免疫組化技術(shù)培訓(xùn)課件

1、免疫組化技術(shù)免疫組化技術(shù)主要內(nèi)容一、熒光的特征二、熒光素三、熒光素標(biāo)記抗體的方法四、熒光抗體的質(zhì)量鑒定五、免疫熒光組化染色方法六、熒光顯微鏡七、非特異性熒光的消除方法 八、激光掃描共聚焦顯微鏡免疫組化技術(shù)2主要內(nèi)容一、熒光的特征二、熒光素三、熒光素標(biāo)記抗思考題： 1.什么叫熒光？ 2.常用熒光素有哪些特征？ 3.標(biāo)記熒光抗體有哪二種主要的制備方法？免疫組化技術(shù)3思考題： 1.什么叫熒光？ 2.常用熒光素有 4.免疫熒光組化直接法、間接法的 原理和主要操作流程？ 5.觀察熒光組化片時(shí)應(yīng)注意哪些問題？ 6.非特異性熒光的消除方法有哪幾種？免疫組化技術(shù)4 4.免疫熒光組化直接法、間接法的 原理和一、

2、熒光的特征 分子都含有電子，電子在不停地運(yùn)動(dòng)著。根據(jù)量子理論，運(yùn)動(dòng)著的電子可以處于一系列不連續(xù)的能量狀態(tài)中，電子遵守一定的規(guī)則，要以從一個(gè)能級(jí)向另一能級(jí)躍遷，并伴隨著與能級(jí)差相對(duì)應(yīng)的特定能量的吸收或釋放。免疫組化技術(shù)5一、熒光的特征 分子都含有電子，電子在不停地免疫組化技術(shù)6免疫組化技術(shù)6激發(fā) 當(dāng)電子吸收能量躍遷到較高能級(jí)， 這個(gè)過程叫激發(fā)。發(fā)射 以輻身方式躍遷時(shí)，能量轉(zhuǎn)化成相 應(yīng)波長(zhǎng)的光，這個(gè)過程叫發(fā)射。免疫組化技術(shù)7激發(fā) 當(dāng)電子吸收能量躍遷到較高能級(jí)， 這個(gè)過程熒光 躍遷到激發(fā)態(tài)的電子，大多處于單重激發(fā)態(tài)。如果電子直接從單重激發(fā)態(tài)以輻身方式躍遷到基態(tài)，由于單重激發(fā)態(tài)很不穩(wěn)定，半衰期很短，發(fā)

3、射持續(xù)的時(shí)間也很短，這種發(fā)射光，叫熒光。免疫組化技術(shù)8熒光 躍遷到激發(fā)態(tài)的電子，大多處于單重激發(fā)態(tài)。如果電子二、熒光素 能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素，必須具備：吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光。免疫組化技術(shù)9二、熒光素 能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物 1、具備用于標(biāo)記抗體的熒光素條件(1)應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)，結(jié)合后不易離解，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易排除。免疫組化技術(shù)10 1、具備用于標(biāo)記抗體的熒光素條件(1)應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子(2)熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光 素質(zhì)量下降不多。(3)標(biāo)記后對(duì)抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化 性質(zhì)無影響。(4)結(jié)合方法簡(jiǎn)便而快速，并且

4、較穩(wěn)定。免疫組化技術(shù)11(2)熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光 素質(zhì)量下降不多。(5)熒光素容易溶解，溶解后不會(huì)和其 他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(6)熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏 色對(duì)比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。免疫組化技術(shù)12(5)熒光素容易溶解，溶解后不會(huì)和其 免疫組化技術(shù)122.熒光素的種類(1)異硫氰酸熒光黃（FITC）：分子量390D，最大吸收光譜為490495nm，最大發(fā)射光譜為520530nm。呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，分子量389.4。免疫組化技術(shù)132.熒光素的種類(1)異硫氰酸熒光黃（FITC）：分子量3免疫組化技術(shù)14免疫組化技術(shù)14(2)四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（TRITC）是羅達(dá)明的衍

5、生物，易溶于水，最大吸收光譜為550nm，最大發(fā)射光譜為620nm，呈橙紅色熒光。免疫組化技術(shù)15(2)四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（TRITC）是羅達(dá)明的衍生物，易免疫組化技術(shù)16免疫組化技術(shù)16免疫組化技術(shù)17免疫組化技術(shù)17(3)四乙基羅達(dá)明(RB200) 呈褐紅色粉末狀，溶于乙醇和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。最大吸收光譜570nm，最大發(fā)射光譜596600nm，呈明亮橙紅色熒光，分子量580，RB200不能直接和蛋白質(zhì)結(jié)合，要先經(jīng)五氯化磷反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成硫酰氯，再與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合。免疫組化技術(shù)18(3)四乙基羅達(dá)明(RB200) 呈褐紅色粉末狀，溶于乙醇和免疫組化技術(shù)19免疫組化技術(shù)19免疫組化

6、技術(shù)20免疫組化技術(shù)20(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯(5)4-乙酰胺-4-異硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）(6)得克薩斯紅（Texas red）(7)藻紅蛋白（PE）(8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）免疫組化技術(shù)21(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯(5)4-乙酰胺-4-異硫三、熒光素標(biāo)記抗體的方法(一)FITC標(biāo)記抗體的方法 1.Marsshall法(1)原理：當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體反應(yīng)時(shí)，主要是抗體分子上的賴氨酸 -氨基與FITC上硫碳胺鍵結(jié)合，一個(gè)IgG分子中有86個(gè)賴氨酸殘基，一般最多能結(jié)合1520個(gè)。免疫組化技術(shù)22三、熒光素標(biāo)記抗體的方法(一)FITC標(biāo)記

7、抗體的方法 1熒光素FITC-NC N-蛋白質(zhì) S H H FITC- N C N - 蛋白質(zhì) H S H免疫組化技術(shù)23熒光素FITC-NC N-蛋白質(zhì) 免疫組化技術(shù)2(2)操作流程 抗體與熒光素比例為50-100:1抗體的準(zhǔn)備：20mg/ml，碳酸鹽緩沖液為總 量的1/10。熒光素的準(zhǔn)備：用分析天平準(zhǔn)確稱取 0.01mgFITC/1mg抗體。結(jié)合：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體 溶液中。免疫組化技術(shù)24(2)操作流程 抗體與熒光素比例為50-100:1抗 透析 過柱 SephadeG50或 G25 保存 4 -40等量甘油分裝保存。2.Chadwick法3.改良法4.透析標(biāo)記法（二）四乙基

8、羅達(dá)明標(biāo)記抗體方法（三）藻紅蛋白標(biāo)記抗體方法免疫組化技術(shù)25 透析 過柱 SephadeG50或 G25 保免疫組化技術(shù)26免疫組化技術(shù)26四、熒光抗體的質(zhì)量控制主要進(jìn)行特異性和敏感性兩個(gè)方面的鑒定。1.特異性染色效價(jià)測(cè)定2.非特異性染色測(cè)定3.吸收試驗(yàn)4.F/P比值的測(cè)定方法免疫組化技術(shù)27四、熒光抗體的質(zhì)量控制主要進(jìn)行特異性和敏感性兩個(gè)方面的鑒定免疫組化技術(shù)28免疫組化技術(shù)28五、免疫熒光組織化學(xué)染色方法 1.直接法 簡(jiǎn)便、快速，用已知特異性標(biāo)記熒光的一抗與組織細(xì)胞內(nèi)抗原結(jié)合。操作流程：(1)冰凍切片經(jīng)固定，涼干PBS洗；石蠟切片脫蠟至水，消化30min，PBS洗。免疫組化技術(shù)29五、免疫

9、熒光組織化學(xué)染色方法 1.直接法 簡(jiǎn)便、快速，(2)適當(dāng)稀釋熒光抗體滴加在組織切片上，濕盒內(nèi)37溫育1h，PBS洗33min。(3)0.01%伊文氏藍(lán)襯染13min，PBS洗33min，蒸餾水洗2次，除去Nacl結(jié)晶。(4)pH9.0緩沖甘油封片。(5)鏡檢免疫組化技術(shù)30(2)適當(dāng)稀釋熒光抗體滴加在組織切片上，濕盒內(nèi)37溫育1h免疫組化技術(shù)31免疫組化技術(shù)312.間接法 是直接的重要改進(jìn)，先用標(biāo)記的已知特異性一抗與組織細(xì)胞內(nèi)抗原結(jié)合，隨后用間接熒光標(biāo)記二抗與一抗特異性結(jié)合。免疫組化技術(shù)322.間接法 是直接的重要改進(jìn)，先用標(biāo)記的已知特異性一抗與組免疫組化技術(shù)33免疫組化技術(shù)33操作流程 (1

10、)冰凍切片經(jīng)固定，涼干后PBS洗；石蠟切片脫蠟至水，PBS洗，酶消化，PBS洗33min。(2)適當(dāng)稀釋特異性一抗，37孵育1h，或室溫4h，或4過夜，PBS洗33min。免疫組化技術(shù)34操作流程 (1)冰凍切片經(jīng)固定，涼干后PBS洗；石蠟切片脫(3)熒光標(biāo)記二抗適當(dāng)稀釋37 30min，PBS洗33min。(4)0.01%伊文氏藍(lán)襯染13min，PBS洗33min。(5)封片，鏡檢。免疫組化技術(shù)35(3)熒光標(biāo)記二抗適當(dāng)稀釋37 30min，PBS洗33六、熒光顯微鏡檢查方法 1.熒光顯微鏡 熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光源，濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)，光學(xué)系統(tǒng)和

11、攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。免疫組化技術(shù)36六、熒光顯微鏡檢查方法 1.熒光顯微鏡 熒光顯微鏡(1)光源 光源的亮度應(yīng)根據(jù)熒光素的類型選擇。小功率汞燈可滿足激勵(lì)一般熒光染料的要求。對(duì)于免疫熒光染色需用大功率超高壓汞燈。其工作時(shí)，兩個(gè)電極間放電，引起球內(nèi)水銀蒸發(fā)，經(jīng)過515min，球內(nèi)氣壓升至5070標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，此時(shí)達(dá)到最高亮度，成為穩(wěn)定工作狀態(tài)。免疫組化技術(shù)37(1)光源 光源的亮度應(yīng)根據(jù)熒光素的類型選擇。小功率汞燈可(2)濾片系統(tǒng) 是熒光顯微鏡的重要組成部分，是獲得特定波長(zhǎng)光，清晰的熒光影像和發(fā)揮顯微鏡最佳性能之關(guān)鍵。了解濾片性能，正確地選擇濾片是觀察熒光效應(yīng)

12、的前提和必要條件。免疫組化技術(shù)38(2)濾片系統(tǒng) 是熒光顯微鏡的重要組成部分，是獲得特定波長(zhǎng)濾片系統(tǒng)包括激發(fā)濾片，阻斷濾片、隔熱濾片，分光鏡和其他一些中性濾片。免疫組化技術(shù)39濾片系統(tǒng)包括激發(fā)濾片，阻斷濾片、隔熱濾片，分光鏡和其他一些中熒光顯微鏡的濾片系統(tǒng)激勵(lì)法分光鏡激發(fā)濾光片截止濾光片用途UDM400BP330-385BP360-370BA420自動(dòng)熒光觀察法，DAPI(聯(lián)脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342染色體VDM455BP400-410BA455兒茶酚胺觀察BVDM455BP400-440BA475芥子喹吖因；染色體BP420-440硫磺素S：淋巴細(xì)胞吖淀黃素

13、：核酸BDM500BP450-480BA515異硫氰酸熒光素：熒光抗體觀察BP470-490吖啶橙：DNA，RNABP420-480金胺結(jié)核桿菌IBDM505PB460-490BA515IFBP470-490GDM570BP510-550BA590羅丹明BP530-550四甲基羅丹明異硫氰酸鹽：熒光抗體觀察BP480-550碘化丙啶：DNAIGDM565BP520-550BA580IFDM600BP545-580BA610IF德克薩斯紅：熒光抗體觀察免疫組化技術(shù)40熒光顯微鏡的濾片系統(tǒng)激勵(lì)法分光鏡激發(fā)濾光片截止濾光片用途UD2.標(biāo)本制作要求(1)載玻片厚度應(yīng)在0.61.2mm之間(2)蓋玻片應(yīng)

14、光潔，厚度在0.17mm左右(3)標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激分。免疫組化技術(shù)412.標(biāo)本制作要求(1)載玻片厚度應(yīng)在0.61.2mm之間(4)封片劑 常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.59.5時(shí)較亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.09.5的碳酸鹽緩沖液等量混合作封片劑。免疫組化技術(shù)42(4)封片劑 常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮熒光信號(hào)增強(qiáng)封片劑 mowiol 40-88 4.8g 甘油 12ml 蒸餾水 12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml免疫組化技術(shù)43熒光信號(hào)

15、增強(qiáng)封片劑 mowiol 40-88 上述混合（加熱溶解），5000g離心，15min，最后加入1.4-diazobicydo-2,2,2-octane(DABcos)，終濃度2.5%(約1.25g)，溶解后，分裝存于-20中。(5)鏡油免疫組化技術(shù)44 上述混合（加熱溶解），5000g離心，15min，最3.使用熒光顯微鏡注意事項(xiàng)(1)嚴(yán)格按說明書操作，不要隨意改變程序。(2)應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。(3)防止紫外線對(duì)眼睛的損害。在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。(4)檢查時(shí)間每次以12h為宜，超過90min，超高壓汞燈強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱。免疫組化技術(shù)453.使用熒光顯微鏡注意事項(xiàng)(1)嚴(yán)格按說明

16、書操作，不要隨意(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。光源關(guān)閉后必須在30min后才能再啟動(dòng)光源，一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。免疫組化技術(shù)46(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保(6)標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察。(7)熒光高度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，分四級(jí)“ ”為陰性，“ ”為僅能見明確可見的熒光；“ ”為可見有明亮的熒光；“ ”為可見耀眼的熒光。免疫組化技術(shù)47(6)標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察。(7)熒光高度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，分四免疫組化技術(shù)48免疫組化技術(shù)48免疫組化技術(shù)49免疫組化技術(shù)49免疫組化技術(shù)50免疫組化技術(shù)50免疫組化技術(shù)51免疫組化技術(shù)51七、非特異性染

17、色的消除方法根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當(dāng)?shù)姆椒ǎＳ梅椒ǎ?1.動(dòng)物臟器粉末吸收法 2.透析法 3.Sephadex G-50柱層析法 4.DEAE纖維素柱層析法 5.熒光抗體稀釋法 6.純化抗原方法 7.純化抗體方法 8.伊文氏藍(lán)襯染方法：0.01%伊文氏藍(lán)免疫組化技術(shù)52七、非特異性染色的消除方法根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當(dāng)?shù)姆椒?，常八、激光掃描共聚焦顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope,LSCM)是80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的高科技新產(chǎn)品。免疫組化技術(shù)53八、激光掃描共聚焦顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡(la免疫組化技術(shù)54免疫組

18、化技術(shù)54 實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)部非侵入式光學(xué)斷層掃描成像，從而對(duì)被檢物體樣品從停留到表面單層，靜態(tài)平面的觀察進(jìn)行到立體，斷層掃描、動(dòng)態(tài)全面的觀察，在生命科學(xué)研究中得到迅速應(yīng)用。免疫組化技術(shù)55 實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)部非侵入式光學(xué)斷層掃描成像，從而對(duì)被檢免疫組化技術(shù)培訓(xùn)課件 (3)顯微鏡系統(tǒng)，它主要由倒置顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)組成。(4)檢測(cè)系統(tǒng)，由檢測(cè)器，檢測(cè)放大器等元件組成。(5)XY平臺(tái) (6)Z-軸步進(jìn)馬達(dá)免疫組化技術(shù)57 (3)顯微鏡系統(tǒng)，它主要由倒置顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)組成。免疫2.共聚焦成像原理 激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過光的擴(kuò)束和整形，變成一束直徑較大的平行光束，長(zhǎng)通分色光鏡使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過物

19、鏡會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)出沿各個(gè)方向的熒光，免疫組化技術(shù)582.共聚焦成像原理免疫組化技術(shù)58免疫組化技術(shù)59免疫組化技術(shù)59一部分熒光經(jīng)過物鏡，長(zhǎng)通分色反射鏡，聚焦透鏡，會(huì)聚在聚焦透鏡的焦點(diǎn)外，經(jīng)過焦點(diǎn)處的針孔，由檢測(cè)器接收并轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。免疫組化技術(shù)60一部分熒光經(jīng)過物鏡，長(zhǎng)通分色反射鏡，聚焦透鏡，會(huì)聚在聚焦透鏡3.光信號(hào)接收和成像方式(1)光信號(hào)接收 生物樣品發(fā)出的熒光通常有二種接收方式：由光電倍增管（PMT）把光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)；利用電荷耦合器（CCD）把光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。免疫組化技術(shù)613.光信號(hào)接收和成像方式(1)光信號(hào)接收 生物樣品發(fā)出的(2)成像

20、方式 載物臺(tái)運(yùn)動(dòng)成像：以直徑很小的激光束照射樣品，照射點(diǎn)發(fā)出的熒光信號(hào)經(jīng)PMT變成電信號(hào)，然后載物臺(tái)移動(dòng)到下一點(diǎn)，記錄該點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。該方法無軸向像差，成像時(shí)間長(zhǎng)；免疫組化技術(shù)62(2)成像方式 載物臺(tái)運(yùn)動(dòng)成像：以直徑很小的激光束照射樣品反射掃描成像方式，通過轉(zhuǎn)動(dòng)反射鏡使激光連續(xù)照射樣品，由CCD攝像機(jī)記錄下照射點(diǎn)所發(fā)射的熒光，成像速度快。免疫組化技術(shù)63反射掃描成像方式，通過轉(zhuǎn)動(dòng)反射鏡使激光連續(xù)照射樣品，由CC4.參數(shù)的選擇 基本參數(shù)：Confocal,pinhole,detector, PMT,Stepsize, X points, Y Points, scanstr,speed,LaserPwr,Auto zoom, Display, BR subval,Samples/pt等免疫組化技術(shù)644.參數(shù)的選擇 基本參數(shù)：Confocal,pinho5.性能特點(diǎn)：分辨率高，靈敏度高，掃描速度快，掃描范圍大，圖像存取方便，可進(jìn)行光切片的觀察，可進(jìn)行定量熒光分析。免疫組化技術(shù)655.性能特點(diǎn)：分辨率高，靈敏度高，掃描速度快，掃描范圍大，圖6.應(yīng)用 (1)組織光學(xué)切片 可對(duì)活的或固定的細(xì)胞及組織進(jìn)行無損傷的系列“ 光學(xué)切片”，得到其各層面的信息-“ 顯微CT”。 (2)三維圖像重建免疫組化技術(shù)666.應(yīng)用 (1)組