膜醭畢赤酵母菌外泌蛋白抑菌復(fù)合膜的制備及性能研究

1、膜醭畢赤酵母菌外泌蛋白抑菌復(fù)合膜的制備及性能研究酵母菌是人類文明史中被應(yīng)用得最早的微生物，其中拮抗酵母菌在果蔬貯藏期病害防治領(lǐng)域被廣泛研究1。將拮抗微生物作用于病原菌雖然效果很好，但因其活體生長(zhǎng)要求營養(yǎng)條件苛刻，很難直接作用于食品上并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此，從微生物和代謝物質(zhì)中提取具有抑菌功能的物質(zhì)成為新的研究方向。已有研究表明，拮抗菌D.hansenii產(chǎn)生的低分子質(zhì)量蛋白能夠抑制所有被測(cè)病原菌菌絲體的生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)果實(shí)的保藏時(shí)間和果品質(zhì)量2-3。交鏈孢霉菌(Alternariaalternatasp.)是低溫環(huán)境下導(dǎo)致水果、蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品腐爛變質(zhì)的主要致病微生物，是果蔬保鮮的重要防治對(duì)象4，所

2、在實(shí)驗(yàn)室分離得到1株膜醭畢赤酵母，對(duì)交鏈格孢菌有明顯的抑制作用5，對(duì)其抑菌成分的開發(fā)可為該菌工業(yè)化應(yīng)用提供有力的保證。本文對(duì)膜醭畢赤酵母發(fā)酵液進(jìn)行初步抑菌性探索，在此基礎(chǔ)上，以玉米淀粉為基質(zhì)，添加食品級(jí)卡拉膠共混，以甘油為增塑劑制備復(fù)合抑菌膜。探索粗提純蛋白的加入對(duì)復(fù)合膜力學(xué)性能、阻隔性能和外觀形態(tài)等的影響，并研究該復(fù)合膜對(duì)交鏈格孢菌生長(zhǎng)的抑制作用。1 材料與方法1.1 主要試劑玉米淀粉、卡拉膠(食品級(jí))，河南萬邦化工科技有限公司；甘油、硫酸銨(分析純)，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶(分析純)，索萊寶科技有限公司。1.2 供試菌和培養(yǎng)基膜醭畢赤酵母菌

3、(Pichiamembranaefaciens)、交鏈孢菌(Alternariaalternata)和灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)由天津科技大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品物流保鮮與加工研究室提供。1.3 儀器與設(shè)備TU-1810紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；TE32 TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；ZHJH-C1109B無菌操作臺(tái)，上海智城分析儀器制造有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)，上海向帆儀器有限公司；CH1S測(cè)厚儀，上海六菱儀器廠。1.4 膜醭畢赤酵母發(fā)酵液抑菌性研究(1)膜醭畢赤酵母發(fā)酵液制備將膜醭畢赤酵母接種于PDA液體培養(yǎng)基

4、中，搖床培養(yǎng)35 d后，離心收集上清液，即為無細(xì)胞發(fā)酵液。(2)發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌的離體抑制作用參照余巧銀等6的方法，在27 下，培養(yǎng)5 d，觀察發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌的離體抑制作用。觀察、計(jì)算抑菌率，如公式(1)所示：抑菌率(1)(3)蛋白酶對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響將無細(xì)胞發(fā)酵液用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)至pH為7后，分別加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K，使其終濃度為0.2 mol/L，在37 水浴中充分反應(yīng)4 h后，沸水浴加熱0.5 h，以同樣處理未接入蛋白酶的無細(xì)胞發(fā)酵液為對(duì)照組1；將無細(xì)胞發(fā)酵液用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH為2后加入胃蛋白酶，同樣以未接入蛋白酶的發(fā)酵液為對(duì)照組2。

5、參照1.4(2)中的方法分別測(cè)定在添加不同蛋白酶處理發(fā)酵液的培養(yǎng)基中灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)直徑，以無菌水為對(duì)照組計(jì)算抑菌率。1.5 生物蛋白抑菌復(fù)合膜的制備(1)抑菌蛋白鹽析提取在冷水浴下，將硫酸銨研磨后緩慢加入膜醭畢赤酵母發(fā)酵液中至硫酸銨的最終飽和度達(dá)到60%。冷藏過夜，離心收集蛋白質(zhì)沉淀物，透析除鹽后冷凍干燥得到蛋白質(zhì)提取物粉末。(2)抑菌復(fù)合膜的制備配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的玉米淀粉溶液加熱糊化30 min7，同時(shí)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%卡拉膠溶液，微波加熱8。將上述兩種溶液等體積混合后，向其中加入體積分?jǐn)?shù)為1%的甘油制備成基礎(chǔ)膜液。將凍干蛋白提取物粉末配制成10 mg/mL的溶液，隨后進(jìn)行2倍梯度稀

6、釋至16倍，將原液與各稀釋后的溶液分別按體積分?jǐn)?shù)為1%加入基礎(chǔ)膜液中。采用流延法9-10，取20 mL倒入直徑9 cm的一次性培養(yǎng)皿中，在45 下恒溫干燥4 h后揭膜。將復(fù)合膜樣品存放于相對(duì)濕度(502)%環(huán)境中平衡48 h備用。1.6 復(fù)合膜性質(zhì)測(cè)定1.6.1 厚度參照張伸11的方法，測(cè)定復(fù)合膜的厚度。利用手持測(cè)厚儀(精確到0.001 mm)測(cè)定薄膜邊緣和中間10個(gè)點(diǎn)的厚度，取平均值。1.6.2 力學(xué)性能參照顏田田等12和肖力源等13的測(cè)定方法和計(jì)算公式，使用TA.XT.plus型質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度(tensile strength,TS)及斷裂伸長(zhǎng)率(elongation at b

7、reak,EAB)。1.6.3 透濕性能根據(jù)GB 103788塑料薄膜和片材透水蒸氣性試驗(yàn)方法杯式法，參照陳紅艷等14的方法，水蒸氣透過系數(shù)(water vapor permeability,WVP)計(jì)算如公式(2)所示：(2)式中:m為稱量瓶增加的質(zhì)量，g；d為復(fù)合膜的平均厚度，mm；A為稱量瓶瓶口面積，m2；t為稱量瓶放入恒濕器中的時(shí)間，24 h；p為23 下的水蒸氣壓，KPa。1.6.4 透明度參照王海霞15的方法和計(jì)算公式，測(cè)定膜的吸光度值。計(jì)算復(fù)合膜透明度。1.7 抑菌蛋白復(fù)合膜對(duì)交鏈格孢菌抑菌作用實(shí)驗(yàn)(1)平板對(duì)峙法：參照喬博鑫等16的方法，實(shí)驗(yàn)組注入30 L抑菌復(fù)合膜液，對(duì)照組注

8、入30 L無菌水。于28 下培養(yǎng)5 d后觀察、記錄。(2)含藥平板法17：將復(fù)合膜液與融化后的PDA培養(yǎng)基混合，待培養(yǎng)基凝固后，接入直徑為1 cm的交鏈格孢菌菌片，以無菌水組作為對(duì)照，于28 下培養(yǎng)5 d后觀察、記錄。1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，使用Origin 2022軟件進(jìn)行繪圖。2 結(jié)果與分析2.1 蛋白酶對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響由圖1可知，胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶均能顯著降低發(fā)酵液的抑菌活性(P0.05)，經(jīng)過胃蛋白酶處理的發(fā)酵液的抑菌率僅為36.30%，而對(duì)照組為65.97%，但木瓜蛋白酶對(duì)發(fā)酵液的抑菌性影響不大。實(shí)驗(yàn)證明，

9、發(fā)酵液中存在蛋白類抑菌物質(zhì)。A-胰蛋白酶；B-木瓜蛋白酶；C-蛋白酶K；D-胃蛋白酶； CK1-對(duì)照組1；CK2-對(duì)照組2；CK-無菌水 a-不同蛋白酶處理后發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌生長(zhǎng)的影響； b-不同蛋白酶處理后發(fā)酵液的抑菌率圖1 蛋白酶對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響Fig.1 Effect of protease on the antibacterial activity of fermentation broth注：不同小寫字母表示差異顯著(P0.05)(下同)2.2 復(fù)合膜的性質(zhì)2.2.1 外觀形態(tài)通過觀察外觀形態(tài)可以直接了解薄膜的顏色、透明程度及表面狀態(tài)。由圖2可看出，抑菌復(fù)合膜與基礎(chǔ)復(fù)合膜相比，

10、顏色微黃，二者均較透明且表面平整光滑，無明顯的顆粒感和粗糙感。a-基礎(chǔ)復(fù)合膜；b-抑菌蛋白膜圖2 玉米淀粉-卡拉膠基礎(chǔ)復(fù)合膜與抑菌蛋白膜外觀形態(tài)圖Fig.2 Appearance of corn starch-carrageenan basic composite film and bacteriostatic protein film2.2.2 厚度和透濕性能WVP是衡量包裝材料阻隔外界水氣接觸內(nèi)部食品的重要指標(biāo)。由表1可知，抑菌復(fù)合膜與基礎(chǔ)復(fù)合膜在厚度和WVP方面差異不顯著(P0.05)，說明蛋白提取物的加入對(duì)復(fù)合膜的厚度和WVP無較大影響，抑菌復(fù)合膜薄厚均勻且有良好的水分保持作用。這可能

11、是由于蛋白提取物與玉米淀粉、卡拉膠等基礎(chǔ)成膜材料具有良好的相容性18，抑菌復(fù)合膜質(zhì)地連續(xù)均勻。表1 抑菌復(fù)合膜與基礎(chǔ)復(fù)合膜厚度和WVP對(duì)比Table 1 Comparison of thickness and WVP between antibacterial composite membrane and basic composite membrane film注：0、2、4、8、16分別代表不同稀釋倍數(shù)蛋白溶液制備的抑菌復(fù)合膜；不同小寫字母表示差異顯著(P0.05)2.2.3 透明度和力學(xué)性能透明度是衡量包裝材料性能的指標(biāo)之一，良好的透明度便于觀察被包食品的外觀形態(tài)。由圖3可知，基礎(chǔ)復(fù)合膜

12、透明度可達(dá)到(66.801.63)%，加入蛋白提取物原液的復(fù)合膜透明度僅有(52.091.32)%，下降了18.71%。此外，透明度隨著蛋白提取物濃度降低而上升，當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到16時(shí)，抑菌復(fù)合膜的透明度升至(64.541.63)%，與基礎(chǔ)復(fù)合膜之間無明顯差異。這可能是由于蛋白提取物本身呈現(xiàn)黃色，加入后使膜也呈現(xiàn)黃色(如2.2.1所示)阻礙了光的傳播路徑。圖3 不同濃度蛋白提取物對(duì)復(fù)合膜透明度的影響Fig.3 Effects of different concentrations of protein extracts on the transparency of composite membr

13、ane力學(xué)性能反應(yīng)了薄膜的柔韌性和抗拉強(qiáng)度，由圖4可知,蛋白提取物的加入使復(fù)合膜的TS下降，EAB上升。基礎(chǔ)復(fù)合膜的TS為(11.860.50) N/mm2，抑菌復(fù)合膜的TS為(5.801.54) N/mm2，下降了51%。普通復(fù)合膜的EAB為(35.197.27)%，抑菌復(fù)合膜的EAB為(62.076.41)%，增長(zhǎng)了43%。這可能是因?yàn)榈鞍滋崛∥锱c淀粉發(fā)生相互作用，使淀粉本身氫鍵作用降低19，導(dǎo)致復(fù)合膜抗拉強(qiáng)度降低，由脆性向柔性轉(zhuǎn)變。圖4 抑菌蛋白復(fù)合膜和普通復(fù)合膜力學(xué)性能對(duì)比圖Fig.4 Comparison of mechanical properties between antiba

14、cterial protein composite membrane and ordinary composite membrane2.2.4 抑菌膜對(duì)交鏈格孢菌的離體抑制作用平板對(duì)峙法：如圖5所示，經(jīng)過對(duì)峙實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)5 d后，在分界線上出現(xiàn)明顯的抑菌帶，菌落半徑在靠近左側(cè)小孔明顯一側(cè)小于垂直方向上，靠近小孔測(cè)的菌落半徑只有(1.80.1) cm，在垂直方向上菌落半徑為(3.80.1) cm，說明抑菌膜液對(duì)交鏈孢菌有明顯的抑制作用。含藥平板法：如圖6所示，在培養(yǎng)5 d后，含藥平板菌落直徑明顯小于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組菌落直徑僅為(1.20.1) cm，而對(duì)照組菌落直徑為(6.50.1) cm，約

15、是實(shí)驗(yàn)組菌落直徑的5.4倍，說明抑菌復(fù)合膜液對(duì)交鏈孢菌有明顯的抑制作用。a-空白對(duì)照;b-實(shí)驗(yàn)組反面;c-實(shí)驗(yàn)組正面圖5 抑菌蛋白膜液與交鏈孢菌平板對(duì)峙結(jié)果Fig.5 Results of confrontation between antibacterial protein film solution andAlternariaalternataplatea-實(shí)驗(yàn)組;b-對(duì)照組圖6 含抑菌復(fù)合膜液藥平板對(duì)交鏈孢菌抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of liquid drug plate containing antibacterial composite membrane onAlternariaalternata3 結(jié)論近年來，以拮抗酵母菌為基礎(chǔ)的果蔬采后病原微生物防治產(chǎn)品的研究開發(fā)取得了令人矚目的進(jìn)展19，本實(shí)驗(yàn)室已有的研究表明，膜醭畢赤酵母菌發(fā)酵液中可能存在蛋白類抑菌物質(zhì)，尋找能夠維持抑菌成分生物活性的載體成為進(jìn)一步的研究方向20。本文在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索了以玉米淀粉-卡