害腎小管細(xì)胞，引起壞死和血紅蛋白沉積于腎小管，以及周圍循環(huán)衰弱等因素，可致急性腎功能衰竭。 16醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 4, 急性溶血性貧血16醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.要想探討該病發(fā)生的分子基礎(chǔ)，可以用哪些技術(shù)檢測什么目的基因？（選答）1.PCR，利用PCR技術(shù)由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟，擴(kuò)增葡萄糖6磷酸脫氫酶熱點(diǎn)基因片段。采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）技術(shù)對擴(kuò)增片段進(jìn)行分析。用PCR直接測序以確定突變的基因位點(diǎn)檢測X染色體內(nèi)G6PD的基因及擴(kuò)增其因.17醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.要想探討該病發(fā)生的分子基礎(chǔ)，可以用哪些技術(shù)檢測什么目的基5. 患者體型瘦小與該病癥是否有關(guān)，為什么？（選答） 無關(guān)，體型瘦小跟先天遺傳有一點(diǎn)關(guān)系，但是后天性的運(yùn)動跟營養(yǎng)更重要。有蠶豆病不一定就瘦小。蠶豆病不能吃蠶豆，但可以從其它食物中來彌補(bǔ)。蠶豆病最主要的特征是 G6PD缺陷。然