分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)課件

1、分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識生藥學(xué)中的一個分支學(xué)科中藥高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗性品種的培育瀕危緊缺中藥資源的保護(hù)和持續(xù)利用中藥新的、便捷、準(zhǔn)確的分子標(biāo)識鑒定方法的研究從基因?qū)哟?為過去不能很好解決的問題如道地藥材的研究、藥材品質(zhì)的定向調(diào)控等提供了新的方法和思路。分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識2生藥學(xué)中的一個分支學(xué)科中藥高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗性品種的培育分子生分子生藥學(xué)研究重點(diǎn)藥用植物的分子系統(tǒng)學(xué)研究藥用植物種質(zhì)資源的分子生物學(xué)研究生藥的分子鑒定研究道地藥材形成的分子機(jī)理研究珍稀瀕危中藥資源的遺傳多樣性分析和保護(hù)策略研究藥用植物的抗性基因工程研究藥用化學(xué)成分的生物轉(zhuǎn)化及分子機(jī)理研究藥用植物有效成分生物合成分子機(jī)理

2、與調(diào)控的研究和藥用植物細(xì)胞組織和轉(zhuǎn)基因器官培養(yǎng)與活性成分生產(chǎn)等分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識3分子生藥學(xué)研究重點(diǎn)藥用植物的分子系統(tǒng)學(xué)研究分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識分子生藥學(xué)研究策略分子遺傳標(biāo)記技術(shù)通過直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)性來診斷生物內(nèi)在基因排布規(guī)律及其外在性狀表現(xiàn)規(guī)律的技術(shù)。任何生物種或個體都具有特定的DNA 多態(tài)性，通過直接診斷分析DNA 的多態(tài)性，便能避開遺傳特性表現(xiàn)過程中的環(huán)境因素、數(shù)量性狀遺傳或部分與完全顯性的干擾，快速準(zhǔn)確地鑒定藥材真?zhèn)?。分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識4分子生藥學(xué)研究策略分子遺傳標(biāo)記技術(shù)通過直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)DNA 分子遺傳標(biāo)記技術(shù)已有20多種，認(rèn)為五大類比較合適進(jìn)行研究。分子生藥學(xué)研究方法1

3、. 以Southern 雜交為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)2. 以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)3. 以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)4. DNA序列分析分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識5DNA 分子遺傳標(biāo)記技術(shù)已有20多種，認(rèn)為五大類比較合適進(jìn)行DNA 分子遺傳標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)DNA 分子標(biāo)記不受發(fā)育時期和環(huán)境的影響，DNA分子標(biāo)記在基因水平進(jìn)行標(biāo)記，不受取材部位、時間和環(huán)境的影響，而形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記都是基因表達(dá)的結(jié)果，其結(jié)果受發(fā)育和環(huán)境的影響，測定有時會不準(zhǔn)確；DNA 分子標(biāo)記通常是共顯性，表現(xiàn)的信息量大，可精確鑒定基因型組合；DNA 分子標(biāo)記多態(tài)性強(qiáng)，根據(jù)測得的大量標(biāo)記位點(diǎn)繪制的連鎖圖，其多態(tài)信息量比形態(tài)標(biāo)記高

4、得多。分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識6DNA 分子遺傳標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)DNA 分子標(biāo)記不受發(fā)育時期和利用DNA分子遺傳標(biāo)記和基因組序列分析技術(shù)，從居群、分子乃至基因水平上，準(zhǔn)確刻劃藥用動植物遺傳背景差異和親緣關(guān)系，進(jìn)而構(gòu)建基于葉綠體基因組和（或）和基因組基因序列分析的重要藥用動植物系統(tǒng)發(fā)育樹，將是分子生藥學(xué)基礎(chǔ)研究的重心。目前可用于分子系統(tǒng)學(xué)研究的主要基因種類有：rbcL，matK，rps4，trnT-trnF， ITS等等。以葉綠體基因組片段為主，核基因應(yīng)用較少但信息量巨大。生藥的分子鑒定研究分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識7利用DNA分子遺傳標(biāo)記和基因組序列分析技術(shù)，從居群、分子乃至高純度的DNA模板的制備嚴(yán)格的Ta

5、q DNA聚合酶濃度和來源合適的鎂離子濃度，太高會產(chǎn)生彌散背景，太低了得到的PCR產(chǎn)物條帶淡分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識8高純度的DNA模板的制備分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識8DNA復(fù)制原理的具體應(yīng)用 PCR技術(shù)Polymerase Chain Reaction 聚合酶鏈反應(yīng) 它是一種模擬天然DNA復(fù)制過程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、RNA引物和四種dNTP的情況下，通過高溫變性（9095，12min）,低溫退火（2537，12min）,中溫延伸（6075，90 sec-5min）,這樣反復(fù)循環(huán)的過程中，在體外擴(kuò)增特異性DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。（原理圖）1、PCR反應(yīng)成分：Taq DNA聚合酶

6、 引物濃度：一般0.1-0.5mol/L dNTP:一般為50200mol/L Mg2+ 模板：PCR對模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可，但 樣品中不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑以 及能與 DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。 添加劑：DMSO（二甲基亞楓），提高擴(kuò)增效率及特異性 分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識9DNA復(fù)制原理的具體應(yīng)用 PCR技術(shù)Polymerase （1） 理論上PCR合成產(chǎn)物的數(shù)量經(jīng)過每輪循環(huán)都將增加一倍，應(yīng)按2n-2n的指數(shù)方式遞增，PCR反應(yīng)30輪循環(huán)后，PCR擴(kuò)增應(yīng)達(dá)到230個拷貝，約109個拷貝。但由于DNA聚合酶的質(zhì)量、待擴(kuò)增片段的序列及反應(yīng)系統(tǒng)的條件等各種因素的影響，實(shí)際擴(kuò)

7、增效率比預(yù)期的要低，一般可達(dá)106107個拷貝。 “平臺效應(yīng)”：PCR反應(yīng)中，當(dāng)引物模板與DNA聚合酶達(dá)到一定比值時，DNA聚合酶催化反應(yīng)趨于飽和，即PCR反應(yīng)不再增加。 平臺效應(yīng)在PCR反應(yīng)中是不可避免的，但一般在平臺效應(yīng)出現(xiàn)前，PCR產(chǎn)物的數(shù)量足以滿足實(shí)驗(yàn)的需要。 （2）PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 PCR方法操作簡便，但影響因素頗多，因此需要根據(jù)不同的DNA模板，摸索最適條件。主要從： 反應(yīng)的特異性、敏感性、忠實(shí)性、擴(kuò)增效率等四個方面衡量PCR反應(yīng)的結(jié)果。循環(huán)參數(shù) 變性 退火 延伸 PCR反應(yīng)成分分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識10 （1） 理論上PCR合成產(chǎn)物的數(shù)量經(jīng)過每輪循環(huán)都將（3）PCR反應(yīng)引物的設(shè)計

8、 引物的設(shè)計在整個PCR擴(kuò)增中占有十分重要的地位 特異性，擴(kuò)增性 引物的序列應(yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū)，且與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異性結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性引物長度：1530nt為宜。引物過短或過長均可使反應(yīng)的特異性下降。引物的堿基盡可能隨機(jī)發(fā)布，避免出現(xiàn)數(shù)個嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，G+C堿基的含量在4060之間。引物內(nèi)部應(yīng)避免形成二級結(jié)構(gòu)，特別是引物的末端應(yīng)避免有回文結(jié)構(gòu)。二個引物不應(yīng)有互補(bǔ)序列，特別是3端應(yīng)避免互補(bǔ)，以免形成“引物二聚 體”，浪費(fèi)引物。引物5末端堿基無嚴(yán)格限制，在與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠的條件下，其5端堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)

9、，因此可在引物5端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、啟動子序列或其它序列等以便于PCR產(chǎn)物的分析克隆等，引物的5端最多可加10個堿基而對PCR反應(yīng)無影響。分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識11（3）PCR反應(yīng)引物的設(shè)計分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識11PCR產(chǎn)物的分子克隆 克隆PCR產(chǎn)物的目的通常是：建立用于雜交分析的克隆化DNA的永久來源，得到高質(zhì)量的DNA序列結(jié)果，以及當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生復(fù)雜混合產(chǎn)物時用于分離PCR目的片段。PCR產(chǎn)物的直接克隆可以通過對擴(kuò)增片段進(jìn)行合適的末端處理而提高效率。 基本方案 產(chǎn)生TA突出端 TaqDNA聚合酶往往在所有的雙鏈DNA 3末端再加上一個非模板來源的核苷酸(通常為A)，使PCR片段的平端克隆往

10、往效率不高。當(dāng)只有dTTP存在時，Taq DNA聚合酶可在載體的平端加上一個T，這樣就會產(chǎn)生一個與A配對的突出端。分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識12PCR產(chǎn)物的分子克隆 克隆PCR產(chǎn)物的目的通遺傳標(biāo)記 （Genetic marker) 遺傳學(xué)中通常將可識別的等位基因稱為遺傳標(biāo)記。 但隨著遺傳學(xué)和基因概念的發(fā)展其內(nèi)涵也發(fā)展。除基因標(biāo)記外遺傳標(biāo)記主要包括：3.蛋白質(zhì)標(biāo)記：非酶蛋白質(zhì)和酶蛋白質(zhì)在非酶蛋白質(zhì)中，用得較 多的是種子貯藏蛋白；酶蛋白質(zhì)主要是同功酶。4.DNA 標(biāo) 記：也稱DNA多態(tài)性標(biāo)記、 DNA分子標(biāo)記， 是 DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映。1.形 態(tài) 標(biāo)記： 是指那些能夠明確顯示遺傳多態(tài)的外 觀

11、性狀，如株高、粒色等的相對差異2.細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 ：是指能夠明確顯示遺傳多態(tài)的細(xì)胞學(xué)特征。 如染色體結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性等分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識13遺傳標(biāo)記 （Genetic marker) 遺傳學(xué) 這里僅介紹遺傳的分子標(biāo)記中的幾種重要的分子標(biāo)記:1.同工酶標(biāo)記: 同工酶（Isozyme）是一類分子結(jié)構(gòu)不同、 功能相似、催化同樣的生化反應(yīng)的酶。 同工酶標(biāo)記是利用編碼同工酶的等位基因與同工酶酶譜的相關(guān)性及其共顯性的特點(diǎn)進(jìn)行染色體定位和遺傳連鎖分析。2.DNA分子標(biāo)記: （基于DNA-DNA雜交的DNA標(biāo)記） RFLP標(biāo)記 (restriction fragment length polymorph

12、ism)： DNA某一位點(diǎn)上的變異有可能引起該位點(diǎn)特異性的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的改變，包括原有位點(diǎn)的消失或出現(xiàn)新的酶切位點(diǎn)，致使酶切片段長度隨之發(fā)生變化。這種變化引起的多態(tài)現(xiàn)象即為限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)。 對RFLP的檢測主要是用Southern雜交的方法進(jìn)行，即利用限制酶酶解及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，然后用經(jīng)標(biāo)記的特異DNA探針與之雜交，通過發(fā)射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭示DNA的多態(tài)性。( 圖 Southern ) 分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識14 這里僅介紹遺傳的分子標(biāo)記中的幾種重要的分子標(biāo)記:2（基于PCR的DNA標(biāo)記：隨機(jī)引物PCR標(biāo)記） RAPD（random amp

13、lified polymorphic DNA）標(biāo)記： 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，用隨機(jī)短引物（人工合成的六核苷酸）進(jìn)行DNA的PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的DNA區(qū)段是事先未知的，具有隨機(jī)性和任意性，因此隨機(jī)引物PCR標(biāo)記技術(shù)可用于對任何未知基因組的研究。（RAPD 原理） ISSR (Inter-simple sequence repeats)標(biāo)記:簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性。利用基因組中常出現(xiàn)的SSR本身設(shè)計引物，無需預(yù)先克隆和測序。 SSR（simple sequence repeats)標(biāo)記:簡單重復(fù)序列多態(tài)性。又稱微衛(wèi)星DNA多態(tài)性，即由二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸串聯(lián)重復(fù)的拷貝數(shù)目不等而出現(xiàn)的多

14、態(tài)現(xiàn)象。(76)分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識15（基于PCR的DNA標(biāo)記：隨機(jī)引物PCR標(biāo)記） ISS（基于PCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的DNA標(biāo)記）AFLP（amplified fragments length polymorphism）標(biāo)記:擴(kuò)增片段長度多態(tài)性。通過對基因組DNA酶切片段的選擇性擴(kuò)增來檢測DNA酶切片段長度的多態(tài)性。AFLP揭示的DNA多態(tài)性是酶切位點(diǎn)和其后的選擇性堿基的變異。 （AFLP 原理）分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識16（基于PCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的DNA標(biāo)記）分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)（單核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記） SNP（single nucleotide polymorphism）標(biāo)記:

15、單核苷酸多態(tài)性。不同個體基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸的差別。其比較的不是DNA的片段長度，而是相同序列長度里的單個堿基的差別。 (SNP_) 主要類型的DNA分子標(biāo)記的技術(shù)特點(diǎn)比較分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識17分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識17RAPD標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于分子生藥學(xué)各方面：生物多樣性：隨著植物藥研究的不斷深入，可持續(xù)開發(fā)利用藥用植物資源的問題越來越受到重視。應(yīng)用RAPD技術(shù)進(jìn)行藥用植物生物多樣性研究，可以在遺傳多 樣性水平上了解天然產(chǎn)物多樣性與物種、生態(tài)及地理分布的關(guān)系，挖掘潛在的藥物資源，為開發(fā)新藥尋找途徑。RAPD方法可以檢測物種的遺傳多樣性，探討物種 的親緣關(guān)系和進(jìn)化趨勢。因此它是藥

16、用植物資源保護(hù)和種質(zhì)資源保存的依據(jù)，特別是對瀕危物種的研究更具有實(shí)際意義。（舒艷群, 白守梅, 陳毓 亨. RAPD技術(shù)在藥用植物研究中的應(yīng)用. 中草藥, 1999,30(2):147）RAPD標(biāo)記可用于生藥分類，在DNA分子水平上鑒別生物不同種、亞種、變種甚至株。RAPD標(biāo)記可用來制作生物類生藥系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上的樹狀圖，特別是種內(nèi)水平。這為生藥親緣進(jìn)化關(guān)系,尋找新的藥用資源開辟了新途徑。RAPD標(biāo)記可用于構(gòu)建基因圖譜，進(jìn)行基因定位，和對未知序列的DNA片段擴(kuò)增與測序。RAPD標(biāo)記亦可用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，指導(dǎo)藥用植物育種，防止品種間雜化和自交，選育優(yōu)良性狀的品種。分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識18RAP

17、D標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于分子生藥學(xué)各方面：分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知DNA 分子鑒定前景廣闊我國生藥品種繁多、來源復(fù)雜，根據(jù)最新統(tǒng)計,藥用動植物約有12000 種左右。但由于歷史、地理、人為等因素，加之研究手段的局限性，長期以來我國生藥仍處于品種混亂和質(zhì)量難以保證的不利局面，很大程度上制約了中醫(yī)藥的發(fā)展。而DNA 分子鑒定法，將使生藥鑒定技術(shù)得以創(chuàng)新，而使得中醫(yī)藥的發(fā)展真正走向現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化、國際化之路。分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識19DNA 分子鑒定前景廣闊我國生藥品種繁多、來源復(fù)雜，根據(jù)最新鑒定近緣生藥品種；鑒定名貴易混淆生藥；鑒定動物類生藥；鑒定藥材道地性；鑒定生藥野生與家種；刻劃生藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化；鑒定中藥原粉制

18、劑。等方面具有重要應(yīng)用價值分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識20鑒定近緣生藥品種；等方面具有重要應(yīng)用價值分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識2范例一黃芪藥材的植物來源復(fù)雜，藥典收載2種植物膜莢黃芪（A. membranaceus Fisch. Bge）和蒙古黃芪（A. membranaceus Fisch. Bge. Var. mongholicus）。此外還有地方不同屬植物紅芪。由于市面上黃芪經(jīng)過加工后，多種形態(tài)發(fā)生變化，而且近緣種形態(tài)特征相似，僅從形態(tài)學(xué)、化學(xué)成分鑒定，困難較大。利用RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性）進(jìn)行相關(guān)研究，就可以從基因水平揭示黃芪遺傳本質(zhì)，為黃芪鑒定提供依據(jù)。RAPD分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識21范例一黃芪藥材的植

19、物來源復(fù)雜，藥典收載2種植物膜莢黃芪葉綠體matk基金石斛鑒定真?zhèn)纹诽m科石斛屬5種植物金釵石斛、鐵皮石斛、束花石斛、粉花石斛、流蘇石斛資源短缺造成石斛屬30余種植物和近緣屬的多種植物充斥與藥材市場，因此有必要利用分子標(biāo)記技術(shù)對真?zhèn)纹愤M(jìn)行區(qū)分范例二分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識22葉綠體matk基金石斛鑒定真?zhèn)纹贩独肿由帉W(xué)醫(yī)學(xué)知識22藥典收錄石斛偽品系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識23藥典收錄石斛偽品系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識23方法特點(diǎn)利用DNA測序技術(shù)，測定真?zhèn)纹肥鷐atk基因核苷酸序列變化，通過核苷酸序列變化程度，利用進(jìn)化分析軟件，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，得出親緣關(guān)系，從核酸水平揭示真?zhèn)纹穮^(qū)別分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識24方法特點(diǎn)利用DNA測序技術(shù)，測定真?zhèn)纹肥鷐atk基因核苷酸分子生藥學(xué)醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)課件3、4、5、6、7為野生天麻