肝干細(xì)胞研究進(jìn)展

1、肝干細(xì)胞研究進(jìn)展【摘要】肝移植是目前治療終末期肝病的主要方法，但供肝短缺限制了其應(yīng)用，導(dǎo)致許多患者未能獲得肝移植。近年來，肝干細(xì)胞的別離鑒定、純化培養(yǎng)技術(shù)日漸成熟，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中均獲得了較大進(jìn)展。移植到受體的干細(xì)胞已被證實(shí)可以分化形成正常肝細(xì)胞，從而通過進(jìn)步肝細(xì)胞數(shù)量來改善肝功能，延長(zhǎng)了患者生存期，使其有時(shí)機(jī)獲得肝移植。同時(shí)為急慢性肝損傷、肝代謝性疾病的治療提供了新的細(xì)胞移植療法，成為肝病學(xué)和干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。【關(guān)鍵詞】干細(xì)胞肝進(jìn)展目前肝移植是各類終末期肝病的主要治療方法。但由于供肝的嚴(yán)重缺乏，大大限制了其廣泛應(yīng)用，很多患者因得不到供肝而死亡。肝細(xì)胞移植在等待肝移植的過程中起到橋梁

2、作用，為實(shí)現(xiàn)肝移植帶來希望。但由于可用于移植的肝細(xì)胞數(shù)量缺乏，加之移植后分裂次數(shù)少等原因使其糾正肝功能的作用有限，而干細(xì)胞的出現(xiàn)恰恰解決了這一難題。干細(xì)胞是一類能自我復(fù)制增殖并具有分化為多種類型細(xì)胞潛能的細(xì)胞群，能根據(jù)需要通過控制條件使其分化為需要的、代替受損的或病態(tài)的細(xì)胞，較肝細(xì)胞有更小的免疫排擠反響，可更好地到達(dá)恢復(fù)器官功能、治愈疾病的目的。對(duì)肝干細(xì)胞的研究已進(jìn)入臨床前期和臨床試驗(yàn)階段，具有重大臨床意義和應(yīng)用前景。1肝干細(xì)胞的分類1.1胎肝細(xì)胞胎肝細(xì)胞是胚胎時(shí)期分裂形成肝臟的前體細(xì)胞，較成熟肝細(xì)胞具有更大的增殖潛能。Dabeva等1對(duì)14d大鼠胎肝的細(xì)胞類型分析發(fā)現(xiàn)了一類細(xì)胞同時(shí)表達(dá)肝細(xì)胞

3、和膽管細(xì)胞標(biāo)志，可以分化為肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞，因此被認(rèn)為是肝干細(xì)胞的胚胎來源。Dan等2從74108d人胎肝中別離得到的人胎肝多潛能祖細(xì)胞，體外培養(yǎng)，具有強(qiáng)增殖力，并可分化為肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等其他組織來源的細(xì)胞，在移植入肝病動(dòng)物模型后可分化為有功能的肝細(xì)胞并長(zhǎng)期存活。由于胎肝細(xì)胞易于大量別離培養(yǎng)，因此是很好的移植細(xì)胞供體，但由于來源涉及倫理問題限制了其臨床應(yīng)用。1.2成體肝內(nèi)干細(xì)胞對(duì)成體肝內(nèi)干細(xì)胞的研究已獲得較大進(jìn)展，已成功別離、培養(yǎng)并移植。其中Farber在研究動(dòng)物肝癌模型時(shí)發(fā)現(xiàn)的肝卵圓細(xì)胞是最早發(fā)現(xiàn)并被認(rèn)可的一類肝干細(xì)胞，其形態(tài)特征是細(xì)胞小,僅68，核大，呈卵圓形，核/質(zhì)比例大

4、，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器少，含少量線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核內(nèi)有凝聚的染色質(zhì)，可同時(shí)表達(dá)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的外表標(biāo)志如K-7、K-8、K-18和K-19等。Petersen等3發(fā)現(xiàn)A6陽(yáng)性的肝卵圓細(xì)胞也表達(dá)Thy-1、sa-1、D34和D45等造血干細(xì)胞標(biāo)志。2022年Davies等4利用永生化卵圓細(xì)胞系PIL-2研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶X-2抑制劑S-236可以誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞數(shù)量減少。同年Suzuki等5研究發(fā)現(xiàn)IL-15可以明顯上調(diào)卵圓細(xì)胞的累積，增加肝再生才能。最近Szab等6在研究肝再生模型時(shí)發(fā)現(xiàn)肝卵圓細(xì)胞表達(dá)atrilin-2,認(rèn)為是一種新的卵圓細(xì)胞標(biāo)志。而Jelnes等7在研究不同類型的肝再生模型時(shí)發(fā)現(xiàn)卵圓

5、細(xì)胞具有明顯的異質(zhì)性。除卵圓細(xì)胞外在成體肝內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了其他的肝干細(xì)胞。itaka等8從成體大鼠肝內(nèi)別離到與卵圓細(xì)胞類似的細(xì)胞，稱為“小肝細(xì)胞，大小是成熟肝細(xì)胞的1/31/2，呈單核、低分化形態(tài)，在培養(yǎng)中形成克隆并分化為有功能的成熟肝細(xì)胞。Fujikaa等9從成體小鼠肝內(nèi)別離甲胎蛋白alpha-fetprtEin，AFP，AFP陽(yáng)性細(xì)胞具有未分化內(nèi)胚層細(xì)胞的特征，體外培養(yǎng)可以分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞。Khuu等10在人原代肝細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)肝上皮細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞和干細(xì)胞的標(biāo)志，認(rèn)為是另一種人肝干細(xì)胞。ere等11從人HepaRG細(xì)胞群中別離到了具有雙向潛能的肝干細(xì)胞，體外培養(yǎng)可以分化為肝細(xì)

6、胞樣和膽管細(xì)胞樣細(xì)胞，認(rèn)為也是一種肝內(nèi)干細(xì)胞。1.3骨髓來源的干細(xì)胞很多學(xué)者認(rèn)為造血干細(xì)胞可以作為肝干細(xì)胞的肝外來源。Avital等12研究證實(shí)從骨髓別離的造血干細(xì)胞移植入受體后，可整合到受體肝板，分化為成熟肝細(xì)胞并合成尿素。Harris等13以綠色熒光蛋白報(bào)告基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞并進(jìn)展性別穿插移植實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分化的肝細(xì)胞沒有表達(dá)熒光蛋白，且仍為雙倍體，進(jìn)一步證實(shí)了骨髓造血干細(xì)胞可橫向分化為肝細(xì)胞。而Grpe14認(rèn)為骨髓來源的肝細(xì)胞是通過細(xì)胞交融而不是分化為肝細(xì)胞。而h等15研究發(fā)如今一定生理?xiàng)l件下，一局部肝細(xì)胞可以來自骨髓，沒有發(fā)生細(xì)胞交融。除骨髓造血干細(xì)胞外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、基質(zhì)干細(xì)胞也被認(rèn)為是

7、肝干細(xì)胞的來源。1.4其他肝外干細(xì)胞目前從許多肝外組織中如胰腺、唾液腺、羊膜和真皮中均發(fā)現(xiàn)了可以分化為肝細(xì)胞的干細(xì)胞。另外胚胎干細(xì)胞ebrynisteell，ES由于具有多潛能，且可以分化為各種細(xì)胞，所以也被認(rèn)為是肝干細(xì)胞的來源之一。2肝內(nèi)干細(xì)胞的定位和來源2.1定位由于缺乏特異性標(biāo)志物，卵圓細(xì)胞在肝臟中的定位較為困難。干細(xì)胞主要位于匯管區(qū)、纖維隔和終末膽管樹即赫氏管周圍。肝臟祖細(xì)胞位于門脈周圍及整個(gè)肝小葉。Burke等16認(rèn)為卵圓細(xì)胞存在于門周區(qū)和肝本質(zhì)內(nèi)。2.2來源肝干細(xì)胞與胚胎時(shí)期的原始肝內(nèi)膽管一樣均表達(dá)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的外表標(biāo)志，因此原始肝內(nèi)膽管細(xì)胞可能是成體肝卵圓細(xì)胞的祖細(xì)胞。Avi

8、tal等12證實(shí)靈長(zhǎng)類動(dòng)物胎肝中存在具有雙重表現(xiàn)型的原始肝臟上皮細(xì)胞，在體外表達(dá)白蛋白、AFP的肝細(xì)胞和表達(dá)K-7、K-19的膽管細(xì)胞，因此認(rèn)為成體肝臟內(nèi)干細(xì)胞是胚胎時(shí)期胎肝中的干細(xì)胞的遺留。也有許多學(xué)者認(rèn)為骨髓是肝內(nèi)干細(xì)胞的來源之一，并且在一定條件下如肝損傷時(shí)可向肝內(nèi)運(yùn)輸補(bǔ)充干細(xì)胞池，參與肝損傷的修復(fù)17。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3臨床前期研究3.1肝干細(xì)胞的別離純化培養(yǎng)因?yàn)楦杉?xì)胞數(shù)量較少，想別離肝干細(xì)胞，首先要使其大量增生，需要建立肝干細(xì)胞增殖模型。最早是1977年SltD和FarberE建立的Slt-Farber模型。1983年Slt等18對(duì)此模型進(jìn)展了改進(jìn)，即目前最常用的肝卵圓增殖模型。

9、另外用乙硫氨酸、N-乙酰對(duì)氨基酚、倒千里光堿、Dipin和D-半乳糖胺等均建立了肝卵圓細(xì)胞增殖模型。Ise等19結(jié)扎大鼠的70%的門靜脈也獲得了肝干細(xì)胞增殖模型。Grdn等20利用兩步膠原酶法從大鼠別離得到小肝細(xì)胞。Nakauhi21采用FAS法從13.5d小鼠胎肝內(nèi)別離得到表達(dá)-etD49f-kitd45Ter119的肝干細(xì)胞。2022年Stap等22使用免疫磁珠別離法和單克隆抗體GT-5從人胎肝中別離到人肝胚細(xì)胞和肝膽上皮細(xì)胞亞群。熒光活化細(xì)胞法和免疫磁珠法均需要特異性抗原和抗體，由于目前還未發(fā)現(xiàn)肝卵圓細(xì)胞確實(shí)切外表標(biāo)志，此類方法仍需改進(jìn)。肝干細(xì)胞的體外培養(yǎng)較困難，因?yàn)樵隗w外干細(xì)胞很容易自

10、身分化為肝細(xì)胞而失去增殖才能，目前的研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)和飼養(yǎng)層有利于干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。Suzuki等5利用層黏連蛋白包被培養(yǎng)板并參加肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子hepatytegrthfatr,HGF，50ng/L獲得了干細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞克攏nga等23在培養(yǎng)液中參加HGF、SF、Flt-3后培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)肝干細(xì)胞可大量增殖，而He等24在培養(yǎng)板中參加PREF即成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，結(jié)果有飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板中肝干細(xì)胞增殖明顯并保持未分化狀態(tài)3個(gè)月，而無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板中肝干細(xì)胞很快分化。3.2肝干細(xì)胞移植肝干細(xì)胞移植借鑒了肝細(xì)胞移植的方法。Kusan等25認(rèn)為在肝臟未發(fā)生較大構(gòu)造破壞時(shí)是最正確移植部位，而當(dāng)肝臟嚴(yán)

11、重受損時(shí)不利于干細(xì)胞的成活，需要異位移植。而在所有肝外器官中脾臟是肝細(xì)胞的最正確部位。移植方式以經(jīng)門靜脈注入干細(xì)胞和脾內(nèi)注射兩種方法最為常用。Avital等12用骨髓干細(xì)胞懸液經(jīng)近側(cè)門靜脈注入，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在肝臟內(nèi)增殖狀況良好。atsusaka等26采用夾閉脾門處?kù)o脈將干細(xì)胞懸液注入脾內(nèi)，然后結(jié)扎門靜脈左支的方法增加細(xì)胞在脾內(nèi)著床的時(shí)機(jī)。Fang等27在將干細(xì)胞移植入肝硬化小鼠的肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)肝損傷程度減輕，并且移植的干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞并表達(dá)白蛋白。Kashfer等28將純化的造血干細(xì)胞移植入I型酪氨酸血癥模型大鼠體內(nèi)，重建了肝臟的生化功能，緩解了病情。最近，Yu等29報(bào)道將表達(dá)HGF的間充質(zhì)干細(xì)胞

12、植入大鼠肝移植模型后發(fā)現(xiàn)植入的干細(xì)胞與受體肝交融并分泌白蛋白，說明干細(xì)胞移植可以改善肝再生。4臨床研究目前研究最多的是骨髓造血干細(xì)胞和外周血干細(xì)胞自體移植。2002年Kuar等30報(bào)道，對(duì)1例原發(fā)性淀粉樣變患者肝移植術(shù)后淀粉樣變復(fù)發(fā)施行自體骨髓干細(xì)胞移植，28個(gè)月后發(fā)現(xiàn)其病癥體征明顯改善。2022年Arai等31報(bào)道，對(duì)43例爆發(fā)性肝衰竭fulinanthepatifailure，F(xiàn)HF患者和45例急性自限性肝炎auteself-liitedhepatitis，AH患者進(jìn)展血PNstepntin檢測(cè)比擬，發(fā)現(xiàn)FHF平均血PN程度高于AH患者P=0.003，而且PN高的患者預(yù)后較差。同年Tsaa

13、ndas等32對(duì)77例丙型肝炎的肝活組織檢查標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn)肝祖細(xì)胞hepatiprgenitrell，HP的表達(dá)與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，并由此提出HP的生長(zhǎng)和增殖可以作為預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。Katnizadeh等33對(duì)74例急性亞急性重癥肝損傷患者的肝活組織檢查進(jìn)展分析發(fā)現(xiàn)，組織中增生肝細(xì)胞和HP的比例與臨床肝損傷程度呈正相關(guān)，肝細(xì)胞損失和HP活化較少，而成熟肝細(xì)胞大量增生的活組織檢查標(biāo)本的患者生存率較高。Gupta等34報(bào)道，對(duì)12例先天性肝硬變患兒行自體干細(xì)胞移植，5例因肝硬變進(jìn)展死亡，7例存活，其中4例膽管炎消失，5例有黃便，3例肝硬變硬度減輕，6例肝功能改善，6例食欲進(jìn)步，肝膽管掃描4例膽汁排泄改善，病理學(xué)組織檢