熒光PCR定量質(zhì)量控制及防污染措施

1、解放軍第三0二醫(yī)院王海濱寫在課前的話近幾年在臨床檢測病毒核酸和細(xì)菌核酸上，熒光定量PCR技術(shù)越來越廣泛。但是如何進(jìn)行治療控制以及出現(xiàn)污染后怎樣進(jìn)行清除污染？本文主要講述怎樣來防止污染的產(chǎn)生。一、熒光PCR定量的概述（一）熒光PCR定量的原理實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。常規(guī)的PCR也就是電泳PCR它是合成一個正向引物和反向引物為目的模板，即DNA或RNA乍為一個模板擴(kuò)增，擴(kuò)增后通過跑電泳的方式來檢測它存在與否，是相對量的變化。由于跑電泳經(jīng)常導(dǎo)致產(chǎn)物外泄，因此污染的幾率比較高。近幾

2、年P(guān)CR擴(kuò)增時在參入一對引物的同時參入單個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記單個報告熒光基團(tuán)和單個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5端3端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有單個熒光分子構(gòu)成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物構(gòu)成完全同步。通過熒光物質(zhì)參入和 TapMan探針技術(shù)來做實(shí)時熒光PCR避免了電泳檢測結(jié)果的過程 ，使整個PCF過程從擴(kuò)增到檢測都在一個封閉的狀態(tài)。熒光集團(tuán)目前臨床常用的有兩個，一個是SYBFgreen，個是TapMan

3、探針。SYBRgreen是一類熒光染料，能 與所有的DNA雙鏈 相結(jié)合，對DNA模板沒有選擇性，所以特異性不如 TaqMan探針。變性后雙螺旋變成單鏈， 然后作為擴(kuò)增的模板。在擴(kuò)增的過程中由變性到負(fù)性擴(kuò)出了另一條鏈和模板DNA進(jìn)行退火變成雙鏈。這時SYBRgreen染料與DNA雙鏈結(jié)合，發(fā)出熒光信號。 用SYBRgreen熒光染料來 作為指示劑時，中間要加一個溶解曲線來證實(shí)它的特異性的問題。另一個是TapMan探針，在兩個引物中間設(shè)置一條特異性的探針，它標(biāo)記有熒光染料通過激發(fā)和檢測的過程來檢測特異性擴(kuò)增模板的存在。（二）PCR原 理圖（三）定量原理定量原理：初始模板量的對數(shù)與 C（T）循環(huán)數(shù)之

4、間的線性關(guān)系。初始DNA量越多，熒 光達(dá)到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數(shù)越少。域值Ct值，熒光曲線由潛伏期進(jìn)入對數(shù)期的拐點(diǎn)。Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系（如圖二），根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量圖一為PCR擴(kuò)增曲線圖二為：標(biāo)準(zhǔn)曲線TaqMan探針法TaqMan探針法是高度特異的定量 PCR技術(shù)，其核心是利用 Taq酶的3p5p夕卜切核 酸酶活性，切斷探針產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。 在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對PCR引物和一條 探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間探針的5p

5、端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter , R),女口 FAM、VIC等，3p端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher , Q), 如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時候，報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測 不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3p宀5p外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣， 有一個同步指數(shù)增長的 過程。信號的強(qiáng)度代表了模板 DNA的拷貝數(shù)。二、質(zhì)量指標(biāo)熒光PCR質(zhì)量控制。一個好的結(jié)果必須有一個好的試劑，有合格的操作人員，有合格的環(huán)境等

6、因素。（一）特異性首先一個好的試劑要有特異性?，F(xiàn)在臨床檢驗(yàn)用的試劑，都是要求國家藥監(jiān)局所批的試劑，因此它序列的特異性都是通過專家所認(rèn)證的。但是用SYBR green染料進(jìn)行定量時，要注意在放射學(xué)應(yīng)用之前或在確定放射學(xué)是不是可用時，要通過溶解曲線來對這個方法做一個特異性的評價。另外要注意交叉性的問題，特別是做細(xì)菌16SRNA的檢測，試劑制備是在國家嚴(yán)格要求的GMP廠房里生產(chǎn)。試劑出廠后運(yùn)輸?shù)綑z測單位，他們使用的環(huán)境基本上不具 備GMP廠房的條件。因此如果檢測的試劑要求比較高，在GMP廠房或在一個標(biāo)準(zhǔn)的 PCF實(shí)驗(yàn)室里面才能做的比較合格，而在一個現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室，雖然通過驗(yàn)收但是環(huán)境要比 GMRT房要

7、 求的環(huán)境差，所以兩個應(yīng)該有同步性。就是說在GMP廠房好的條件下生產(chǎn)的試劑，放到現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室里面也應(yīng)該得到同樣一個實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果我們現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)條件出現(xiàn)了交叉性的污染問題，即我們環(huán)境里面就存在一個16SRNA這樣的菌株，那我們現(xiàn)有的檢測結(jié)果就沒有可靠性。（二）敏感性一個好的試劑要有好的敏感性。有的專家想通過增加模塊擴(kuò)增的量來提高敏感性，我們認(rèn)為是不科學(xué)的，從低碳的境地來講也是不科學(xué)的。目前我們所做的實(shí)驗(yàn)，加入模板的量是微量的，有的是3ul，有的是5ul ,最多的是10ul。常規(guī)的應(yīng)用PCR反應(yīng)體系一般是 30 50ul。一些進(jìn)口的試劑用了 100ul，這樣成本實(shí)際價格也非常高。我們現(xiàn)在3050u

8、l的反應(yīng)體系下，一般模板的量在510ul就足夠。如果從510ul變成了 1020ul，雖然可以提高1倍的敏感性。但是里面的干擾物質(zhì)會相應(yīng)的增加，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。(1 )擴(kuò)增效率試劑本身的擴(kuò)增效率應(yīng)該是最佳的擴(kuò)增效率，對檢測模板所設(shè)定的引物和探針的位置 不唯一，它有好多位置，好多序列都可以設(shè)計(jì)。但是在不同的區(qū)域設(shè)計(jì)的不同引物和探針， 它擴(kuò)增的效率可能有很大的差別。對于一個勢力雄厚或有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)體公司常常是設(shè)計(jì)很多條 引物和探針，并且精確到個別堿基，然后通過理論、軟件，更重要要通過實(shí)踐的篩選，篩選 出活性效率比較最高的一套引物和探針來制作試劑。在整個PCRT增反應(yīng)的效率和敏感性上，我們把它比喻成是

9、跑步和跳高的關(guān)系。如圖三所示。這是典型的一個 PCRT增實(shí)時熒光曲線，擴(kuò)了 45個循環(huán)。我們可以看到 從擴(kuò)增的初期在沒有熒光信號的情況下逐漸擴(kuò)增，擴(kuò)增到12個循環(huán)后檢測到了陽性的擴(kuò)增信號，這個信號越來越放大，然后在10個信號左右達(dá)到平臺期。這條藍(lán)線是基線即為 CT值, 從第一個循環(huán)到第十二循環(huán)沒有跑步，十二個循環(huán)之后開始跑，跑到最近也是最快的量是最大的。再上后整個模板里，含量最低的在最后，也達(dá)到了極限，這就是跑步。跳高就是達(dá)到 平臺，量最大的標(biāo)本，這個反應(yīng)孔達(dá)到一個高平臺，量最少的反應(yīng)孔也應(yīng)該達(dá)到與量最大的同樣一個平臺度，這就是跳高。不管原始模板量高中或低，一個好的試劑應(yīng)該以同樣的比例和速率往

10、前移，移到最快，即跑的最快同時跳的最高。最后含量最低的這個反應(yīng)孔也要跳到 同樣的高度，這是一個好試劑的標(biāo)準(zhǔn)。曾經(jīng)對國內(nèi)的試劑進(jìn)行一個考核比較，發(fā)現(xiàn)同樣一個高中低的模板，按照理論擴(kuò)增時，有的試劑擴(kuò)增效率開始跳的還很高，后來越跳越矮，這個實(shí)體生產(chǎn)廠家在探針設(shè)計(jì)合成或它的質(zhì)量、比例、數(shù)量等有問題，Taq酶的活性也非常重要。圖三：Amplificati on Plots(2)添加劑添加劑，目前為了防止擴(kuò)增污染的，好多試劑公司，包括衛(wèi)生臨檢中心也要求，在實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系要加入一些 UNG酶，UNG酶 可以有效的防污染，但是UNG酶 在防污染的同時在95C 35分鐘要對它進(jìn)行滅活，否則它會影響以后的擴(kuò)增。9

11、5C 35分鐘能不能把UNG酶 滅活？后來我們做了 一些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)95C 5分鐘很難徹底的把 UNG酶 滅活，因 此它的存在對試劑的敏感性產(chǎn)生了影響，特別是對低拷貝反應(yīng)孔的擴(kuò)增產(chǎn)生抑制的作用。另外關(guān)于內(nèi)標(biāo)的問題，一個好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最重要的體現(xiàn)在重復(fù)性上，雖然敏感性越高越好， 但是更重要的還是重復(fù)性，臨床醫(yī)生更注重同一個標(biāo)本在不同次檢測應(yīng)該獲得同樣一個值， 雖然在基因檢測里不可能達(dá)到完全相同，但至少要在一個范圍之內(nèi)。重復(fù)性影響重復(fù)性的因素有很多。第一，儀器間的差異，能夠拿到臨床應(yīng)用的這些儀器間的差異不是特別大，但是在儀器使用過程中會有好多影響因素。儀器使用不當(dāng)、電壓不穩(wěn)或維護(hù)不當(dāng)常常導(dǎo)致不同臺儀器

12、的差異比較大。儀器的廠家要及時對儀器進(jìn)行維護(hù)、保養(yǎng)。第二，輔助儀器，離心機(jī)、移液器 等，對于微量的實(shí)驗(yàn)比較重要。對于需要離心、沉淀或提純的實(shí) 驗(yàn)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和定位時間要準(zhǔn)，離心機(jī)的校準(zhǔn)也非常重要。第三，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，包括空間環(huán)境和結(jié)構(gòu)環(huán)境， 為了防止污染盡可能要做一個物理的分割，也就是核酸的提取、 擴(kuò)增和試劑配制要通過物理分割的方式分開。第四，實(shí)驗(yàn)室的溫度，用Trizol 試劑來沉淀或提取RNA如果冬天外界溫度比較低，Trizol 就會結(jié)晶、沉淀，它裂解病毒的效率就要明顯的低下，這時經(jīng)常出現(xiàn)假陰性。第五，操作人員是非常重要的一個因素，不同單位很難進(jìn)行規(guī)范統(tǒng)一的一個方面，就是操作人員的專業(yè)素質(zhì)

13、問題。如圖四所示跳的高度都不一樣， 如果把基線放到不同的位置，結(jié)果就不一樣，因?yàn)橛行┑胤匠霈F(xiàn)交叉。 這雖然是不同的反應(yīng)孔，單孔來看還是一個典型的S型曲線。但是熒光 PCR定量時4個標(biāo)準(zhǔn)品或者3個標(biāo)準(zhǔn)品，它是同時形成一個標(biāo)準(zhǔn)曲線，生成一個定量的尺度范圍，然后來定量，因此我們更強(qiáng)調(diào)不同的反應(yīng)孔放在一塊兒進(jìn)行分析，要求不同的反應(yīng)孔之間都是平行的，也就是說最后應(yīng)該是同樣的一個效率。圖四為：PCR擴(kuò)增曲線三、質(zhì)量環(huán)節(jié)（一）核酸提取方法（核酸丟失）的影響不同單位用購買的試劑盒進(jìn)行操作的過程中，即核酸提取的過程，是影響質(zhì)量的一個重要的原因。對熒光定量來說，標(biāo)本里的核酸量的變化應(yīng)該是唯一量的變化，相應(yīng)的其他過

14、程不應(yīng)該有量的變化，這才是一個標(biāo)準(zhǔn)。PEG6000、蔗糖T等濃縮法：變量多如離心速度及時間、去上清、裂解液加入量、混勻程度差異等均導(dǎo)致核酸丟失。如果除了需要檢測的模板量變，在我們使用過程中又導(dǎo)致了檢測的物質(zhì)里的量發(fā)生變化，定量的結(jié)果會受到很大的影響。核酸提取的方法有好多，目前最常用的是熱裂解的方法 。丙肝病毒或甲流H1N1的檢測常用層析柱，還有目前越來越流行用磁珠的方法被動吸附。TRIZOL的方法逐漸被淘汰，因?yàn)橐皇撬卸?，二是它丟失的核酸比較多。近幾年又出現(xiàn)血 清直接加入法（核酸釋放劑），目前主要是有四種：第一是聚乙二醇，即熱裂解法；第二是層析柱的方法；第三是磁珠提純法；第四是 TRIZOL

15、沉淀提純法；第五是 血清直接加入法（核酸釋放劑），這些方法除了第五種沒有丟失，但第五種存在把血清加進(jìn)去是不是有干擾物質(zhì)的問題，前四種都有核酸的丟失。（二）PEG提取法核酸丟失情況我們對PEG提取法核酸丟失情況做了一些實(shí)驗(yàn)，它的做法是先用100ul裂解液A和100ul的血清混勻，然后高速離心，把上清液去掉，去掉的上清液是不是還有病毒？然后把去掉的上清液再做同樣的過程，發(fā)現(xiàn)上清液不但有丟失，而且丟失的很多。如圖五所示，2X 108 , 4 X 106、1 X 105、1X 103，四個不同濃度的血清通過 PEG提取法 的方法，把離心 之后去掉的上清液再做一個提取， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅色是上清液檢測的量，

16、藍(lán)色是原液，相應(yīng)的丟 失率分別為 5.8%、24.8%、16.0%、16.7%。圖五為PEG提取法核酸丟失情況上清去掉后對沉淀的物質(zhì)加入堿性裂解液進(jìn)行吹打混勻然后煮沸再離心。試劑盒的要求是振蕩混勻，但是把吹打混勻和振蕩混勻的結(jié)果進(jìn)行對比，如圖六左所示：藍(lán)柱是吹打混勻，紅柱是振蕩混勻。吹打混勻得到的量相對要高一些，可見先吹打再煮沸比簡單的震蕩混勻要充分的多。因?yàn)檎袷幉荒軐⒊恋淼念w粒完全振開，自然裂解就不充分。因此，上清液的丟失，和沉淀顆粒的混勻方式對結(jié)果影響還是比較大的，從圖上可以 看到對于第次方的丟失率甚至可達(dá)百分之百。圖六為吹打混勻和震蕩混勻的比較（三）層析柱核酸丟失情況下面對HCV RNA

17、核酸提取常用的層析柱方法，進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)有兩個丟失的步驟。一，標(biāo)本通過胍鹽裂解后要過層析柱，過層析柱后濾下來的部分液體，里面是否有核酸？我們做了連續(xù)4次的過濾，濾下來第一濾拿出來，再濾第二濾，共做四次，然后再分別定量，結(jié)果如圖七所示。濾液一為1.32 X 106 ,濾液二為3.95 X 105 ,濾液三1 X 105,濾液四為1 X &。 因此可以看出過濾過程核酸的丟失程度還是非常嚴(yán)重的。濾完后層析柱通過洗滌液A、洗滌液B進(jìn)行離心、洗滌，洗滌過程的丟失這里先不考慮。單看最后一步洗脫過程，此處要加50ul洗脫液對層析膜上的核酸進(jìn)行洗脫。第一次加50ul離心洗脫的部分為第一份。然后再加50ul洗出第

18、二份，依次連續(xù)洗四次。最后得出的數(shù)據(jù)和剛才的基本一致，也有接近20%- 50%勺丟失。圖七為層析柱核酸丟失情況如果將兩次的丟失疊加， 就有近乎80% 100%勺丟失，當(dāng)然中間還有兩次洗滌還沒計(jì)算 在內(nèi)。由此可見層析柱的方法核酸的丟失是非常明顯的，丟失率為一倍以上。如果標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品的提取是同步進(jìn)行的，那么這種定量的結(jié)果還是具有可比性的。但現(xiàn)在的試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品往往是不參與提取的，也就是標(biāo)準(zhǔn)品不丟失，而標(biāo)本卻丟失嚴(yán)重的，這時要注意，如果標(biāo)準(zhǔn)品是通過 WHO!標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品，那么檢測到的實(shí)際值應(yīng)該是偏低的。PEG提取法吹打混勻和振蕩混勻的結(jié)果進(jìn)行對比：U A.吹打混勻得到的量相對要高一些目B.振蕩混勻得到

19、的量相對要高一些C. 一樣高日D.無法比較吹打混勻得到的量相對要高一些振蕩混勻得到的量相對要高一些一樣高無法比較哪些因素影響PCR熒光定量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?產(chǎn)生污染的原因有哪些？如何防止污染的產(chǎn)生？臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室近年來在我國發(fā)展很快，基因 診斷技術(shù)在疾病的預(yù)防、診斷、治療方面起到了積極的作 用。由于基因擴(kuò)增檢測技術(shù)的應(yīng)用對實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件、 儀器設(shè)備、試劑耗材、人員技術(shù)能力和質(zhì)量控制等方面要 求嚴(yán)格。為了規(guī)范實(shí)驗(yàn)室，保證基因擴(kuò)增技術(shù)有效應(yīng)用， 防止假陰性、假陽性結(jié)果的報出，為臨床出具合格而可靠 的報告，規(guī)范臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室是必然而且也是必要的。（四）其他影響因素當(dāng)然對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響還有包括儀器

20、的差異，不同采光的原理、光源的強(qiáng)度。這里要強(qiáng)調(diào)光源的強(qiáng)度，因?yàn)闊晒釶CR儀器是通過光源照射以后來激發(fā)檢測的，那么該光源是有一定壽命的，如果光源使用時間比較長，光亮度不夠，那么檢測的信號也相應(yīng)會比較弱一些。這對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，特別是對弱陽性的結(jié)果影響會比較大。最后還有專業(yè)人員操作的一個差異 也會對結(jié)果造成影響。因此對結(jié)果的影響因素，除了試劑盒的質(zhì)量以外，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境、操作人員的素質(zhì)，包括試劑操作方法的差異， 都是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。 特別是不同的提取方法， 如聚乙 二醇法、層析柱法和沒有提到的磁珠法， 同樣存在因被動吸附引起的丟失的問題。 而這些都 會影響到整個實(shí)驗(yàn)的均一性。哪些因素影響PCR熒

21、光定量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?四、污染與防污染措施大家也許知道1998年時PCR僉測技術(shù)在國內(nèi)基本上是停用的，主要原因是當(dāng)時在國內(nèi)用的比較亂，有些鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)院也做 PCR僉測，也可以有一個跑電泳的房間，通過電泳結(jié)果來出臨床報告。當(dāng)時很多實(shí)驗(yàn)室做什么試驗(yàn)都是陽性的，也就是說當(dāng)時的污染非常嚴(yán)重。因此 98年停用以后經(jīng)過幾年的整頓，衛(wèi)生部要進(jìn)行嚴(yán)格的PCF實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收，同時進(jìn)行人員培訓(xùn)以及對試劑逐漸過渡到熒光 PCR通過一個閉管檢測的方式，大大減少了污染。但是目前污 染還是存在，主要原因是核酸提取還是開放性的，同時產(chǎn)物的處理還不嚴(yán)格。 更重要的是試劑盒里面的標(biāo)準(zhǔn)品都是陽性的模板，有的是質(zhì)粒，有的是合成的序列，有的是血

22、清，不管是怎樣都是陽性的物質(zhì)，因此常常也是污染的重要來源。目前實(shí)驗(yàn)室防污染主要是，一防止核酸提取過程的外泄 ；二在試劑配制的過程中防止標(biāo)準(zhǔn)品的污染；三要防止產(chǎn)物的外泄。實(shí)驗(yàn)室要嚴(yán)格的分區(qū)管理， 就是物理隔離，核酸提取 和試劑配制不能在一起，試劑配制要盡可能在核酸提取的前方。人員和用的物品要完全不同，就是不要把核酸提取的物品帶到試劑配制室里去。要通過嚴(yán)格的分區(qū)，工作服和使用器具的更換來達(dá)到相互不污染的目的。其次，要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)，一定要有對流風(fēng)。有的實(shí)驗(yàn)室為了達(dá)到這個通風(fēng)，可以 安裝排風(fēng)扇。實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)是防污染的非常重要的方法。|不要指望把污染物質(zhì)給清掉，而是應(yīng)該把它污染從實(shí)驗(yàn)室趕走。通過通風(fēng)

23、的方式把實(shí)驗(yàn)室里面的污染物質(zhì)帶走這是最有效的方法。實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，最早的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)是一個閉風(fēng)的狀態(tài)，現(xiàn)在都變成了一種通風(fēng)的狀態(tài)。另外，有效的消毒對防污染也有作用，不管是提取的核酸還是擴(kuò)增的產(chǎn)物。包括84消毒液，健之素等，都可以對序列起到破鏈的作用。對實(shí)驗(yàn)室的操作臺和其他物品，只要是不怕水，耐腐蝕都要通過有效氯消毒液進(jìn)行浸泡、擦拭最后清水洗凈的方法來清潔。通過一些實(shí)驗(yàn)室也發(fā)現(xiàn)酒精擦拭或通過高壓處理的方式都達(dá)不到清除污染的一個目的。因?yàn)楦邏褐荒馨鸦畹臇|西壓死，對細(xì)菌滅菌是有效的，但對序列就很難破鏈。紫外線照射也是如此，雖然對產(chǎn)物有一定的破鏈作用，但是對提取的核酸大片斷的破鏈效果還是較差的。最后，人員培

24、訓(xùn)也非常重要，對于以前沒有這方面意識的人員的培訓(xùn)必不可少。不具 備防污染意識的人員盡可能不要操作實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)生污染的原因有哪些？如何防止污染的產(chǎn)生?五、關(guān)于內(nèi)標(biāo)的討論（）實(shí)時熒光定量 PCR無需內(nèi)標(biāo)實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。（1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時 微小誤差尚未放大，因此 Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管 內(nèi)擴(kuò)增，得到的 Ct值是恒定的。（2）Ct值與

25、起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量 PCR是 一種采用外標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)本同步進(jìn)行核酸提取的曲線定量方法。（二）內(nèi)標(biāo)對實(shí)時熒光定量 PCR的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。正因如此，定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，仍為一種半定量方法。美國Texas大學(xué)的科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。Applied Biosystems 公司的7700型實(shí)時熒光定量 PCR儀是全球公認(rèn)的熒光定量 PCR 的金標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，而不用內(nèi)標(biāo)、卄“一 曰.進(jìn)行定量。(三)內(nèi)標(biāo)的失敗率我們對采用3家公司考核試劑內(nèi)標(biāo)失敗率進(jìn)行分析，3