貝類中麻痹性貝類毒素的測定 標(biāo)準(zhǔn)文本（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)）

1、 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)貝類中麻痹性貝類毒素的測定范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于貝類及其制品中麻痹性貝類毒素的測定。第一法為小鼠生物法，適用于麻痹性貝類毒素的總量測定；第二法為酶聯(lián)免疫吸附法，適用于麻痹性貝類毒素的篩查檢測；第三法為高效液相色譜法，適用于麻痹性貝類毒素總量（STXeq），以及GTX4、GTX1、dcGTX3、B1、dcGTX2、GTX3、GTX2、neoSTX、dcSTX、STX等組分含量的常規(guī)檢測；第四法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定法，適用于GTX1、GTX 4、GTX2、GTX 3、dcGTX2、dcGTX 3、neoSTX、STX、dcSTX、GTX5等10種麻痹性貝類毒素組分含量的測定及確證。

2、第一法 小鼠生物法原理方法采用小鼠生物法對(duì)PSP予以定量。根據(jù)小鼠腹腔注射貝類提取液后的死亡時(shí)間，查出鼠單位，并按小鼠體重，校正鼠單位（corrected mouse unit，CMU），計(jì)算確定每100 g樣品中PSP的鼠單位。以石房蛤毒素作為標(biāo)準(zhǔn)，將鼠單位換算成毒素的微克數(shù)，計(jì)算確定每100 g貝肉內(nèi)的PSP微克數(shù)。所測XX果代表存在于貝肉內(nèi)各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的PSP毒素總量。試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。3.1 氫氧化鈉（NaOH）：將4.0 g 氫氧化鈉（NaOH）溶于1 L蒸餾水中。3.2 鹽酸（HCl）：分析純。3.2.1 鹽酸溶液

3、（0.18 mol/L）：將15 mL濃鹽酸（HCL）用蒸餾水稀釋至1 L。3.2.2 鹽酸溶液（5 mol/L）：將41.7 mL濃鹽酸用蒸餾水稀釋至100 mL。3.3 無水乙醇（CH3CH2OH）：分析純。3.4 石房蛤毒素標(biāo)準(zhǔn)品（Saxitoxin，STX， C10H17N7O42HCl）：純度98.0。3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制3.5.1 石房蛤毒素貯備液（100 g/mL）：用蒸餾水配制20（v/v）的乙醇溶液，用5 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH到2.04.0之間，備用。精確稱取STX標(biāo)準(zhǔn)品，用上述溶液定容至STX濃度為（100 g/mL）。3.5.2 石房蛤毒素工作液（1 g/mL）：準(zhǔn)確

4、吸取1 mL石房蛤毒素貯備液，用蒸餾水稀釋，調(diào)節(jié)pH在2.04.0之間，定容至100 mL，該標(biāo)準(zhǔn)工作液可在34下穩(wěn)定30天。3.6 小鼠：體重為19 g21 g的健康ICR系雄性小鼠。若小鼠重量21 g，則根據(jù)附錄B表B.1得到小鼠體重校正系數(shù)。儀器和設(shè)備4.1 均質(zhì)器。4.2 電爐。4.3 天平：感量0.1 g，0.0001 g。4.4 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速2000 轉(zhuǎn)/分鐘。4.5 pH計(jì)或pH試紙。4.6 一次性注射器：1 mL。5 分析步驟5.1 試樣制備 5.1.1 樣品采集及保存5.1.1.1 分析樣品要有充分的代表性，應(yīng)從足量（一般應(yīng)2 kg以上）的混合樣品中挑選良好的貝類去殼，用于分

5、析的去殼肉量應(yīng)達(dá)200 g以上。5.1.1.2 不能及時(shí)送檢的新鮮貝類，按5.1.2方法將貝肉分離，將瀝水后的200 g貝肉放入0.18 mol/L、200 mL的鹽酸溶液中，置4冷藏保存，備檢。5.1.2 樣品制備5.1.2.1 牡蠣、蛤及貽貝用清水將貝殼外表徹底洗凈，切斷閉殼肌，開殼，用蒸餾水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他異物。將閉殼肌和連接在膠合部的組織分開，仔細(xì)取出貝肉，切勿割破貝體。嚴(yán)禁加熱或用麻醉劑開殼。收集約200 g肉分散置于篩子中瀝水5 min（不要使肉堆積），檢出碎殼等雜物，將貝肉粉碎備用。5.1.2.2 扇貝取可食部分用作檢測，過程同5.1.2.1。5.1.2.3 冷凍貝類在室溫

6、下，使冷凍的樣品（帶殼或脫殼的）自然融化，按5.1.2.1方法開殼、淋洗、取肉、粉碎、備用。5.1.2.4 貝類罐頭將罐內(nèi)所有內(nèi)容物（肉及液體）倒入均質(zhì)器中充分均質(zhì)。如果是大罐，將貝肉瀝水并收集瀝下的液體分別稱重并存放固形物和湯汁，將固形物和湯汁按原罐裝比例混合，均質(zhì)后備用。5.1.2.5 用酸保存的貝肉瀝去酸液，分別存放貝肉及酸液，備用。5.1.2.6 貝肉干制品干制品可于等體積0.18 mol/L 鹽酸溶液中浸泡24 h48 h（4冷藏），按5.1.2.4方法瀝干，分別存放貝肉和酸液備用。5.2 測定步驟5.2.1 PSP標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照試驗(yàn)5.2.1.1 PSP標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制用10 mL、1

7、5 mL、20 mL、25 mL和30 mL的蒸餾水分別稀釋1 g/mL的石房蛤毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液10 mL，配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。5.2.1.2 中位數(shù)死亡時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)液選擇取按5.2.1.1配制的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液各1 mL，腹腔注射小鼠數(shù)只，選擇中位數(shù)死亡時(shí)間為5 min7 min的濃度劑量。如某濃度稀釋液已達(dá)到要求，還需以1 mL蒸餾水的增減量進(jìn)行補(bǔ)充稀釋試驗(yàn)。例如：用25 mL蒸餾水稀釋的10 mL標(biāo)準(zhǔn)液在5 min7 min殺死小鼠，還需進(jìn)行24 mL10 mL和26 mL10mL稀釋度的試驗(yàn)。每只小鼠試驗(yàn)前稱重，以10只小鼠為一組，用中位數(shù)死亡時(shí)間在5 min7 min范圍內(nèi)的

8、二個(gè)濃度含量的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液注射小鼠，測定并記錄每只小鼠腹腔注射完畢至停止呼吸的所需死亡時(shí)間。5.2.1.3 毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)（conversion factor ，CF）的計(jì)算5.2.1.3.1 小鼠中位數(shù)死亡時(shí)間的選擇計(jì)算所選擇濃度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液受試組中位數(shù)死亡時(shí)間。棄去中位數(shù)死亡時(shí)間小于5 min或大于7 min的受試組；選擇中位數(shù)死亡時(shí)間在5 min7 min的受試組，該受試組中可有個(gè)別小鼠的死亡時(shí)間可小于5 min或大于7 min。5.2.1.3.2 校正鼠單位（CMU）的計(jì)算對(duì)于所選定的中位數(shù)死亡時(shí)間為5 min7 min的受試組，根據(jù)附錄A查得組中每只小鼠死亡時(shí)間所對(duì)應(yīng)的鼠單位（MU），再

9、根據(jù)附錄B查得組中每只小鼠體重所對(duì)應(yīng)的體重校正系數(shù)，同一只小鼠的體重校正系數(shù)與鼠單位相乘得該只受試小鼠的校正鼠單位（CMU）。5.2.1.3.3 毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)（CF）的計(jì)算對(duì)于選定的受試組，用該受試組所選稀釋液每毫升實(shí)際毒素含量的微克數(shù)（以石房蛤毒素為例計(jì)算），除以受試組中每只小鼠的CMU值，得到單只小鼠的毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)（CF），計(jì)算見公式（1），再計(jì)算每組10只小鼠的平均CF值，即為組內(nèi)毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)。 CF C （1）CMU式中：CF毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)；C每毫升STX實(shí)際毒素含量，單位為微克每毫升（g/mL）；CMU校正鼠單位。5.2.1.3.4 組間毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)（CF）的計(jì)算取不同受試組組內(nèi)毒素轉(zhuǎn)

10、換系數(shù)的平均值，即為組間毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)。以組間毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)進(jìn)行8.2中檢測樣品的毒力計(jì)算。5.2.1.3.5 CF值定期檢查如PSP檢測間隔時(shí)間較長，每次測定時(shí)要用適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)稀釋液注射5只小鼠，重新測定CF值。如果一周有幾次檢測，則用中位數(shù)死亡時(shí)間5 min7 min的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液每周檢查一次，測得的CF值應(yīng)在原測定CF值的20范圍內(nèi)。若結(jié)果不符，用同樣的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液另外注射5只小鼠，綜合先前注射的5只小鼠結(jié)果，算出CF值。并用同樣的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液注射第二組10只小鼠，將第二組求出的CF值和第一組的CF值進(jìn)行平均，即為一個(gè)新的CF值。重復(fù)檢查的CF值通常在原結(jié)果的20之內(nèi)，若經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有較大偏差，在進(jìn)行常

11、規(guī)檢測前應(yīng)調(diào)查該方法中是否存在未控制或未意識(shí)到的可變因素。5.2.2 試樣提取5.2.2.1 取100 g按5.1.2.1、5.1.2.2、5.1.2.3、5.1.2.4處理的樣品于800 mL燒杯中，加0.18 mol/L 鹽酸溶液100 mL充分?jǐn)嚢?，均質(zhì)，調(diào)整pH在2.04.0范圍內(nèi)；按5.1.2.5或5.1.2.6和5.1.1.2處理的樣品，取100 g貝肉，加入相應(yīng)的酸液100 mL，調(diào)pH為2.04.0后均質(zhì)。必要時(shí)，可逐滴加入5 mol/L 鹽酸溶液或0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)整pH，加堿時(shí)速度要慢，同時(shí)需不斷攪拌，防止局部堿化破壞毒素。5.2.2.2 將混合物加熱煮沸5

12、 min，冷卻至室溫，將混合物移至量筒中并稀釋至200 mL，調(diào)節(jié)pH至2.04.0（pH值切勿4.5）。5.2.2.3將混合物倒回?zé)瑪嚢杈鶆?，自然沉降至上清液呈半透明狀，不堵塞注射針頭即可，必要時(shí)將混合物或上清液以3000 r/min離心5 min，或用濾紙過濾。收集上清液備用。5.2.3 小鼠試驗(yàn)5.2.3.1 取19.0 g 21.0 g健康ICR雄性小鼠6只，稱重并記錄重量。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組（0.18 mol/L 鹽酸）兩組，每組三只。5.2.3.2 對(duì)每只試驗(yàn)小鼠腹腔注射1 mL提取液或空白對(duì)照液。注射過程中若有一滴以上提取液溢出，須將該只小鼠丟棄，并重新注射一只小鼠。

13、5.2.3.3 記錄注射完畢時(shí)間，仔細(xì)觀察并記錄小鼠停止呼吸時(shí)的死亡時(shí)間（到小鼠呼出最后一口氣止）。 5.2.3.4 若注射樣品原液后，1只或2只小鼠的死亡時(shí)間大于7 min，則需再注射至少三只小鼠以確定樣品的毒力。5.2.3.5 若小鼠的死亡時(shí)間小于5 min，則要稀釋樣品提取液后，再注射另一組小鼠（3只），直至得到5 min7 min的死亡時(shí)間；稀釋提取液時(shí)，要逐滴加入0.18 mol/L鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH至2.04.0。6 分析結(jié)果的表述6.1 PSP毒力的計(jì)算與結(jié)果表述6.1.1 PSP毒力的計(jì)算每100 g樣品中PSP的含量按公式（2）計(jì)算。 X = CMU1CFDF200 （2）式

14、中：X每100 g樣品中PSP的含量，單位為微克每百克（g /100 g）；CMU1檢測樣品受試組小鼠的中位數(shù)校正鼠單位；CF毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)；DF稀釋倍數(shù)；200表示樣品提取液定容的體積，單位為毫升（mL）（提示：5.2.2.2操作中該定容體積為200 mL）。6.1.2 PSP毒力的結(jié)果表述若空白對(duì)照組小鼠正常，則報(bào)告待測樣品中PSP毒素含量為： g /100 g。6.2 MU毒力的計(jì)算與結(jié)果判斷6.2.1 MU毒力的計(jì)算對(duì)于取得麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)品有困難的實(shí)驗(yàn)室，可按公式（3），使用鼠單位MU對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。 Y = CMU1DF200 （3）式中：Y每100 g樣品的MU值，單位為鼠單

15、位每百克（MU /100 g）；CMU1檢測樣品受試組小鼠的中位數(shù)校正鼠單位；DF稀釋倍數(shù)；200表示樣品提取液定容的體積，單位為毫升（mL）（提示：5.2.2.2操作中該定容體積為200 mL）。注：檢驗(yàn)結(jié)果的仲裁以6.1為準(zhǔn)。6.2.2 MU毒力的判斷與結(jié)果表述在空白對(duì)照組小鼠正常的情況下進(jìn)行如下判斷和表述：若小鼠的死亡時(shí)間大于60 min，則待測樣品的鼠單位即相當(dāng)小于0.875 MU/g。若實(shí)驗(yàn)組中位數(shù)死亡時(shí)間小于5 min，則應(yīng)對(duì)樣品提取液進(jìn)行稀釋，再選取3只小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，直至得到中位數(shù)死亡時(shí)間為5 min7 min為止，根據(jù)最后的稀釋液實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算樣品的鼠單位毒力，報(bào)告該樣品的鼠單位

16、為： MU/100 g。若實(shí)驗(yàn)組中位數(shù)死亡時(shí)間大于7 min，則直接計(jì)算確定樣品鼠單位毒力，報(bào)告該樣品的鼠單位為： MU/100 g。若實(shí)驗(yàn)組中所有小鼠在觀察15 min內(nèi)均不死亡，則也可報(bào)告該樣品的鼠單位小于400 MU/100 g。6.3 毒力單位轉(zhuǎn)換樣品中的毒力單位按公式（4）計(jì)算。CF 80g /100g = 400MU/100g （4）式中：CF毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)；80g /100g樣品中PSP限量（g /100g）；400MU/100g樣品中PSP限量（MU/100g）。7 其他為避免毒素的危害，應(yīng)戴手套進(jìn)行檢驗(yàn)操作。移液管等用過的器材應(yīng)在5%的次氯酸鈉溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解。

17、同樣，廢棄的提取液等也應(yīng)以5%次氯酸鈉溶液處理。對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的污水、廢棄物及動(dòng)物尸體處理，應(yīng)參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施GB 14925執(zhí)行。第二法 酶聯(lián)免疫吸附法8 原理 本方法的測定基礎(chǔ)是競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)反應(yīng)。游離麻痹性貝類毒素與麻痹性貝類毒素酶標(biāo)記物競爭麻痹性貝類毒素抗體，同時(shí)麻痹性貝類毒素抗體與捕捉抗體連接。沒有被結(jié)合的酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450 nm波長的酶標(biāo)儀測量微孔溶液的吸光度值，樣品中的麻痹性貝類毒素溶液與吸光度值成反比，按繪制的校正曲線定量計(jì)算。 試劑和材料 除另有規(guī)定外

18、，所有化學(xué)試劑均為分析純，水為重蒸餾水。 0.1 mol/L鹽酸 。 5 mol/L鹽酸 。 半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙。9.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃縮液：經(jīng)酸化，含有20 % 乙醇作為保護(hù)液，冷藏時(shí)，無限期穩(wěn)定。9.5 酶標(biāo)記物濃縮液。9.6 抗體濃縮液。9.7 基質(zhì)（過氧化尿素）/發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）。9.8 反應(yīng)終止液: 1 mol/L硫酸。9.9 商業(yè)化試劑盒若評(píng)價(jià)技術(shù)參數(shù)達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的要求則也適合于本標(biāo)準(zhǔn)（附錄D）。10 儀器和設(shè)備 酶標(biāo)儀：450 nm。 均質(zhì)器。 離心機(jī)：4 3000 g。 微量加樣器：50 L，100 L，500 L， 微量多通道加樣器：50 L，100 L。分析步驟11.1 試樣制備

19、11.1.1 牡礪、蛤及貽貝 用清水將貝殼外表徹底洗凈，切斷閉殼肌，開殼，用重蒸餾水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來物。將閉殼肌和連接在膠合部的組織分開，仔細(xì)取出貝肉，切勿割破肉體。開殼前不要加熱或用麻醉劑。收集約200 g肉置于篩子中瀝水5 min（不要使肉堆積），檢出碎殼等雜物，將貝肉均質(zhì)。11.1.2 扇貝 取可食部分用作檢測。瀝干及均質(zhì)過程同11.1.l 。11.1.3 貝類罐頭 將罐內(nèi)所有內(nèi)容物（肉及液體）倒入均質(zhì)器充分均質(zhì)。如果是大罐，將貝肉瀝水并收集瀝下的液體，分別稱重，將固形物和湯汁按比例（1:1）混合，充分均質(zhì)。11.1.4 用酸保存的貝肉瀝去酸液，分別存放貝肉及酸液，將瀝干的貝肉

20、充分均質(zhì)。11.1.5 冷凍貝類在室溫下，使冷凍的樣品（帶殼或脫殼的）呈半冷凍狀態(tài)，按11.1.1方法開殼、淋洗、取肉、均質(zhì)。11.2 試樣的提取和凈化稱取10.0 g試樣（精確至0.1g），加入70 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液（如果樣品為較干燥的貝肉，加入140 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，稀釋系數(shù)等同），煮沸并攪拌5 min， 4 3500 g離心10 min，離心后控制pH值，用5 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)到4.0以下，取100 L上清液，用緩沖液按1：10稀釋（1+9），取50 L按11.2進(jìn)行酶聯(lián)免疫測定。此時(shí)的稀釋倍數(shù)是80。高濃度的樣品，如超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，可進(jìn)一步用緩

21、沖液稀釋，直至樣品濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍以內(nèi)。11.3 酶聯(lián)免疫測定將足夠數(shù)量的微孔條插入微孔架（標(biāo)準(zhǔn)液和樣液分別做復(fù)孔），記錄標(biāo)準(zhǔn)液和樣液的位置。加入6個(gè)適當(dāng)?shù)穆楸孕载愵惗舅貥?biāo)準(zhǔn)液和樣液各50 L到各微孔，加入50 L麻痹性貝類毒素酶標(biāo)記物至每個(gè)微孔，輕輕混合，再加入50 L麻痹性貝類毒素抗體，徹底混合，用粘膠紙封住微孔以防溶液揮發(fā)，20-25黑暗避光處孵育15 min。將微孔架倒置在吸水紙上拍打數(shù)次，以保證完全除去微孔中的液體，每個(gè)微孔注滿重蒸餾水沖洗后拍干，再重復(fù)以上洗板操作5次。加入100 L基質(zhì)/發(fā)色試劑至每個(gè)微孔中，輕拍混勻，20-25黑暗避光處孵育15 min。加入100 L反應(yīng)終止

22、液至每個(gè)微孔中，輕拍混勻后，以空白調(diào)零，測量并記錄每個(gè)微孔溶液450 nm波長的吸光度值。12 分析結(jié)果的計(jì)算與表述12.1 計(jì)算百分比吸光度值計(jì)算麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)液和樣液的平均吸光度值，按公式（5）分別求得每個(gè)麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)液和樣液的百分比吸光度值： A S100%（5）S0式中：A百分比吸光度值；S6個(gè)適當(dāng)?shù)穆楸孕载愵惗舅貥?biāo)準(zhǔn)液或樣液的平均吸光度值；S00 g/kg的麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)液的平均吸光度值。 繪制校正曲線以百分比吸光度值（算術(shù)級(jí)）為縱坐標(biāo)，以麻痹性貝類毒素溶液濃度（g/kg）（對(duì)數(shù)級(jí)）為橫坐標(biāo)，繪制出麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)液百分比吸光度值與麻痹性貝類毒素溶液濃度的校正曲線。每

23、次試驗(yàn)均應(yīng)重新繪制校正曲線。12.3 結(jié)果的計(jì)算在12.2繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上，讀取樣液百分比吸光度值所對(duì)應(yīng)的麻痹性貝類毒素濃度即為試樣中麻痹性貝類毒素含量（g/kg）。為了獲取樣品中麻痹性貝類毒素的實(shí)際濃度（g/kg），從校正曲線上讀出的濃度值必須乘以相對(duì)應(yīng)的稀釋系數(shù)。12.4 結(jié)果的表述當(dāng)測定值小于50 g/kg時(shí)，則報(bào)告麻痹性貝類毒素含量為小于50 g/kg。當(dāng)測定值大于等于50 g/kg時(shí)，則報(bào)告麻痹性貝類毒素實(shí)際測定值。13 其他13.1 測定低限方法的測定低限為50 g/kg。13.2 回收率方法的回收率為 90 %。13.3 健康和安全任何麻痹性貝類毒素含量值大于800 g/ kg（

24、國際慣例表示方式為80 g/ 100 g）的樣品即被認(rèn)為是有害的，對(duì)人類食用不安全。標(biāo)準(zhǔn)液含有麻痹性貝類毒素，應(yīng)特別小心，避免接觸。反應(yīng)終止液為1 mol/L硫酸，避免接觸皮膚。第三法 高效液相色譜法14 原理試樣中的麻痹性貝類毒素用0.1 mol/L的鹽酸提取，離心后，將上清液過C18固相萃取柱凈化，再經(jīng)過分子質(zhì)量10 000的分子篩超濾離心管過濾，濾液用高效液相色譜進(jìn)行分離，經(jīng)在線柱后衍生反應(yīng)后，進(jìn)行熒光檢測，外標(biāo)法定量。15 試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。15.1 乙腈：色譜純。15.2 無水乙酸。15.3 鹽酸：36%38%（質(zhì)量

25、分?jǐn)?shù)）。15.4 庚烷磺酸鈉。15.5 磷酸：85%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。15.6 二水合高碘酸。15.7 磷酸氫二鉀。15.8 氫氧化鉀。15.9 氨水。15.10 100 mmol/L庚烷磺酸鈉溶液：稱取20.2克庚烷磺酸鈉（15.4），用水溶解定容至1 000 mL。15.11 500 mmol/L磷酸溶液：稱取49.0 g磷酸（15.5），用水溶解定容至1 000 mL。15.12 250 mmol/L磷酸氫二鉀溶液：稱取43.5 g磷酸氫二鉀（15.7），用水溶解定容至1 000 mL。15.13 1.0 mol/L氫氧化鉀溶液：稱取56.1克氫氧化鉀（15.8），用水溶解定容至1 000

26、mL。15.14 500 mmol/L高碘酸溶液：稱取114.0克二水合高碘酸（15.6），用水溶解定容至1 000 mL。15.15 1.0 mol/L乙酸溶液：稱取60.0克無水乙酸（15.2），用水溶解定容至1 000 mL。15.16 0.01 mol/L乙酸溶液：量取10.0 mL 1.0 mol/L乙酸溶液（15.15），用水稀釋定容至1 000 mL。15.17 0.1 mol/L鹽酸溶液：量取9.0 mL鹽酸（15.3），用水稀釋定容至1 000 mL。15.18 標(biāo)準(zhǔn)溶液：麻痹性貝類毒素GTX1，4、GTX2，3、dcGTX2，3、B1（GTX5）、neoSTX、STX、dc

27、STX標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光保存于-20以下。15.19 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：將標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.01 mol/L乙酸溶液（15.16）稀釋成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存于-20以下。15.20 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確吸取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.01mol/L乙酸溶液（15.16）配成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。15.21 流動(dòng)相A：量取15.0 mL 100 mmol/L庚烷磺酸鈉溶液（15.10）、8.5 mL 500 mmol/L磷酸溶液（15.11），用約450mL水稀釋，用氨水（15.9）調(diào)pH至7.2，用水定容到500 mL，過0.45 m濾膜。15.22 流動(dòng)相B：量取20.0 mL 100

28、 mmol/L庚烷磺酸鈉溶液（15.10）、45.0 mL 500 mmol/L磷酸溶液（15.11）， 用約450mL水稀釋，用氨水（15.9）調(diào)pH至7.2，用水定容到500 mL，過0.45 m濾膜。15.23 氧化液：量取10.0 mL 500 mmol/L 高碘酸（15.14）、100 mL 250 mmol/L 磷酸氫二鉀溶液（15.12），用約450mL水溶解，用1.0 mol/L 氫氧化鉀溶液（15.13）調(diào)pH至9.0，用水定容到500 mL。15.24 中和液：1.0 mol/L乙酸溶液（15.15）。15.25 C18固相萃取柱：Sep-Pak Vac C18Sep-Pa

29、k Vac C18固相萃取柱是Waters公司產(chǎn)品的商品名稱，給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不是表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。Millipore YM-10超濾離心管是Millipore公司產(chǎn)品的商品名稱，給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不是表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。Sep-Pak Vac C18固相萃取柱是Waters公司產(chǎn)品的商品名稱，給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不是表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。Millipore YM-10

30、超濾離心管是Millipore公司產(chǎn)品的商品名稱，給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不是表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。15.26 濾膜：0.45 m。16 儀器和設(shè)備16.1 高效液相色譜儀：配有熒光檢測器，柱后衍生反應(yīng)裝置。16.2 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速2000 轉(zhuǎn)/分鐘。16.3 固相萃取裝置。16.4 旋渦震蕩器。16.5 恒溫水浴鍋。16.6 超濾離心管：分子質(zhì)量10 000：Millipore YM-10，0.5 mL，或相當(dāng)者。16.7 PH計(jì)。16.8 具塞離心管：15 mL。16.9 刻度玻璃離心管：10 mL。17 分析步驟17.1

31、試樣制備與保存從所取全部樣品中取出有代表性樣品可食部分約500 g，充分搗碎均勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記。在制樣的操作過程中，應(yīng)防止樣品污染或發(fā)生殘留物含量的變化。試樣置于-18以下避光保存。 17.2 試樣提取 準(zhǔn)確稱取5 g試樣，精確至0.01 g，于15 mL具塞離心管中，加入10 mL 0.1mol/L鹽酸溶液（15.17），振蕩均勻。將離心管置于100C的沸水浴中，加熱5min，冷卻后，以5000 rpm離心10min。17.3 試樣凈化 C18固相萃取柱（15.25）使用前依次用6.0 mL甲醇和6.0 mL水活化，將7.1離心得到的上清液過柱，收集流出液

32、，用水定容至10 mL。取約1 mL收集液，于分子質(zhì)量10 000的超濾離心管（16.6）中離心，濾液供液相色譜測定。17.4 儀器參考條件17.4.1 液相色譜參考條件色譜柱：Inertsil C8-3（250mm4.6mm， 5m），或相當(dāng)者。色譜柱溫度：30C。流動(dòng)相：流動(dòng)相A（15.21），流動(dòng)相B（15.22），流動(dòng)相C: 乙腈（15.1）。流動(dòng)相時(shí)間梯度，見表1：表1流動(dòng)相時(shí)間梯度時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/%流動(dòng)相C/%流速/（mL/min）0100001.020.0100001.020.5093.56.50.945.0093.56.50.945.5100001.060.0

33、100001.0柱后衍生：氧化液（4.24），中和液（4.25），反應(yīng)溫度：50，反應(yīng)液流速梯度見表2：表2柱后衍生反應(yīng)液流速梯度單位為毫升每分鐘反應(yīng)液時(shí)間0 min25 min25.5 min45 min45.5 min60 min氧化液0.40.40.80.80.40.4中和液0.40.40.80.80.40.4熒光檢測：激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長390 nm；進(jìn)樣量：10 L。17.4.2 色譜測定 根據(jù)樣液中麻痹性貝類毒素的含量情況，選定峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣液中麻痹性貝類毒素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣液等體積參插進(jìn)樣測定。在上述色譜條件下，

34、標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖E.1。17.4.3 空白實(shí)驗(yàn) 除不加試樣外，均按上述測定步驟進(jìn)行。17.4.4 平行試驗(yàn)按以上步驟，對(duì)同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測定。17.4.5 回收率試驗(yàn)陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按17.2和17.3操作，測定后計(jì)算樣品添加的回收率。本標(biāo)準(zhǔn)中10種麻痹性貝類毒素添加濃度及其回收率范圍的試驗(yàn)數(shù)據(jù)參見表F.1。18 分析結(jié)果的表述18.1 結(jié)果計(jì)算 樣品中各種麻痹性貝類毒素的含量按式（6）計(jì)算。 （6）式中：X 試樣中被測組分殘留量，單位為微克每千克（g/kg）；c 從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的被測組分溶液濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V 樣品溶液定容體積，單位為毫升（mL）；m

35、 樣品溶液所代表試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白值。18.2 毒性轉(zhuǎn)換按照國際慣例，STX毒素的毒性因子被設(shè)為1，其他各種麻痹性毒素按照相對(duì)于STX的毒性大小來確定毒性因子（如表3所列）；樣品中麻痹性貝類毒素的含量則按照毒性因子，統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為STXeq來表示，計(jì)算公式見式（7）： （7）式中：Xi 各種麻痹性貝類毒素的含量ri 毒性因子表3麻痹性貝類毒素毒性因子毒素GTX1GTX4GTX2GTX3dcGTX2dcGTX3GTX5（B1）neoSTXSTXdcSTX毒性因子0.990.730.360.640.650.750.060.9210.5119 精密度19.1 一般規(guī)定本部分的

36、精密度數(shù)據(jù)是按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2的規(guī)定確定的，重復(fù)性和再現(xiàn)性的值以95%的可信度來計(jì)算。19.2 重復(fù)性在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對(duì)差值不超過重復(fù)性限r(nóng)，元貝和扇貝中10種麻痹性貝類毒素的添加濃度范圍及重復(fù)性方程見表4。表4 添加濃度范圍及重復(fù)性和再現(xiàn)性方程單位：微克/千克化合物名稱添加濃度范圍樣品基質(zhì)重復(fù)性限r(nóng)再現(xiàn)性限RGTX416.7467元貝lgr = 0.8500 lgm - 0.8188lgR = 0.8591 lgm - 0.6088扇貝lgr = 0.8539 lgm - 0.9002lgR = 0.7293 lgm - 0.5067

37、GTX150.7507元貝lgr = 1.1306 lgm - 1.443lgR = 0.8972 lgm - 0.7528扇貝lgr = 0.969 lgm - 1.1867lgR = 0.7196 lgm - 0.5286dcGTX34.848元貝lgr = 1.1546 lgm - 1.1726lgR = 0.9646 lgm - 0.8163扇貝lgr = 1.3927 lgm - 1.7253lgR = 0.9323 lgm - 0.9648B131.9319元貝lgr = 0.8315 lgm - 0.6425lgR = 0.8174 lgm - 0.5147扇貝lgr = 0.9

38、016 lgm - 0.8929lgR = 0.7068 lgm - 0.4729dcGTX217.3173元貝lgr = 0.9312 lgm - 0.8304lgR = 0.8573 lgm - 0.6391扇貝lgr = 0.8868 lgm - 0.7943lgR = 0.7262 lgm - 0.4253GTX36.565元貝lgr = 0.922 lgm - 0.7962lgR = 0.9336 lgm - 0.7881扇貝lgr = 0.8927 lgm - 0.7661lgR = 0.8415 lgm - 0.5554GTX219.6196元貝lgr = 0.9129 lgm

39、- 0.869lgR = 1.1636 lgm - 1.177扇貝lgr = 0.8554 lgm - 0.802lgR = 0.6884 lgm - 0.4122neoSTX15.7157元貝lgr = 0.8441 lgm - 0.5777lgR = 0.8394 lgm - 0.5405扇貝lgr = 0.6535 lgm - 0.2342lgR = 0.702 lgm - 0.3294dcSTX12.5125元貝lgr = 0.9042 lgm - 0.8163lgR = 0.8585 lgm - 0.6523扇貝lgr = 0.7435 lgm - 0.5299lgR = 0.755

40、2 lgm - 0.4355STX14.5145元貝lgr = 0.8132 lgm - 0.6609lgR = 0.6211 lgm - 0.3105扇貝lgr = 0.9079 lgm - 0.8351lgR = 0.7346 lgm - 0.4503注：m為兩次測XX果的算術(shù)平均值如果差值超過重復(fù)性限，應(yīng)舍棄試驗(yàn)結(jié)果并重新完成兩次單個(gè)試驗(yàn)的測定。19.3 再現(xiàn)性在再現(xiàn)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對(duì)差值不超過再現(xiàn)性限R，元貝和扇貝中10種麻痹性貝類毒素的添加濃度范圍及再現(xiàn)性方程見表4。20 其他方法的測定低限：GTX4為16.7 g/kg；GTX1為50.7 g/kg；dcGTX3

41、為4.8 g/kg；B1為31.9 g/kg；dcGTX2為17.3 g/kg；GTX3為6.5 g/kg；GTX2為19.6 g/kg；neoSTX為15.7 g/kg；dcSTX為12.5 g/kg；STX為14.5 g/kg；合麻痹性貝類毒素總量（STXeq）為125 g/kg。第四法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法21 原理以甲酸-水溶液提取樣品中的麻痹性貝類毒素，經(jīng)乙酸乙酯、氯仿液-液分配去脂、去蛋白，固相萃取柱凈化后，加乙腈除蛋白，超濾離心管過濾，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，外標(biāo)法定量。22 試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為色譜純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。22.1 10種麻

42、痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液: GTX1&4、GTX2&3、dcGTX2&3、neoSTX、STX、dcSTX、GTX5。22.2 乙酸乙酯（CH3COOCH2CH3）22.3 氯仿（CHCl3）22.4 甲酸（HCOOH）：分析純。22.5 甲酸銨（HCOONH4）：分析純。22.6 乙腈（CH3CN）22.7 甲醇（CH3OH）22.8 甲酸銨緩沖溶液（5 mmol/L）：稱取0.315 g甲酸銨，加入5 mL甲酸，用水溶解并稀釋至1000 mL。22.9 甲酸溶液（0.5%）：量取500 L甲酸，用水稀釋至100 mL。22.10 酸化乙腈（0.5%）：量取5 mL甲酸，用乙腈稀釋至1000 m

43、L。22.11 空白樣品基質(zhì)液：空白樣品基質(zhì)液的制備同24.2和24.322.12 HLB固相萃取柱：60 mg/3 mL，使用前預(yù)先用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL甲酸溶液（3.9）活化。22.13 超濾離心管：4 mL，10KD。22.14 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：根據(jù)貝類毒素各組分的濃度，準(zhǔn)確移取適量各組分標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋配成GTX4、GTX3、dcGTX3、STX、dcSTX濃度為500 ng/mL，neoSTX、GTX5濃度為1.0 g/mL，GTX1濃度為1.5 g/mL、GTX2濃度為1.3 g/mL、dcGTX2濃度為2.2 g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，4 避光保存，有效期3個(gè)月

44、。23 儀器和設(shè)備23.1 液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧（ESI）離子源。23.2 天平：感量為 0.0001 g和0.01 g。23.3 高速冷凍離心機(jī)：10000 r/min。23.4 離心機(jī)：4000 r/min。23.5 超聲波清洗器。23.6 旋渦混勻器。23.7 均質(zhì)器。23.8 氮吹儀。23.9 固相萃取裝置24 分析步驟24.1 試樣制備 用水將貝殼外表洗凈。撬開貝殼，切斷閉殼肌，用水淋洗，去除內(nèi)部泥沙及其它異物，仔細(xì)取出貝肉，切勿割破貝體，在篩子上平鋪瀝水5 min，然后將貝肉均質(zhì)、混勻。24.2 提取 稱取試樣（50.05）g，置于50 mL塑料離心管中，加入5

45、 mL 0.5%甲酸溶液（3.9），渦旋混勻1 min，4000 r/min離心10 min，取上清液至另一50 mL塑料離心管中，殘?jiān)性偌尤?.5 mL 0.5%甲酸溶液按上述方法重復(fù)提取2次，上清液合并至50 mL塑料離心管中，用0.5% 甲酸溶液定容至15 mL，混勻后待凈化。24.3 凈化 向所得提取液中加入20 mL乙酸乙酯，渦旋混勻后， 10000 r/min離心10 min，棄去上層溶液；再向提取液中加入20 mL氯仿，渦旋混勻后，10000 r/min離心10 min；取3 mL上層溶液加入已活化的固相萃取柱中，過柱速度控制在每秒1滴，接流出液至10 mL刻度離心管中，用0.

46、5% 甲酸溶液淋洗柱子，收集流出液至3.5 mL。向流出液中加入4.5 mL乙腈，放置5 min 后混勻， 10000 r/min離心10 min，取1 mL上清液至超濾離心管中，10000 r/min離心10 min，所得濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。24.4 儀器分析條件24.4.1 液相色譜參考條件色譜柱TSK-Gel Amide-80，2.0 mm250 mm，5 m，或性能相當(dāng)者；流動(dòng)相：A：甲酸銨緩沖溶液（3.8），B：酸化乙腈（3.10），梯度洗脫條件見表5；流速：0.25 mL/min；柱溫：30 ；進(jìn)樣量：20 L；樣品盤溫度：5 。 表5 流動(dòng)相梯度洗脫條件時(shí) 間/（min

47、）B/酸化乙腈（%）A/甲酸銨溶液（%）0.070303.070303.1604016.0604019.069423.069427.0703035.07030 24.4.2 質(zhì)譜參考條件離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；噴霧電壓：4500 V；離子傳輸毛細(xì)管溫度：300 ；錐孔電壓：-10 V；霧化氣流速：11.7 L/ min；輔助氣流速：1.7 L/ min；碰撞氣壓力：1.5 mTorr；母離子、子離子和碰撞能量見表6。 表6 10種麻痹性貝類毒素母離子、子離子和碰撞能量目標(biāo)化合物母離子/m/z子離子/m/z碰撞能量/eVGTX2396.1316.1*20

48、298.025GTX3396.1298.1*19316.113GTX1412.1332.1*19313.913GTX4412.1313.9*23332.119GTX5380.1300.1*7282.115neoSTX316.1298.0*20220.025STX300.1204.0*21282.022dcSTX257.1221.9*21126.022dcGTX2353.3254.9*18272.918dcGTX3353.3272.9*18254.918注：*為定量離子24.5 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別取一定量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，氮?dú)獯蹈珊?，用空白樣品基質(zhì)液配制系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)工作液中GTX

49、1、GTX 4、GTX2、GTX 3、dcGTX2、dcGTX 3、STX和dcSTX濃度范圍為5 ng/mL100 ng/mL，neoSTX和GTX5 濃度范圍10 ng/mL200 ng/mL，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。以麻痹性貝類毒素的峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。 24.6測定24.6.1 定性測定在相同測試條件下測定標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，樣品溶液中麻痹性貝類毒素的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作液中麻痹性貝類毒素的保留時(shí)間的比值，偏差應(yīng)在5% 以內(nèi)。且檢測到的離子的相對(duì)豐度，應(yīng)當(dāng)與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中離子的相對(duì)豐度一致，其偏差應(yīng)符合表7規(guī)定的范圍，則可

50、判定試樣中存在被測化合物。表7 定性測定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度50%20%至50%10%至20%10%允許的相對(duì)偏差20%25%30%50%24.6.2 定量測定取待測樣品溶液和相應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法以標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量。標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測樣品溶液中麻痹性貝類毒素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白溶液和標(biāo)準(zhǔn)添加溶液中麻痹性貝類毒素特征離子流圖參見附錄G。25 空白試驗(yàn)除不加試樣外，均按上述測定步驟進(jìn)行。26 結(jié)果計(jì)算和表述樣品中麻痹性貝類毒素的含量按公式（8）計(jì)算，計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 （8）式中：Xi樣品中麻痹性

51、貝類毒素的含量，單位為微克每千克（g/kg）；Ci從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中麻痹性貝類毒素的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V樣品最終定容體積，單位為毫升（mL）；f稀釋倍數(shù)；m試樣質(zhì)量，單位為克（g）。按照國際慣例，STX毒素的毒性因子設(shè)為1，其他各種麻痹性貝類毒素按照相對(duì)于STX的毒性大小確定的毒性因子見表8。樣品中麻痹性貝類毒素的含量則按照毒性因子，統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為STXeq.來表示，轉(zhuǎn)換公式見式（9）： STXeq = （9）式中： Xi 各種麻痹性貝類毒素的含量，單位為微克每千克（g/kg） ri 毒性因子表8 麻痹性貝類毒素的毒性因子毒素GTX1GTX4GTX2GTX3dcGT

52、X2dcGTX3GTX5neoSTXSTXdcSTX毒性因子0.990.730.360.640.650.750.060.9210.5127 方法靈敏度本方法GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、dcGTX2、dcGTX3、STX和dcSTX 檢出限為25 g/kg，定量限為50 g/kg；GTX5和neoSTX 檢出限為50 g/kg，定量限為100 g/kg。10種麻痹性貝類毒素在定量限下按毒性因子轉(zhuǎn)換后相當(dāng)于379.5 g/kg的STX。28 準(zhǔn)確度本方法麻痹性貝類毒素添加濃度為50 g/kg600 g/kg時(shí)，回收率為70 %120 %。29 精密度本方法批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差15 %，批間

53、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差15 %。附 錄A麻痹性貝類毒素死亡時(shí)間 鼠單位的關(guān)系麻痹性貝類毒素死亡時(shí)間-鼠單位的關(guān)系見表A.1。表A.1 麻痹性貝類毒素死亡時(shí)間 鼠單位的關(guān)系時(shí)間 鼠單位（分秒） （MU）時(shí)間 鼠單位（分秒） （MU）1：00 1001：10 66.21：15 38.31：20 26.41：25 20.71：30 16.51：35 13.91：40 11.91：45 10.41：50 9.331：55 8.422：00 7.672：05 7.042：10 6.522：15 6.062：20 5.662：25 5.322：30 5.002：35 4.732：40 4.482：45 4.262：

54、50 4.062：55 3.883：00 3.703：05 3.573：10 3.433：15 3.313：20 3.193：25 3.083：30 2.983：35 2.883：40 2.793：45 2.713：50 2.633：55 2.564：00 2.504：05 2.444：10 2.384：15 2.324：20 2.264：25 2.214：30 2.164：35 2.124：40 2.084：45 2.044：50 2.004：55 1.965：00 1.925：05 1.895：10 1.865：15 1.835：20 1.805：30 1.745：40 1.695：45

55、1.675：50 1.646：00 1.606：15 1.546：30 1.486：45 1.437：00 1.397：15 1.357：30 1.317：45 1.288：00 1.258：15 1.228：30 1.208：45 1.189：00 1.169：30 1.1310：00 1.1110：30 1.0911：00 1.07511：30 1.0612：00 1.0513：00 1.0314：00 1.01515：00 1.00016：00 0.9917：00 0.9818：00 0.97219：00 0.96520：00 0.9621：00 0.95422：00 0.94823：0

56、0 0.94224：00 0.93725：00 0.93430：00 0.91740：00 0.89860：00 0.875附 錄B小鼠體重校正表 小鼠體重校正系數(shù)見表B.1。表B.1 小鼠體重校正表 小鼠體重，g 校正系數(shù)1010.51111.51212.51313.51414.51515.51616.51717.51818.51919.52020.52121.52222.5230.500.530.560.590.620.650.6750.700.730.760.7850.810.840.860.880.9050.930.950.970.9851.0001.0151.031.041.051.061.07附 錄CICR小鼠的定義C.1 ICR小鼠的定義ICR小鼠是Hauschka用Swiss小鼠群以多產(chǎn)為目標(biāo)，進(jìn)行選育，以后美國癌癥研究所（InstituteofCance