貝類中麻痹性貝類毒素的測定 標準文本（食品安全國家標準）

1、 食品安全國家標準貝類中麻痹性貝類毒素的測定范圍本標準適用于貝類及其制品中麻痹性貝類毒素的測定。第一法為小鼠生物法，適用于麻痹性貝類毒素的總量測定；第二法為酶聯(lián)免疫吸附法，適用于麻痹性貝類毒素的篩查檢測；第三法為高效液相色譜法，適用于麻痹性貝類毒素總量（STXeq），以及GTX4、GTX1、dcGTX3、B1、dcGTX2、GTX3、GTX2、neoSTX、dcSTX、STX等組分含量的常規(guī)檢測；第四法為液相色譜-串聯(lián)質譜測定法，適用于GTX1、GTX 4、GTX2、GTX 3、dcGTX2、dcGTX 3、neoSTX、STX、dcSTX、GTX5等10種麻痹性貝類毒素組分含量的測定及確證。

2、第一法 小鼠生物法原理方法采用小鼠生物法對PSP予以定量。根據(jù)小鼠腹腔注射貝類提取液后的死亡時間，查出鼠單位，并按小鼠體重，校正鼠單位（corrected mouse unit，CMU），計算確定每100 g樣品中PSP的鼠單位。以石房蛤毒素作為標準，將鼠單位換算成毒素的微克數(shù)，計算確定每100 g貝肉內的PSP微克數(shù)。所測XX果代表存在于貝肉內各種化學結構的PSP毒素總量。試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級水。3.1 氫氧化鈉（NaOH）：將4.0 g 氫氧化鈉（NaOH）溶于1 L蒸餾水中。3.2 鹽酸（HCl）：分析純。3.2.1 鹽酸溶液

3、（0.18 mol/L）：將15 mL濃鹽酸（HCL）用蒸餾水稀釋至1 L。3.2.2 鹽酸溶液（5 mol/L）：將41.7 mL濃鹽酸用蒸餾水稀釋至100 mL。3.3 無水乙醇（CH3CH2OH）：分析純。3.4 石房蛤毒素標準品（Saxitoxin，STX， C10H17N7O42HCl）：純度98.0。3.5 標準溶液的配制3.5.1 石房蛤毒素貯備液（100 g/mL）：用蒸餾水配制20（v/v）的乙醇溶液，用5 mol/L鹽酸調節(jié)pH到2.04.0之間，備用。精確稱取STX標準品，用上述溶液定容至STX濃度為（100 g/mL）。3.5.2 石房蛤毒素工作液（1 g/mL）：準確

4、吸取1 mL石房蛤毒素貯備液，用蒸餾水稀釋，調節(jié)pH在2.04.0之間，定容至100 mL，該標準工作液可在34下穩(wěn)定30天。3.6 小鼠：體重為19 g21 g的健康ICR系雄性小鼠。若小鼠重量21 g，則根據(jù)附錄B表B.1得到小鼠體重校正系數(shù)。儀器和設備4.1 均質器。4.2 電爐。4.3 天平：感量0.1 g，0.0001 g。4.4 離心機：轉速2000 轉/分鐘。4.5 pH計或pH試紙。4.6 一次性注射器：1 mL。5 分析步驟5.1 試樣制備 5.1.1 樣品采集及保存5.1.1.1 分析樣品要有充分的代表性，應從足量（一般應2 kg以上）的混合樣品中挑選良好的貝類去殼，用于分

5、析的去殼肉量應達200 g以上。5.1.1.2 不能及時送檢的新鮮貝類，按5.1.2方法將貝肉分離，將瀝水后的200 g貝肉放入0.18 mol/L、200 mL的鹽酸溶液中，置4冷藏保存，備檢。5.1.2 樣品制備5.1.2.1 牡蠣、蛤及貽貝用清水將貝殼外表徹底洗凈，切斷閉殼肌，開殼，用蒸餾水淋洗內部去除泥沙及其他異物。將閉殼肌和連接在膠合部的組織分開，仔細取出貝肉，切勿割破貝體。嚴禁加熱或用麻醉劑開殼。收集約200 g肉分散置于篩子中瀝水5 min（不要使肉堆積），檢出碎殼等雜物，將貝肉粉碎備用。5.1.2.2 扇貝取可食部分用作檢測，過程同5.1.2.1。5.1.2.3 冷凍貝類在室溫

6、下，使冷凍的樣品（帶殼或脫殼的）自然融化，按5.1.2.1方法開殼、淋洗、取肉、粉碎、備用。5.1.2.4 貝類罐頭將罐內所有內容物（肉及液體）倒入均質器中充分均質。如果是大罐，將貝肉瀝水并收集瀝下的液體分別稱重并存放固形物和湯汁，將固形物和湯汁按原罐裝比例混合，均質后備用。5.1.2.5 用酸保存的貝肉瀝去酸液，分別存放貝肉及酸液，備用。5.1.2.6 貝肉干制品干制品可于等體積0.18 mol/L 鹽酸溶液中浸泡24 h48 h（4冷藏），按5.1.2.4方法瀝干，分別存放貝肉和酸液備用。5.2 測定步驟5.2.1 PSP標準品對照試驗5.2.1.1 PSP標準工作液的配制用10 mL、1

7、5 mL、20 mL、25 mL和30 mL的蒸餾水分別稀釋1 g/mL的石房蛤毒素標準工作液10 mL，配制成系列濃度的標準稀釋液。5.2.1.2 中位數(shù)死亡時間的標準液選擇取按5.2.1.1配制的系列濃度的標準稀釋液各1 mL，腹腔注射小鼠數(shù)只，選擇中位數(shù)死亡時間為5 min7 min的濃度劑量。如某濃度稀釋液已達到要求，還需以1 mL蒸餾水的增減量進行補充稀釋試驗。例如：用25 mL蒸餾水稀釋的10 mL標準液在5 min7 min殺死小鼠，還需進行24 mL10 mL和26 mL10mL稀釋度的試驗。每只小鼠試驗前稱重，以10只小鼠為一組，用中位數(shù)死亡時間在5 min7 min范圍內的

8、二個濃度含量的標準稀釋液注射小鼠，測定并記錄每只小鼠腹腔注射完畢至停止呼吸的所需死亡時間。5.2.1.3 毒素轉換系數(shù)（conversion factor ，CF）的計算5.2.1.3.1 小鼠中位數(shù)死亡時間的選擇計算所選擇濃度的標準稀釋液受試組中位數(shù)死亡時間。棄去中位數(shù)死亡時間小于5 min或大于7 min的受試組；選擇中位數(shù)死亡時間在5 min7 min的受試組，該受試組中可有個別小鼠的死亡時間可小于5 min或大于7 min。5.2.1.3.2 校正鼠單位（CMU）的計算對于所選定的中位數(shù)死亡時間為5 min7 min的受試組，根據(jù)附錄A查得組中每只小鼠死亡時間所對應的鼠單位（MU），再

9、根據(jù)附錄B查得組中每只小鼠體重所對應的體重校正系數(shù)，同一只小鼠的體重校正系數(shù)與鼠單位相乘得該只受試小鼠的校正鼠單位（CMU）。5.2.1.3.3 毒素轉換系數(shù)（CF）的計算對于選定的受試組，用該受試組所選稀釋液每毫升實際毒素含量的微克數(shù)（以石房蛤毒素為例計算），除以受試組中每只小鼠的CMU值，得到單只小鼠的毒素轉換系數(shù)（CF），計算見公式（1），再計算每組10只小鼠的平均CF值，即為組內毒素轉換系數(shù)。 CF C （1）CMU式中：CF毒素轉換系數(shù)；C每毫升STX實際毒素含量，單位為微克每毫升（g/mL）；CMU校正鼠單位。5.2.1.3.4 組間毒素轉換系數(shù)（CF）的計算取不同受試組組內毒素轉

10、換系數(shù)的平均值，即為組間毒素轉換系數(shù)。以組間毒素轉換系數(shù)進行8.2中檢測樣品的毒力計算。5.2.1.3.5 CF值定期檢查如PSP檢測間隔時間較長，每次測定時要用適當?shù)臉藴氏♂屢鹤⑸?只小鼠，重新測定CF值。如果一周有幾次檢測，則用中位數(shù)死亡時間5 min7 min的標準稀釋液每周檢查一次，測得的CF值應在原測定CF值的20范圍內。若結果不符，用同樣的標準稀釋液另外注射5只小鼠，綜合先前注射的5只小鼠結果，算出CF值。并用同樣的標準稀釋液注射第二組10只小鼠，將第二組求出的CF值和第一組的CF值進行平均，即為一個新的CF值。重復檢查的CF值通常在原結果的20之內，若經常發(fā)現(xiàn)有較大偏差，在進行常

11、規(guī)檢測前應調查該方法中是否存在未控制或未意識到的可變因素。5.2.2 試樣提取5.2.2.1 取100 g按5.1.2.1、5.1.2.2、5.1.2.3、5.1.2.4處理的樣品于800 mL燒杯中，加0.18 mol/L 鹽酸溶液100 mL充分攪拌，均質，調整pH在2.04.0范圍內；按5.1.2.5或5.1.2.6和5.1.1.2處理的樣品，取100 g貝肉，加入相應的酸液100 mL，調pH為2.04.0后均質。必要時，可逐滴加入5 mol/L 鹽酸溶液或0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調整pH，加堿時速度要慢，同時需不斷攪拌，防止局部堿化破壞毒素。5.2.2.2 將混合物加熱煮沸5

12、 min，冷卻至室溫，將混合物移至量筒中并稀釋至200 mL，調節(jié)pH至2.04.0（pH值切勿4.5）。5.2.2.3將混合物倒回燒杯，攪拌均勻，自然沉降至上清液呈半透明狀，不堵塞注射針頭即可，必要時將混合物或上清液以3000 r/min離心5 min，或用濾紙過濾。收集上清液備用。5.2.3 小鼠試驗5.2.3.1 取19.0 g 21.0 g健康ICR雄性小鼠6只，稱重并記錄重量。隨機分為實驗組和空白對照組（0.18 mol/L 鹽酸）兩組，每組三只。5.2.3.2 對每只試驗小鼠腹腔注射1 mL提取液或空白對照液。注射過程中若有一滴以上提取液溢出，須將該只小鼠丟棄，并重新注射一只小鼠。

13、5.2.3.3 記錄注射完畢時間，仔細觀察并記錄小鼠停止呼吸時的死亡時間（到小鼠呼出最后一口氣止）。 5.2.3.4 若注射樣品原液后，1只或2只小鼠的死亡時間大于7 min，則需再注射至少三只小鼠以確定樣品的毒力。5.2.3.5 若小鼠的死亡時間小于5 min，則要稀釋樣品提取液后，再注射另一組小鼠（3只），直至得到5 min7 min的死亡時間；稀釋提取液時，要逐滴加入0.18 mol/L鹽酸溶液，調節(jié)pH至2.04.0。6 分析結果的表述6.1 PSP毒力的計算與結果表述6.1.1 PSP毒力的計算每100 g樣品中PSP的含量按公式（2）計算。 X = CMU1CFDF200 （2）式

14、中：X每100 g樣品中PSP的含量，單位為微克每百克（g /100 g）；CMU1檢測樣品受試組小鼠的中位數(shù)校正鼠單位；CF毒素轉換系數(shù)；DF稀釋倍數(shù)；200表示樣品提取液定容的體積，單位為毫升（mL）（提示：5.2.2.2操作中該定容體積為200 mL）。6.1.2 PSP毒力的結果表述若空白對照組小鼠正常，則報告待測樣品中PSP毒素含量為： g /100 g。6.2 MU毒力的計算與結果判斷6.2.1 MU毒力的計算對于取得麻痹性貝類毒素標準品有困難的實驗室，可按公式（3），使用鼠單位MU對檢驗結果進行計算。 Y = CMU1DF200 （3）式中：Y每100 g樣品的MU值，單位為鼠單

15、位每百克（MU /100 g）；CMU1檢測樣品受試組小鼠的中位數(shù)校正鼠單位；DF稀釋倍數(shù)；200表示樣品提取液定容的體積，單位為毫升（mL）（提示：5.2.2.2操作中該定容體積為200 mL）。注：檢驗結果的仲裁以6.1為準。6.2.2 MU毒力的判斷與結果表述在空白對照組小鼠正常的情況下進行如下判斷和表述：若小鼠的死亡時間大于60 min，則待測樣品的鼠單位即相當小于0.875 MU/g。若實驗組中位數(shù)死亡時間小于5 min，則應對樣品提取液進行稀釋，再選取3只小鼠進行試驗，直至得到中位數(shù)死亡時間為5 min7 min為止，根據(jù)最后的稀釋液實驗結果計算樣品的鼠單位毒力，報告該樣品的鼠單位

16、為： MU/100 g。若實驗組中位數(shù)死亡時間大于7 min，則直接計算確定樣品鼠單位毒力，報告該樣品的鼠單位為： MU/100 g。若實驗組中所有小鼠在觀察15 min內均不死亡，則也可報告該樣品的鼠單位小于400 MU/100 g。6.3 毒力單位轉換樣品中的毒力單位按公式（4）計算。CF 80g /100g = 400MU/100g （4）式中：CF毒素轉換系數(shù)；80g /100g樣品中PSP限量（g /100g）；400MU/100g樣品中PSP限量（MU/100g）。7 其他為避免毒素的危害，應戴手套進行檢驗操作。移液管等用過的器材應在5%的次氯酸鈉溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解。

17、同樣，廢棄的提取液等也應以5%次氯酸鈉溶液處理。對于動物實驗過程中產生的污水、廢棄物及動物尸體處理，應參照實驗動物 環(huán)境及設施GB 14925執(zhí)行。第二法 酶聯(lián)免疫吸附法8 原理 本方法的測定基礎是競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗反應。游離麻痹性貝類毒素與麻痹性貝類毒素酶標記物競爭麻痹性貝類毒素抗體，同時麻痹性貝類毒素抗體與捕捉抗體連接。沒有被結合的酶標記物在洗滌步驟中被除去。結合的酶標記物將無色的發(fā)色劑轉化為藍色的產物。加入反應停止液后使顏色由藍轉變?yōu)辄S色。在450 nm波長的酶標儀測量微孔溶液的吸光度值，樣品中的麻痹性貝類毒素溶液與吸光度值成反比，按繪制的校正曲線定量計算。 試劑和材料 除另有規(guī)定外

18、，所有化學試劑均為分析純，水為重蒸餾水。 0.1 mol/L鹽酸 。 5 mol/L鹽酸 。 半對數(shù)坐標紙。9.4 標準物質濃縮液：經酸化，含有20 % 乙醇作為保護液，冷藏時，無限期穩(wěn)定。9.5 酶標記物濃縮液。9.6 抗體濃縮液。9.7 基質（過氧化尿素）/發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）。9.8 反應終止液: 1 mol/L硫酸。9.9 商業(yè)化試劑盒若評價技術參數(shù)達到本標準的要求則也適合于本標準（附錄D）。10 儀器和設備 酶標儀：450 nm。 均質器。 離心機：4 3000 g。 微量加樣器：50 L，100 L，500 L， 微量多通道加樣器：50 L，100 L。分析步驟11.1 試樣制備

19、11.1.1 牡礪、蛤及貽貝 用清水將貝殼外表徹底洗凈，切斷閉殼肌，開殼，用重蒸餾水淋洗內部去除泥沙及其他外來物。將閉殼肌和連接在膠合部的組織分開，仔細取出貝肉，切勿割破肉體。開殼前不要加熱或用麻醉劑。收集約200 g肉置于篩子中瀝水5 min（不要使肉堆積），檢出碎殼等雜物，將貝肉均質。11.1.2 扇貝 取可食部分用作檢測。瀝干及均質過程同11.1.l 。11.1.3 貝類罐頭 將罐內所有內容物（肉及液體）倒入均質器充分均質。如果是大罐，將貝肉瀝水并收集瀝下的液體，分別稱重，將固形物和湯汁按比例（1:1）混合，充分均質。11.1.4 用酸保存的貝肉瀝去酸液，分別存放貝肉及酸液，將瀝干的貝肉

20、充分均質。11.1.5 冷凍貝類在室溫下，使冷凍的樣品（帶殼或脫殼的）呈半冷凍狀態(tài)，按11.1.1方法開殼、淋洗、取肉、均質。11.2 試樣的提取和凈化稱取10.0 g試樣（精確至0.1g），加入70 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液（如果樣品為較干燥的貝肉，加入140 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，稀釋系數(shù)等同），煮沸并攪拌5 min， 4 3500 g離心10 min，離心后控制pH值，用5 mol/L鹽酸溶液調節(jié)到4.0以下，取100 L上清液，用緩沖液按1：10稀釋（1+9），取50 L按11.2進行酶聯(lián)免疫測定。此時的稀釋倍數(shù)是80。高濃度的樣品，如超出標準曲線范圍，可進一步用緩

21、沖液稀釋，直至樣品濃度在標準曲線范圍以內。11.3 酶聯(lián)免疫測定將足夠數(shù)量的微孔條插入微孔架（標準液和樣液分別做復孔），記錄標準液和樣液的位置。加入6個適當?shù)穆楸孕载愵惗舅貥藴室汉蜆右焊?0 L到各微孔，加入50 L麻痹性貝類毒素酶標記物至每個微孔，輕輕混合，再加入50 L麻痹性貝類毒素抗體，徹底混合，用粘膠紙封住微孔以防溶液揮發(fā)，20-25黑暗避光處孵育15 min。將微孔架倒置在吸水紙上拍打數(shù)次，以保證完全除去微孔中的液體，每個微孔注滿重蒸餾水沖洗后拍干，再重復以上洗板操作5次。加入100 L基質/發(fā)色試劑至每個微孔中，輕拍混勻，20-25黑暗避光處孵育15 min。加入100 L反應終止

22、液至每個微孔中，輕拍混勻后，以空白調零，測量并記錄每個微孔溶液450 nm波長的吸光度值。12 分析結果的計算與表述12.1 計算百分比吸光度值計算麻痹性貝類毒素標準液和樣液的平均吸光度值，按公式（5）分別求得每個麻痹性貝類毒素標準液和樣液的百分比吸光度值： A S100%（5）S0式中：A百分比吸光度值；S6個適當?shù)穆楸孕载愵惗舅貥藴室夯驑右旱钠骄舛戎?；S00 g/kg的麻痹性貝類毒素標準液的平均吸光度值。 繪制校正曲線以百分比吸光度值（算術級）為縱坐標，以麻痹性貝類毒素溶液濃度（g/kg）（對數(shù)級）為橫坐標，繪制出麻痹性貝類毒素標準液百分比吸光度值與麻痹性貝類毒素溶液濃度的校正曲線。每

23、次試驗均應重新繪制校正曲線。12.3 結果的計算在12.2繪制的標準曲線上，讀取樣液百分比吸光度值所對應的麻痹性貝類毒素濃度即為試樣中麻痹性貝類毒素含量（g/kg）。為了獲取樣品中麻痹性貝類毒素的實際濃度（g/kg），從校正曲線上讀出的濃度值必須乘以相對應的稀釋系數(shù)。12.4 結果的表述當測定值小于50 g/kg時，則報告麻痹性貝類毒素含量為小于50 g/kg。當測定值大于等于50 g/kg時，則報告麻痹性貝類毒素實際測定值。13 其他13.1 測定低限方法的測定低限為50 g/kg。13.2 回收率方法的回收率為 90 %。13.3 健康和安全任何麻痹性貝類毒素含量值大于800 g/ kg（

24、國際慣例表示方式為80 g/ 100 g）的樣品即被認為是有害的，對人類食用不安全。標準液含有麻痹性貝類毒素，應特別小心，避免接觸。反應終止液為1 mol/L硫酸，避免接觸皮膚。第三法 高效液相色譜法14 原理試樣中的麻痹性貝類毒素用0.1 mol/L的鹽酸提取，離心后，將上清液過C18固相萃取柱凈化，再經過分子質量10 000的分子篩超濾離心管過濾，濾液用高效液相色譜進行分離，經在線柱后衍生反應后，進行熒光檢測，外標法定量。15 試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。15.1 乙腈：色譜純。15.2 無水乙酸。15.3 鹽酸：36%38%（質量

25、分數(shù)）。15.4 庚烷磺酸鈉。15.5 磷酸：85%（質量分數(shù)）。15.6 二水合高碘酸。15.7 磷酸氫二鉀。15.8 氫氧化鉀。15.9 氨水。15.10 100 mmol/L庚烷磺酸鈉溶液：稱取20.2克庚烷磺酸鈉（15.4），用水溶解定容至1 000 mL。15.11 500 mmol/L磷酸溶液：稱取49.0 g磷酸（15.5），用水溶解定容至1 000 mL。15.12 250 mmol/L磷酸氫二鉀溶液：稱取43.5 g磷酸氫二鉀（15.7），用水溶解定容至1 000 mL。15.13 1.0 mol/L氫氧化鉀溶液：稱取56.1克氫氧化鉀（15.8），用水溶解定容至1 000

26、mL。15.14 500 mmol/L高碘酸溶液：稱取114.0克二水合高碘酸（15.6），用水溶解定容至1 000 mL。15.15 1.0 mol/L乙酸溶液：稱取60.0克無水乙酸（15.2），用水溶解定容至1 000 mL。15.16 0.01 mol/L乙酸溶液：量取10.0 mL 1.0 mol/L乙酸溶液（15.15），用水稀釋定容至1 000 mL。15.17 0.1 mol/L鹽酸溶液：量取9.0 mL鹽酸（15.3），用水稀釋定容至1 000 mL。15.18 標準溶液：麻痹性貝類毒素GTX1，4、GTX2，3、dcGTX2，3、B1（GTX5）、neoSTX、STX、dc

27、STX標準溶液，避光保存于-20以下。15.19 標準儲備液：將標準溶液用0.01 mol/L乙酸溶液（15.16）稀釋成一定濃度的標準儲備液，避光保存于-20以下。15.20 混合標準溶液：分別準確吸取適量各標準儲備液，用0.01mol/L乙酸溶液（15.16）配成所需濃度的混合標準溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。15.21 流動相A：量取15.0 mL 100 mmol/L庚烷磺酸鈉溶液（15.10）、8.5 mL 500 mmol/L磷酸溶液（15.11），用約450mL水稀釋，用氨水（15.9）調pH至7.2，用水定容到500 mL，過0.45 m濾膜。15.22 流動相B：量取20.0 mL 100

28、 mmol/L庚烷磺酸鈉溶液（15.10）、45.0 mL 500 mmol/L磷酸溶液（15.11）， 用約450mL水稀釋，用氨水（15.9）調pH至7.2，用水定容到500 mL，過0.45 m濾膜。15.23 氧化液：量取10.0 mL 500 mmol/L 高碘酸（15.14）、100 mL 250 mmol/L 磷酸氫二鉀溶液（15.12），用約450mL水溶解，用1.0 mol/L 氫氧化鉀溶液（15.13）調pH至9.0，用水定容到500 mL。15.24 中和液：1.0 mol/L乙酸溶液（15.15）。15.25 C18固相萃取柱：Sep-Pak Vac C18Sep-Pa

29、k Vac C18固相萃取柱是Waters公司產品的商品名稱，給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不是表示對該產品的認可。如果其他等效產品具有相同的效果，則可使用這些等效產品。Millipore YM-10超濾離心管是Millipore公司產品的商品名稱，給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不是表示對該產品的認可。如果其他等效產品具有相同的效果，則可使用這些等效產品。Sep-Pak Vac C18固相萃取柱是Waters公司產品的商品名稱，給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不是表示對該產品的認可。如果其他等效產品具有相同的效果，則可使用這些等效產品。Millipore YM-10

30、超濾離心管是Millipore公司產品的商品名稱，給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不是表示對該產品的認可。如果其他等效產品具有相同的效果，則可使用這些等效產品。15.26 濾膜：0.45 m。16 儀器和設備16.1 高效液相色譜儀：配有熒光檢測器，柱后衍生反應裝置。16.2 離心機：轉速2000 轉/分鐘。16.3 固相萃取裝置。16.4 旋渦震蕩器。16.5 恒溫水浴鍋。16.6 超濾離心管：分子質量10 000：Millipore YM-10，0.5 mL，或相當者。16.7 PH計。16.8 具塞離心管：15 mL。16.9 刻度玻璃離心管：10 mL。17 分析步驟17.1

31、試樣制備與保存從所取全部樣品中取出有代表性樣品可食部分約500 g，充分搗碎均勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器中，密封，并標明標記。在制樣的操作過程中，應防止樣品污染或發(fā)生殘留物含量的變化。試樣置于-18以下避光保存。 17.2 試樣提取 準確稱取5 g試樣，精確至0.01 g，于15 mL具塞離心管中，加入10 mL 0.1mol/L鹽酸溶液（15.17），振蕩均勻。將離心管置于100C的沸水浴中，加熱5min，冷卻后，以5000 rpm離心10min。17.3 試樣凈化 C18固相萃取柱（15.25）使用前依次用6.0 mL甲醇和6.0 mL水活化，將7.1離心得到的上清液過柱，收集流出液

32、，用水定容至10 mL。取約1 mL收集液，于分子質量10 000的超濾離心管（16.6）中離心，濾液供液相色譜測定。17.4 儀器參考條件17.4.1 液相色譜參考條件色譜柱：Inertsil C8-3（250mm4.6mm， 5m），或相當者。色譜柱溫度：30C。流動相：流動相A（15.21），流動相B（15.22），流動相C: 乙腈（15.1）。流動相時間梯度，見表1：表1流動相時間梯度時間/min流動相A/%流動相B/%流動相C/%流速/（mL/min）0100001.020.0100001.020.5093.56.50.945.0093.56.50.945.5100001.060.0

33、100001.0柱后衍生：氧化液（4.24），中和液（4.25），反應溫度：50，反應液流速梯度見表2：表2柱后衍生反應液流速梯度單位為毫升每分鐘反應液時間0 min25 min25.5 min45 min45.5 min60 min氧化液0.40.40.80.80.40.4中和液0.40.40.80.80.40.4熒光檢測：激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長390 nm；進樣量：10 L。17.4.2 色譜測定 根據(jù)樣液中麻痹性貝類毒素的含量情況，選定峰面積相近的標準工作液。標準工作液和樣液中麻痹性貝類毒素的響應值均應在儀器檢測的線性范圍內。標準工作液和樣液等體積參插進樣測定。在上述色譜條件下，

34、標準品的色譜圖見圖E.1。17.4.3 空白實驗 除不加試樣外，均按上述測定步驟進行。17.4.4 平行試驗按以上步驟，對同一試樣進行平行試驗測定。17.4.5 回收率試驗陰性樣品中添加標準溶液，按17.2和17.3操作，測定后計算樣品添加的回收率。本標準中10種麻痹性貝類毒素添加濃度及其回收率范圍的試驗數(shù)據(jù)參見表F.1。18 分析結果的表述18.1 結果計算 樣品中各種麻痹性貝類毒素的含量按式（6）計算。 （6）式中：X 試樣中被測組分殘留量，單位為微克每千克（g/kg）；c 從標準工作曲線上得到的被測組分溶液濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V 樣品溶液定容體積，單位為毫升（mL）；m

35、 樣品溶液所代表試樣的質量，單位為克（g）。計算結果應扣除空白值。18.2 毒性轉換按照國際慣例，STX毒素的毒性因子被設為1，其他各種麻痹性毒素按照相對于STX的毒性大小來確定毒性因子（如表3所列）；樣品中麻痹性貝類毒素的含量則按照毒性因子，統(tǒng)一轉換為STXeq來表示，計算公式見式（7）： （7）式中：Xi 各種麻痹性貝類毒素的含量ri 毒性因子表3麻痹性貝類毒素毒性因子毒素GTX1GTX4GTX2GTX3dcGTX2dcGTX3GTX5（B1）neoSTXSTXdcSTX毒性因子0.990.730.360.640.650.750.060.9210.5119 精密度19.1 一般規(guī)定本部分的

36、精密度數(shù)據(jù)是按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2的規(guī)定確定的，重復性和再現(xiàn)性的值以95%的可信度來計算。19.2 重復性在重復性條件下，獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不超過重復性限r，元貝和扇貝中10種麻痹性貝類毒素的添加濃度范圍及重復性方程見表4。表4 添加濃度范圍及重復性和再現(xiàn)性方程單位：微克/千克化合物名稱添加濃度范圍樣品基質重復性限r再現(xiàn)性限RGTX416.7467元貝lgr = 0.8500 lgm - 0.8188lgR = 0.8591 lgm - 0.6088扇貝lgr = 0.8539 lgm - 0.9002lgR = 0.7293 lgm - 0.5067

37、GTX150.7507元貝lgr = 1.1306 lgm - 1.443lgR = 0.8972 lgm - 0.7528扇貝lgr = 0.969 lgm - 1.1867lgR = 0.7196 lgm - 0.5286dcGTX34.848元貝lgr = 1.1546 lgm - 1.1726lgR = 0.9646 lgm - 0.8163扇貝lgr = 1.3927 lgm - 1.7253lgR = 0.9323 lgm - 0.9648B131.9319元貝lgr = 0.8315 lgm - 0.6425lgR = 0.8174 lgm - 0.5147扇貝lgr = 0.9

38、016 lgm - 0.8929lgR = 0.7068 lgm - 0.4729dcGTX217.3173元貝lgr = 0.9312 lgm - 0.8304lgR = 0.8573 lgm - 0.6391扇貝lgr = 0.8868 lgm - 0.7943lgR = 0.7262 lgm - 0.4253GTX36.565元貝lgr = 0.922 lgm - 0.7962lgR = 0.9336 lgm - 0.7881扇貝lgr = 0.8927 lgm - 0.7661lgR = 0.8415 lgm - 0.5554GTX219.6196元貝lgr = 0.9129 lgm

39、- 0.869lgR = 1.1636 lgm - 1.177扇貝lgr = 0.8554 lgm - 0.802lgR = 0.6884 lgm - 0.4122neoSTX15.7157元貝lgr = 0.8441 lgm - 0.5777lgR = 0.8394 lgm - 0.5405扇貝lgr = 0.6535 lgm - 0.2342lgR = 0.702 lgm - 0.3294dcSTX12.5125元貝lgr = 0.9042 lgm - 0.8163lgR = 0.8585 lgm - 0.6523扇貝lgr = 0.7435 lgm - 0.5299lgR = 0.755

40、2 lgm - 0.4355STX14.5145元貝lgr = 0.8132 lgm - 0.6609lgR = 0.6211 lgm - 0.3105扇貝lgr = 0.9079 lgm - 0.8351lgR = 0.7346 lgm - 0.4503注：m為兩次測XX果的算術平均值如果差值超過重復性限，應舍棄試驗結果并重新完成兩次單個試驗的測定。19.3 再現(xiàn)性在再現(xiàn)性條件下，獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不超過再現(xiàn)性限R，元貝和扇貝中10種麻痹性貝類毒素的添加濃度范圍及再現(xiàn)性方程見表4。20 其他方法的測定低限：GTX4為16.7 g/kg；GTX1為50.7 g/kg；dcGTX3

41、為4.8 g/kg；B1為31.9 g/kg；dcGTX2為17.3 g/kg；GTX3為6.5 g/kg；GTX2為19.6 g/kg；neoSTX為15.7 g/kg；dcSTX為12.5 g/kg；STX為14.5 g/kg；合麻痹性貝類毒素總量（STXeq）為125 g/kg。第四法 液相色譜-串聯(lián)質譜法21 原理以甲酸-水溶液提取樣品中的麻痹性貝類毒素，經乙酸乙酯、氯仿液-液分配去脂、去蛋白，固相萃取柱凈化后，加乙腈除蛋白，超濾離心管過濾，液相色譜-串聯(lián)質譜檢測，外標法定量。22 試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為色譜純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。22.1 10種麻

42、痹性貝類毒素標準溶液: GTX1&4、GTX2&3、dcGTX2&3、neoSTX、STX、dcSTX、GTX5。22.2 乙酸乙酯（CH3COOCH2CH3）22.3 氯仿（CHCl3）22.4 甲酸（HCOOH）：分析純。22.5 甲酸銨（HCOONH4）：分析純。22.6 乙腈（CH3CN）22.7 甲醇（CH3OH）22.8 甲酸銨緩沖溶液（5 mmol/L）：稱取0.315 g甲酸銨，加入5 mL甲酸，用水溶解并稀釋至1000 mL。22.9 甲酸溶液（0.5%）：量取500 L甲酸，用水稀釋至100 mL。22.10 酸化乙腈（0.5%）：量取5 mL甲酸，用乙腈稀釋至1000 m

43、L。22.11 空白樣品基質液：空白樣品基質液的制備同24.2和24.322.12 HLB固相萃取柱：60 mg/3 mL，使用前預先用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL甲酸溶液（3.9）活化。22.13 超濾離心管：4 mL，10KD。22.14 混合標準中間溶液：根據(jù)貝類毒素各組分的濃度，準確移取適量各組分標準溶液，用水稀釋配成GTX4、GTX3、dcGTX3、STX、dcSTX濃度為500 ng/mL，neoSTX、GTX5濃度為1.0 g/mL，GTX1濃度為1.5 g/mL、GTX2濃度為1.3 g/mL、dcGTX2濃度為2.2 g/mL的混合標準中間液，4 避光保存，有效期3個月

44、。23 儀器和設備23.1 液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜儀：配電噴霧（ESI）離子源。23.2 天平：感量為 0.0001 g和0.01 g。23.3 高速冷凍離心機：10000 r/min。23.4 離心機：4000 r/min。23.5 超聲波清洗器。23.6 旋渦混勻器。23.7 均質器。23.8 氮吹儀。23.9 固相萃取裝置24 分析步驟24.1 試樣制備 用水將貝殼外表洗凈。撬開貝殼，切斷閉殼肌，用水淋洗，去除內部泥沙及其它異物，仔細取出貝肉，切勿割破貝體，在篩子上平鋪瀝水5 min，然后將貝肉均質、混勻。24.2 提取 稱取試樣（50.05）g，置于50 mL塑料離心管中，加入5

45、 mL 0.5%甲酸溶液（3.9），渦旋混勻1 min，4000 r/min離心10 min，取上清液至另一50 mL塑料離心管中，殘渣中再加入4.5 mL 0.5%甲酸溶液按上述方法重復提取2次，上清液合并至50 mL塑料離心管中，用0.5% 甲酸溶液定容至15 mL，混勻后待凈化。24.3 凈化 向所得提取液中加入20 mL乙酸乙酯，渦旋混勻后， 10000 r/min離心10 min，棄去上層溶液；再向提取液中加入20 mL氯仿，渦旋混勻后，10000 r/min離心10 min；取3 mL上層溶液加入已活化的固相萃取柱中，過柱速度控制在每秒1滴，接流出液至10 mL刻度離心管中，用0.

46、5% 甲酸溶液淋洗柱子，收集流出液至3.5 mL。向流出液中加入4.5 mL乙腈，放置5 min 后混勻， 10000 r/min離心10 min，取1 mL上清液至超濾離心管中，10000 r/min離心10 min，所得濾液供液相色譜-串聯(lián)質譜測定。24.4 儀器分析條件24.4.1 液相色譜參考條件色譜柱TSK-Gel Amide-80，2.0 mm250 mm，5 m，或性能相當者；流動相：A：甲酸銨緩沖溶液（3.8），B：酸化乙腈（3.10），梯度洗脫條件見表5；流速：0.25 mL/min；柱溫：30 ；進樣量：20 L；樣品盤溫度：5 。 表5 流動相梯度洗脫條件時 間/（min

47、）B/酸化乙腈（%）A/甲酸銨溶液（%）0.070303.070303.1604016.0604019.069423.069427.0703035.07030 24.4.2 質譜參考條件離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測；噴霧電壓：4500 V；離子傳輸毛細管溫度：300 ；錐孔電壓：-10 V；霧化氣流速：11.7 L/ min；輔助氣流速：1.7 L/ min；碰撞氣壓力：1.5 mTorr；母離子、子離子和碰撞能量見表6。 表6 10種麻痹性貝類毒素母離子、子離子和碰撞能量目標化合物母離子/m/z子離子/m/z碰撞能量/eVGTX2396.1316.1*20

48、298.025GTX3396.1298.1*19316.113GTX1412.1332.1*19313.913GTX4412.1313.9*23332.119GTX5380.1300.1*7282.115neoSTX316.1298.0*20220.025STX300.1204.0*21282.022dcSTX257.1221.9*21126.022dcGTX2353.3254.9*18272.918dcGTX3353.3272.9*18254.918注：*為定量離子24.5 基質標準曲線的制作 分別取一定量混合標準中間液，氮氣吹干后，用空白樣品基質液配制系列基質標準工作液。標準工作液中GTX

49、1、GTX 4、GTX2、GTX 3、dcGTX2、dcGTX 3、STX和dcSTX濃度范圍為5 ng/mL100 ng/mL，neoSTX和GTX5 濃度范圍10 ng/mL200 ng/mL，供液相色譜-串聯(lián)質譜測定。以麻痹性貝類毒素的峰面積為縱坐標，以相應的濃度為橫坐標，繪制基質標準曲線，求回歸方程和相關系數(shù)。 24.6測定24.6.1 定性測定在相同測試條件下測定標準溶液和樣品溶液，樣品溶液中麻痹性貝類毒素的保留時間與標準工作液中麻痹性貝類毒素的保留時間的比值，偏差應在5% 以內。且檢測到的離子的相對豐度，應當與濃度接近的標準溶液中離子的相對豐度一致，其偏差應符合表7規(guī)定的范圍，則可

50、判定試樣中存在被測化合物。表7 定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度50%20%至50%10%至20%10%允許的相對偏差20%25%30%50%24.6.2 定量測定取待測樣品溶液和相應的基質標準溶液等體積進樣測定，按外標法以標準曲線對樣品進行定量。標準溶液及待測樣品溶液中麻痹性貝類毒素的響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內。標準溶液、空白溶液和標準添加溶液中麻痹性貝類毒素特征離子流圖參見附錄G。25 空白試驗除不加試樣外，均按上述測定步驟進行。26 結果計算和表述樣品中麻痹性貝類毒素的含量按公式（8）計算，計算結果需扣除空白值，結果保留三位有效數(shù)字。 （8）式中：Xi樣品中麻痹性

51、貝類毒素的含量，單位為微克每千克（g/kg）；Ci從標準工作曲線得到的試樣溶液中麻痹性貝類毒素的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V樣品最終定容體積，單位為毫升（mL）；f稀釋倍數(shù)；m試樣質量，單位為克（g）。按照國際慣例，STX毒素的毒性因子設為1，其他各種麻痹性貝類毒素按照相對于STX的毒性大小確定的毒性因子見表8。樣品中麻痹性貝類毒素的含量則按照毒性因子，統(tǒng)一轉換為STXeq.來表示，轉換公式見式（9）： STXeq = （9）式中： Xi 各種麻痹性貝類毒素的含量，單位為微克每千克（g/kg） ri 毒性因子表8 麻痹性貝類毒素的毒性因子毒素GTX1GTX4GTX2GTX3dcGT

52、X2dcGTX3GTX5neoSTXSTXdcSTX毒性因子0.990.730.360.640.650.750.060.9210.5127 方法靈敏度本方法GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、dcGTX2、dcGTX3、STX和dcSTX 檢出限為25 g/kg，定量限為50 g/kg；GTX5和neoSTX 檢出限為50 g/kg，定量限為100 g/kg。10種麻痹性貝類毒素在定量限下按毒性因子轉換后相當于379.5 g/kg的STX。28 準確度本方法麻痹性貝類毒素添加濃度為50 g/kg600 g/kg時，回收率為70 %120 %。29 精密度本方法批內相對標準偏差15 %，批間

53、相對標準偏差15 %。附 錄A麻痹性貝類毒素死亡時間 鼠單位的關系麻痹性貝類毒素死亡時間-鼠單位的關系見表A.1。表A.1 麻痹性貝類毒素死亡時間 鼠單位的關系時間 鼠單位（分秒） （MU）時間 鼠單位（分秒） （MU）1：00 1001：10 66.21：15 38.31：20 26.41：25 20.71：30 16.51：35 13.91：40 11.91：45 10.41：50 9.331：55 8.422：00 7.672：05 7.042：10 6.522：15 6.062：20 5.662：25 5.322：30 5.002：35 4.732：40 4.482：45 4.262：

54、50 4.062：55 3.883：00 3.703：05 3.573：10 3.433：15 3.313：20 3.193：25 3.083：30 2.983：35 2.883：40 2.793：45 2.713：50 2.633：55 2.564：00 2.504：05 2.444：10 2.384：15 2.324：20 2.264：25 2.214：30 2.164：35 2.124：40 2.084：45 2.044：50 2.004：55 1.965：00 1.925：05 1.895：10 1.865：15 1.835：20 1.805：30 1.745：40 1.695：45

55、1.675：50 1.646：00 1.606：15 1.546：30 1.486：45 1.437：00 1.397：15 1.357：30 1.317：45 1.288：00 1.258：15 1.228：30 1.208：45 1.189：00 1.169：30 1.1310：00 1.1110：30 1.0911：00 1.07511：30 1.0612：00 1.0513：00 1.0314：00 1.01515：00 1.00016：00 0.9917：00 0.9818：00 0.97219：00 0.96520：00 0.9621：00 0.95422：00 0.94823：0

56、0 0.94224：00 0.93725：00 0.93430：00 0.91740：00 0.89860：00 0.875附 錄B小鼠體重校正表 小鼠體重校正系數(shù)見表B.1。表B.1 小鼠體重校正表 小鼠體重，g 校正系數(shù)1010.51111.51212.51313.51414.51515.51616.51717.51818.51919.52020.52121.52222.5230.500.530.560.590.620.650.6750.700.730.760.7850.810.840.860.880.9050.930.950.970.9851.0001.0151.031.041.051.061.07附 錄CICR小鼠的定義C.1 ICR小鼠的定義ICR小鼠是Hauschka用Swiss小鼠群以多產為目標，進行選育，以后美國癌癥研究所（InstituteofCance