悅目金蛛粗毒的提取和制備

1、悅目金蛛粗毒的提取和制備【摘要】目的理解掌握悅目金蛛生活習(xí)性和形態(tài)特征，分析毒腺形態(tài)與體量的相關(guān)性，優(yōu)化明確制毒道路，獲得較純生理活性較高的蜘蛛粗毒。方法通過毒腺形態(tài)解剖，借助數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法分析了毒腺形態(tài)與蜘蛛體量的相關(guān)性；采用毒腺解剖法直接獲取性質(zhì)穩(wěn)定和最多量的蛛毒粗品，以雞紅細(xì)胞為模型檢驗(yàn)了粗毒效價(jià)，探究了毒素離子通道抑制類型。結(jié)果毒腺重量與體量呈正相關(guān)，按照優(yōu)化后的制備方法和技術(shù)線路，制得5g悅目金蛛粗毒；悅目金蛛毒素有促進(jìn)紅細(xì)胞凝集和裂解作用，在鈣離子環(huán)境下毒素對(duì)紅細(xì)胞的裂解作用更強(qiáng)。結(jié)論利用毒腺解剖法可以獲得最大量更高純度的蛛毒，初步確定了蛛毒當(dāng)中含有凝集素和磷脂酶兩種成分?！娟P(guān)鍵詞】

2、悅目金蛛；毒腺解剖；粗毒；細(xì)胞毒理hinaAbstrat：bjetiveHavingadetailedasteryabuttheArgipeaenasrphlgialharateristisandlivinghabits,eanalyzedtherelevenefpisnglandEightandlengthtitsbdy.Usingtheptiizedethdebtainedhigherbilgialprpertiesandrepureven.ethdsegttherelevenefpisnglandEIghtandlengthtitsbdyusingstatistialethdbyanat

3、ingpisngland.Islatingpisnglandfrspider,btainedstableandaxiuauntfven，etestedtiterfvenandexplrethetypefinhibitinhannelstxinusinghikenredbldellsasadel.ResultsVenglandseightandbdyasserepsitivelyrrelated.iththeptiizedeanpreparedethd,fiveillingrasfrudeveneregt.Thevenhaseffetfprtingredbldellaggregatingandr

4、aking.Thebldellrakedreseriuslyinthealiuinsenvirnent.nlusinrequalifiedvenanbegtbyvenglanddissetin.einitiallyknthatvenntainsphsphlipaseletinandagglutinin.Keyrds：Argipeaena;Anatyfven;rudetxin;ellphysilgy蜘蛛是害蟲的重要天敵，以其毒素麻木殺死獵物。蜘蛛毒素成分復(fù)雜，主要為蛋白質(zhì)和多胺類物質(zhì)，蛋白質(zhì)包括各種多肽神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素、酶、激肽類似物、凝集活性肽和抗菌肽等，多胺類物質(zhì)有ATP、核苷酸、氨基酸、

5、多胺、單胺類等低分子量物質(zhì)和無機(jī)鹽等。蜘蛛毒素具有多種活性，現(xiàn)已證實(shí)含有多種特異性多肽配體，可以選擇性地和K+、Na+、a2+通道的亞型相結(jié)合111。國(guó)內(nèi)梁宋平等12對(duì)虎紋捕鳥蛛、海南捕鳥蛛和廣西大疣蛛的毒素進(jìn)展了較深化的研究。悅目金蛛Argipeaena隸屬于蜘蛛目園蛛科金蛛屬，體中大型，為結(jié)網(wǎng)蜘蛛，在我國(guó)南方各省均有分布，多出沒于夏秋季，以卵袋越冬13。由于悅目金蛛多生活在植被繁茂的山區(qū)，不易飼養(yǎng)，故關(guān)于悅目金蛛毒素的研究少有報(bào)道。1儀器與材料1.1儀器上海精細(xì)A1004電子天平，lypusX41顯微攝像系統(tǒng)，上海新苗DNP-9052BS-電熱恒溫培養(yǎng)箱和DHG-9073BS-恒溫鼓風(fēng)枯燥

6、箱，湖南星科TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī)，江蘇昆山KQ-50DB數(shù)控超聲波清洗器，北京泰克0610-403體式顯微鏡，日本三豐560-108NK20游標(biāo)卡尺，上海光學(xué)顯微鏡測(cè)微尺和上海亞榮真空抽氣泵與枯燥器等。1.2悅目金蛛的采集悅目金蛛采自于江西省貴溪市冷水林場(chǎng)，共28頭，其中雄性3頭，雌性25頭。悅目金蛛主要分布于山區(qū)丘陵地帶，布圓網(wǎng)于向陽面，以捕食較大型昆蟲為主，喜結(jié)網(wǎng)于人居區(qū)周邊灌叢，尤以牛棚豬圈旁為多。悅目金蛛脆弱，附肢較長(zhǎng)，極易損傷，在采集過程當(dāng)中應(yīng)格外小心；可以用捕蟲網(wǎng)將蜘蛛捕獲，裝入盒內(nèi)，放入一些樹葉，以保持濕度和良好通風(fēng)性，防止振蕩和過度高溫。采集完畢返回后，應(yīng)將蜘蛛及時(shí)放在

7、灌木上實(shí)行半開放式生態(tài)放養(yǎng)。2結(jié)果與方法2.1悅目金蛛毒腺形態(tài)與體量相關(guān)性分析悅目金蛛的毒腺最細(xì)端位于螯基前端，并向頭部延伸，多位于頭胸部前段內(nèi)，覆蓋在神經(jīng)團(tuán)上，且左右兩兩相對(duì)趨向于蛛體的縱中軸。為了快速、準(zhǔn)確而高效地獲得蜘蛛毒腺，防止造成材料的損失，我們對(duì)悅目金蛛毒腺進(jìn)展了形態(tài)解剖，明確毒腺的構(gòu)造和詳細(xì)位置，然后對(duì)毒腺進(jìn)展形態(tài)描繪。解剖之前先用電子天平稱出蜘蛛的體重,對(duì)大型個(gè)體用游標(biāo)卡尺分別量出其頭胸部和腹部的長(zhǎng)和寬,而對(duì)小型蜘蛛個(gè)體那么用顯微測(cè)微尺量出其頭胸部和腹部的長(zhǎng)和寬，隨后測(cè)量取出的毒腺長(zhǎng)和寬，并稱重。詳細(xì)測(cè)量結(jié)果見表12，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)展回歸分析說明：悅目金蛛在性別一樣、生境一致、個(gè)體大

8、小不同時(shí)，蜘蛛毒腺的位置和形態(tài)與蜘蛛的種群演化、生活方式和形態(tài)體積有一定關(guān)系，其中，成蛛的毒腺重量與其體質(zhì)量之間呈正相關(guān)，相關(guān)顯著；成體的毒腺長(zhǎng)度與其頭胸長(zhǎng)之間也為正相關(guān)，顯著性檢驗(yàn)為極顯著。表1悅目金蛛成體毒腺重量與個(gè)體質(zhì)量的相關(guān)性略表2悅目金蛛成體毒腺長(zhǎng)度和個(gè)體長(zhǎng)度的數(shù)據(jù)相關(guān)性分析略2.2悅目金蛛粗毒提取和制備方法的優(yōu)化由于悅目金蛛與特大型虎紋捕鳥蛛、敬釗纓毛蛛等相比，成體相對(duì)較小，含毒量不多，且附肢長(zhǎng)，給采毒帶來困難；我們?cè)趪L試過活體誘導(dǎo)取毒、電刺激取毒和解剖別離毒腺等多種方法后，確定了采用毒腺解剖法，后經(jīng)屢次比對(duì)試驗(yàn)，優(yōu)化出一條適于毒量不大蜘蛛毒腺的解剖勻漿取毒法，步驟如下：先將蜘蛛放

9、入冰箱-4凍暈，根據(jù)鰲肢確定毒腺管位置，然后從反面“丁字型剪開其頭胸甲，依毒腺管向上延伸方向找到毒腺，并用鑷子小心取出，將其冰凍枯燥保存。取15對(duì)枯燥毒腺，在23倍去離子水中制成勻漿，用2000r/in的速率離心15in，取上清液。向沉淀物中加等體積去離子水，再離心，取上清液。再向沉淀物中加等體積去離子水，調(diào)pH值至4.0，勻漿、離心、取上清液，合并上清液，過濾，去除雜質(zhì)，得到澄清液，進(jìn)展冷凍，等結(jié)成冰塊，將冷凍的蛛毒冰塊放置于真空枯燥器內(nèi)，進(jìn)展真空枯燥，在枯燥器的底層放適量的氧化鈣作為枯燥劑，接著用真空泵抽氣，抽氣過程中，要注意觀察，假如發(fā)現(xiàn)蛛毒外表產(chǎn)生大量氣泡時(shí)，就要停頓片刻再抽，直至根本

10、枯燥，變成大小不等的顆粒結(jié)晶體為止，真空枯燥一般在6h內(nèi)徹底枯燥完?？菰锖蟮闹攵炯闯煞勰罨驂K狀，刮下干毒粉分裝成小瓶，溶蠟密封，貼上標(biāo)簽，注明蛛毒毒粉的制備日期和重量，上包不透明的黑紙，置于-的冰箱內(nèi)可保存1年不變質(zhì)。在整個(gè)取毒和制備過程中，應(yīng)首先注意整個(gè)過程必須干凈衛(wèi)生，確保采毒的純度，其次取毒過程盡量在低溫下進(jìn)展，各種試劑必須預(yù)先冰裕2.3悅目金蛛粗毒組分和效價(jià)檢測(cè)2.3.1悅目金蛛粗毒組分及構(gòu)造觀察常溫下，提取制備到的悅目金蛛粗毒呈粉狀；用光學(xué)顯微鏡觀察粗毒，100和400倍下粗毒呈片狀或片狀均勻晶體，不含其它顆粒雜質(zhì)。見圖1。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.3.2悅目金蛛粗毒的凝聚和裂解作

11、用檢測(cè)取50l制備好的泰和烏雞血紅細(xì)胞懸液懸液細(xì)胞密度約為1.04103個(gè)/3和200lPBS緩沖液參加1l的PV離心管中，隨后參加50l悅目金蛛毒液，振蕩，搖勻。豎置于30的恒溫培養(yǎng)箱中，每隔5in，用移液槍取20l反響液于單凹載玻片上，用顯微鏡觀察，并拍照。經(jīng)屢次重復(fù)梯度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果說明悅目金蛛粗毒溶液對(duì)泰和烏雞血紅細(xì)胞有明顯的促凝集和裂解作用，由此可說明粗毒中含有糖蛋白凝集素和磷酯酶成分，且它能介導(dǎo)紅細(xì)胞粘連和促進(jìn)細(xì)胞裂解。見圖2。2.3.3悅目金蛛粗毒促離子通道成分的探究分別在60l制備好泰和烏雞血紅細(xì)胞懸液懸液細(xì)胞密度約為1.04103個(gè)/3中參加相應(yīng)的0.17l/LKl和0.17l/

12、Lal2溶液，調(diào)配至1.5l，分成3個(gè)對(duì)照組，前兩份分別參加20l悅目金蛛毒液和20l大腹園蛛毒液，另外一份參加20lPBS緩沖液。設(shè)5in，30in，60in，120in和180in5個(gè)不同反響時(shí)段，分段取液于血球計(jì)數(shù)板上，用顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)。詳細(xì)反響結(jié)果見圖34。通過對(duì)圖的比對(duì)分析，可以得知：悅目金蛛毒素和大腹園蛛毒素均有促進(jìn)紅細(xì)胞溶血的作用，且大腹園蛛毒素的作用更為明顯。而且，毒素對(duì)紅細(xì)胞的裂解作用在鈣離子環(huán)境下要比鉀離子環(huán)境下更強(qiáng)。推測(cè)其原因可能是兩種粗毒中有鈣離子配體門通道的激活成分，致使鈣離子快速進(jìn)入紅細(xì)胞，加速溶血；另外，蛛毒中可能存在的磷脂酶裂解紅細(xì)胞質(zhì)膜也是其中原因之一。3討論目前，蛛毒的采集多為誘導(dǎo)法和電擊法，由于悅目金蛛個(gè)體相對(duì)較小，螯肢細(xì)短，活體采毒極為困難。本文在對(duì)悅目金蛛的生活習(xí)性和形態(tài)構(gòu)造進(jìn)展初步研究的根底上，用改進(jìn)優(yōu)化的毒腺解剖勻漿法，成功提取制備了具有穩(wěn)定性質(zhì)和生理活性的粗毒5g，為毒素的后續(xù)純化和研究奠定了基矗后續(xù)實(shí)驗(yàn)說明，利用毒腺解剖勻漿法可以獲得最大量更高純度的蛛毒。在實(shí)體鏡下，用解剖剪剪開螯肢和頭胸甲取出毒囊，如用銀針刺破毒囊，而不用勻漿法，可進(jìn)一步防止非毒素蛋白的污染。用去離子水將毒液洗出，2000r/in離心15in取上清液，冷凍枯燥，獲得的毒素在顯微鏡