蛋白互作研究方法課件

1、蛋白質(zhì)相互作用研究方法王心宇College of Life Sciences1最新課件蛋白質(zhì)相互作用王心宇College of Life Scie1 研究蛋白質(zhì)相互作用的意義 隨著生命現(xiàn)象的研究逐漸由獲取基因序列信息轉(zhuǎn)向研究基因功能,一門新的學(xué)科蛋白質(zhì)組學(xué)proteomics應(yīng)運而生。蛋白質(zhì)組是一個在空間和時間上動態(tài)變化的整體,其功能往往是通過蛋白質(zhì)之間或與核酸之間相互作用而表現(xiàn)出來的,這種相互作用存在于機體每個細(xì)胞的生命活動過程中,相互交叉形成網(wǎng)絡(luò),構(gòu)成細(xì)胞中一系列重要生理活動的基礎(chǔ)。因此,對于蛋白質(zhì)相互作用interactome的研究就成為蛋白質(zhì)組學(xué)中最主要研究內(nèi)容之一。2最新課件1 研究

2、蛋白質(zhì)相互作用的意義2最新課件2 蛋白質(zhì)相互作用常用研究方法1 酵母雙雜交(Yeast two-hybrid,Y2H)2 pull-down3 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)4 雙分子熒光互補技術(shù)(Biomolecular fluorescence complementation,BiFC or Split YFP)5 Far-western analysis3最新課件2 蛋白質(zhì)相互作用常用研究方法3最新課件3 酵母雙雜交技術(shù)3.1 原理DNA-binding and activating functions in a transcription fac

3、tor may comprise independent domains of the protein.4最新課件3 酵母雙雜交技術(shù)DNA-binding and activThe two hybrid technique tests the ability of two proteins to interact by incorporating them into hybrid proteins where one has a DNA-binding domain and the other has a transcription-activating domain.5最新課件The two

4、 hybrid technique tests3.2 酵母雙雜交文庫構(gòu)建與篩選BD Matchmaker Library Construction & Screening Kits6最新課件3.2 酵母雙雜交文庫構(gòu)建與篩選6最新課件誘餌蛋白載體構(gòu)建7最新課件誘餌蛋白載體構(gòu)建7最新課件8最新課件8最新課件pGADT7-Rec Vector Information9最新課件pGADT7-Rec Vector Information9文庫構(gòu)建10最新課件文庫構(gòu)建10最新課件11最新課件11最新課件Constructing AD fusion libraries by recombination-me

5、diated cloning in yeast.12最新課件Constructing AD fusion libraricDNA library of oilseed rape line RS-1 constructed in yeast13最新課件cDNA library of oilseed rape lYeast cells that are mating. A zygote typically has three-lobed shape, the lobes representing the two haploid(parental) cells and the budding dip

6、loid cells.Library screening by mating14最新課件Yeast cells that are mating. APositive clones confirmed on SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal15最新課件Positive clones confirmed on S檢測特定兩個蛋白是否互作16最新課件檢測特定兩個蛋白是否互作16最新課件pGADT7 Vector Information17最新課件pGADT7 Vector Information17最新課3.3 膜蛋白互作研究方法基于泛素的酵母雙雜交體系(mating-b

7、ased Split ubiquitin system mbSUS“)1）GAL4體系的缺點2) MbSUS 體系18最新課件3.3 膜蛋白互作研究方法18最新課件mbSUS 原理19最新課件mbSUS 原理19最新課件20最新課件20最新課件In vivo cloning into mbSUS vectorsGATEWAY cloning method21最新課件In vivo cloning into mbSUS vec22最新課件22最新課件23最新課件23最新課件24最新課件24最新課件25最新課件25最新課件26最新課件26最新課件27最新課件27最新課件28最新課件28最新課件4

8、pull down1) 原理29最新課件4 pull down29最新課件30最新課件30最新課件2)試劑盒31最新課件2)試劑盒31最新課件The MagneGST. Pull-Down System32最新課件The MagneGST. Pull-Down SystemFigure 1. Overview of the MagneGST. Pull-Down System protocol. P = Prey Protein, M = MagneGST. Particle.33最新課件Figure 1. Overview of the Magn5 免疫共沉淀Co-IP34最新課件5 免疫共

9、沉淀Co-IP34最新課件35最新課件35最新課件36最新課件36最新課件6 Far-western analysis37最新課件6 Far-western analysis37最新課件 雙分子熒光互補(bimolecular fluorescence complementation，BiFC) 分析技術(shù)，利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP) 及其突變體(YFP,CFP,BFP)的特性作為報告基因，將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標(biāo)蛋白連接. 如果兩個目標(biāo)蛋白因為有相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重

10、新形成活性的熒光基團而發(fā)出熒光. 在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標(biāo)蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活細(xì)胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用發(fā)生的時間、位置、強弱、所形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的穩(wěn)定性，以及細(xì)胞信號分子對其相互作用的影響等，這些信息對研究蛋白質(zhì)相互作用有一定意義。7 雙分子熒光互補技術(shù) BiFC38最新課件 雙分子熒光互補(bimolecular fluorescPrinciple of the BiFC assay39最新課件Principle of the BiFC assay39最GFP的特性 綠色熒光蛋白(GFP) 來源于水母(Aequorea victoria)，分子質(zhì)量約為

11、27 kda，能在各種細(xì)胞中表達. 受到激發(fā)時，不需要任何輔助因子，就能在活體中發(fā)出綠色熒光. 1992 年，Prasher 等2克隆了GFP 基因. 隨后，GFP 作為一種研究基因表達和蛋白質(zhì)定位的活體可遺傳標(biāo)記，在各種類型細(xì)胞的研究中得到了廣泛的應(yīng)用.40最新課件GFP的特性40最新課件GFP 的一些定點突變能明顯地改變其波長性質(zhì). 產(chǎn)生的突變體,具有產(chǎn)生多色光的特性，如：GFP66 位的酪氨酸突變?yōu)樯彼岷蟪蔀榍嗌珶晒獾鞍?cyan fluorescence protein，CFP)，203 位的蘇氨酸突變?yōu)槔野彼岷蟪牲S色熒光蛋白(yellow fluorescence protein，

12、YFP)，145 位酪氨酸突變?yōu)楸奖彼岷蟪伤{色熒光蛋白(blue fluorescence protein， BFP) 3. 2002 年Hu 等1 最先報道了用BiFC技術(shù)在活細(xì)胞中觀察bZIP 和Rel 家族蛋白的相互作用，利用的就是YFP 作標(biāo)記，在熒光顯微鏡下用525 nm 波長直接檢測黃色熒光.41最新課件GFP 的一些定點突變能明顯地改變其波長性質(zhì). 產(chǎn)生的突變體GFP及其各種突變體的片段互補特性42最新課件GFP及其各種突變體的片段互補特性42最新課件Visualization of protein interactions in living plant cells usin

13、g bimolecular fluorescence complementation43最新課件Visualization of protein interDetection of proteinprotein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementationDepartment of Plant Sciences, Tel Aviv University, Tel Aviv 69978, Israel44最新課件Detection of proteinprotein iConfocal images of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) studies45最新課件Confocal images of bimolecularIPG735+P