ECM修復兔橈骨缺損的實驗研究

1、ECM修復兔橈骨缺損的實驗研究【摘要】研究自制的兔耳廓脫細胞軟骨基質extraellularartilageatrix，E修復骨缺損的特點及機理。方法采用新西蘭大白兔共40只，隨機分A、B兩組，在其兩側橈骨干中段制作5的骨缺損模型。右側作為實驗側，缺損區(qū)A組植入脫細胞軟骨基質復合自體培養(yǎng)骨髓干細胞，B組僅植入脫細胞軟骨基質，左側為空白對照。分別于2、4、6、10周處死動物，標本行放射學及組織學檢查。結果X線及組織切片均證實復合體在6周時已有致密骨組織形成，10周時已有新生髓腔生成。結論說明兔耳廓脫細胞軟骨基質與自體骨髓干細胞復合體有良好的成骨才能，有引導組織再生、防止骨不連作用?！娟P鍵詞】骨缺

2、損骨移植脫細胞軟骨基質軟骨細胞Abstrat：bjetiveTheharateristisandehanisfthebnedefetrepairiththeusingallgeniextraellularartilageatrixEerestudied.ethdFrtyNeZealandhiterubbitseredividedintthreegrupsatrand:AandBntherightside,thedefetasverediththeplexfEandautlgusesenhyalsteellsSs,theEinthegrupsAandB,respetively.Thedefets

3、ntheleftsideservedasntrlsrrespndingly.Therabbitserekilledatthe2nd,4th,6th,10theek.Sapleseretakenfrradilgialandhistlgialstudies.ResultIntheexperientalsidesthebnedefetserehealed.Nebneappearedintheayfintraebranusssifiatinandenthndrstsis.nlusinItissuggestedthattheplexfEandautlgusSshastheeffetsnguidingbn

4、eregeneratinandpreventingfrnnunin.Keyrds:bnedefet;bnegrafting;extraellularartilageatrixE;hndryte臨床上長段骨缺損造成的骨不連較常見。骨缺損的修復材料很多，自體骨移植修復效果雖理想，但其來源有限。如何選擇一種材料來進步骨缺損修復效果，這是人們正在研究的重點。作者采用經(jīng)膠原酶-去垢劑處理，去除抗原性成分的兔耳廓軟骨復合自體軟骨細胞植入兔橈骨干缺損，分別于2、4、6、10周觀察骨的修復才能。詳細報告如下。1材料和方法1.1材料新西蘭大白兔購自華中科技大學同濟醫(yī)學院動物試驗中心，共40只，均為雄性，月齡為2

5、3個月，體重2.02.5kg。1.2兔耳廓E的制備1.3骨髓干細胞的別離和培養(yǎng)按Kadiyala等2描繪的方法，取安康2個月齡新西蘭大白兔，氯胺酮和異丙嗪肌注麻醉，雙側髂部剪毛后碘伏消毒，在無菌條件下用16號骨穿刺針在髂骨翼外側穿入骨髓腔，注射器針管內預先含有0.1l肝素鈉生理鹽水，抽吸骨髓液6l移入5A培養(yǎng)液5l的離心管內混勻，1500rin離心5in，棄上層脂肪和上清。參加適量無血清培養(yǎng)液懸浮細胞，緩慢移入盛有比重為1.077淋巴細胞別離液的離心管中細胞培養(yǎng)液與細胞別離液之比11，以2000rin離心20in，小心汲取界面的有核細胞乳白層，參加5A培養(yǎng)液10l，制成細胞懸液移入252培養(yǎng)瓶

6、中，置于3752及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察呈形態(tài)一致的均質的分布均勻的細胞，可用于Ss搜集和移植4、5，計數(shù)每瓶中含有細胞1.5105個l時，搜集的骨髓Ss低溫存儲中。1.4動物模型的制備23個月齡的新西蘭大白兔40只，均為雄性，體重2.02.5kg，隨機分為2組，每組20只，在其雙側橈骨中段，咬去5橈骨造成骨缺損模型，右側作為實驗側，左側為空白對照，A組中右側缺損區(qū)植入脫細胞軟骨基質復合自體培養(yǎng)軟骨細胞，B組僅植入脫細胞軟骨基質，分別于2、4、6、10周處死動物，標本行放射學及組織學檢查。1.5放射學檢查術后第4、6、10周分別于同樣條件下拍X線片觀察骨缺損修復情況。因為E不顯

7、影，假如出現(xiàn)密度增高影即表示有新骨形成。對12周的X線片根據(jù)骨缺損內生骨面積行X線等級療效評估3。100為5分，75%99為4分，50%74為3分，2549為2分，1%24為1分，0為0分。1.6組織學觀察分別于第2、4、6、10周各處死動物，取雙側修復的，將尺橈骨別離，福爾馬林固定1周，此后別離出橈骨，以原缺損區(qū)為中心切取橈骨10，作為組織學切片檢查，HE染色。1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)用x-s表示，采用t檢驗，P0.05為有統(tǒng)計學意義。2結果2.1放射學檢查A組實驗側復合體側：第4周時出現(xiàn)點狀陰影，部分出現(xiàn)毛玻璃陰影；6周時陰影密度增大，有大片鈣化，骨量增加；10周已完全骨性連接，大部分出現(xiàn)

8、不規(guī)那么骨髓腔，可見少量骨髓腔相通圖1、2。B組實驗側E植入側：4周后未見明顯鈣化影；6周時亦見少部分骨連接，鈣化影增寬；10周時骨缺損處有較多的鈣化，骨量增加，均都部分骨性連接，一部分出現(xiàn)不規(guī)那么髓腔圖3、4。對照組10周時缺損區(qū)仍無新骨形成圖5、6表1。表1兔橈骨干骨缺損治療10周時X線片療效評分結果A組實驗側復合體側：術后2周可見編織骨和成團的軟骨細胞，炎性細胞較少，并可見絲團狀的纖維蛋白以及增生的小動脈，有纖維骨痂形成，新的骨小梁開場出現(xiàn)；4周時編織骨量增加明顯，呈灶狀；6周時出現(xiàn)大量新生致密的骨組織，編織骨逐漸吸收降解，極少數(shù)軟骨細胞與纖維組織充填骨缺損區(qū)、10周時形成皮質骨和成熟骨

9、髓，伴隨骨痂生長，可見骨髓腔相通圖7。B組實驗側E植入側：2周時有較多軟骨細胞及纖維組織及少量炎性細胞；4周時出現(xiàn)少量新生骨，未見髓腔出現(xiàn)；6、10周時出現(xiàn)交織骨，有少許不規(guī)那么髓腔，但仍見軟骨細胞圖8。組對照組10周后大部分仍可見有缺損，少量地填充肉芽組織圖9。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.2.3骨小梁形態(tài)計量分析A組實驗側復合體側新生骨小梁面積17.434.582，高于B組實驗側E植入側新生骨小梁面積11.923.192，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義t=5.59，P0.05；而A組實驗側和B組實驗側與組對照側8.255.33的新生骨小梁面積相比擬具有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義t=6.68，P0.0

10、01；t=9.56，P0.05。3討論3.1概述骨缺損的修復方法很多，有自體骨移植、異體骨移植、人工骨移植等，最理想的修復方法是自體骨移植，但是受到供體的限制。近幾年來，長段骨缺損修復研究越來越多，用于細胞種植的骨移植材料可分為人工和天然兩種，人工材料具有較好的生物相容性、可降解性及可吸收性，但費用昂貴，降解率可塑性低，特別是其酸性代謝產(chǎn)物會降低聚合物周圍的pH值，從而影響細胞核組織生長4，還可以引起纖維化及可能發(fā)生周圍組織的免疫反響5；天然材料有同種異體骨、異種骨等，作者使用異體軟骨通過脫細胞處理后制作的細胞外軟骨基質extraellularartilageatrix，E來修復兔的橈骨5缺損

11、，觀察其修復的效果。結果說明：E復合骨髓基質干細胞A組效果最好，其次為B組，較差的為組，說明E可作為骨缺損的修復組織材料，亦可作為細胞培養(yǎng)支架材料。3.2E的組織構造E只起支持保護細胞和維持浸透壓的作用。近年來，細胞外間質的研究開展非常迅速。如今研究認為E是個“蛋白信使豐富的環(huán)境，并且軟骨細胞與E的互相作用調節(jié)了許多生物學過程，這包括了細胞的黏附、生長、分化及生存6。3.3骨缺損研究開展方向骨髓基質干細胞可以向成骨細胞轉化，具有明確的成骨才能。但是單體內植入細胞并不能有效地形成新的組織，其主要原因在于以液態(tài)形式注入體內的細胞在部分微環(huán)境的作用下，無法保持部分有效濃度，導致新生組織數(shù)量下降。在組

12、織工程化新生骨組織的發(fā)生過程中，生長因子不僅可以發(fā)揮誘導成骨作用，也可以促進種子細胞的增殖分化，直接推動骨組織的形成7。骨缺損移植E作為支架，其成骨來源于宿主骨周圍的骨膜8，成骨活動以軟組織侵入和形成骨吸收陷窩，陷窩內的破骨細胞和成骨細胞來源于移植骨質周圍的骨髓干細胞9，吸收和重建同時進展。陷窩逐漸形成管狀構造，周圍有新骨形成，可以觀察到活潑的骨誘導成骨現(xiàn)象。移植后4周可形成較為堅強的骨外痂，該結合部的主要愈合外表，特別是在骨移植早期為主要的愈合方式。圖1A組實驗側復合體側：10周后標本顯示骨缺損已完全骨性連接，外形平滑，骨質比擬堅硬圖2A組實驗側復合體側：10周時陰影密度增大，有大片鈣化，骨

13、量增加，已完全骨性連接，大部分出現(xiàn)不規(guī)那么骨髓腔，可見少量骨髓腔相通圖3B組實驗側E植入側：10周時骨缺損處有較多的鈣化，骨量增加，均都部分骨性連接，周圍仍有少部分纖維肉芽組織圖4B組實驗側E植入側：10周時骨缺損處有較多的鈣化，骨量增加，均都部分骨性連接，一部分出現(xiàn)不規(guī)那么髓腔圖5對照組：10周時缺損區(qū)大部分為纖維肉芽組織，無明顯新骨形成圖6對照組：10周時骨缺損區(qū)顯示仍無新骨形成圖7A組實驗側復合體側：10周時形成皮質骨和成熟骨髓，伴隨骨痂生長，可見骨髓腔相通圖8B組實驗側E植入側：10周時出現(xiàn)交織骨，有少許不規(guī)那么髓腔，但仍見軟骨細胞圖9組對照組：10周后大部分仍可見有缺損，少量地填充肉芽組織目前公認的骨缺損模型為橈骨中段大于1.0階段性缺損。Jhnsn等10指出實驗性骨缺損需要在一些不利于骨生長的環(huán)境中進展，假如骨缺損超過骨干直徑34