家兔血漿中龍膽苦苷濃度的高效液相色譜測定

1、家兔血漿中龍膽苦苷濃度的高效液相色譜測定【摘要】目的建立家兔血漿中龍膽苦苷的HPL檢測方法,研究秦艽中龍膽苦苷在家兔體內(nèi)的藥代動力學規(guī)律。方法以秦艽水煎醇沉液家兔耳靜脈注射后定時取血,色譜條件:SHI-PAKVP-DS色譜柱(1504.6,5);流動相:甲醇-乙腈-水51085;檢測波長:271n;流速:1.0lin-1，測定血漿藥物濃度，采用DAS軟件計算藥動血參數(shù)。結(jié)果龍膽苦苷血藥濃度在0.683136.6gl-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9995),最低定量濃度為0.0342gl-1。日內(nèi)、日間精細度均小于10,回收率為89.8101.4.3。藥-時曲線符合三房室模型，主要藥動學參數(shù)：

2、Tax=0.083h，ax=45.1gL-1，V=1.312Lkg-1，L=0.761Lh-1kg-1，t1/2=1.195h,AU(0)=30.78gL-1h-1。結(jié)論該方法具有準確、簡便、快速的特點,可用于秦艽中龍膽苦苷的檢測。【關(guān)鍵詞】龍膽苦苷；高效液相色譜法；血藥濃度；藥動學秦艽作為一種常用的傳統(tǒng)中藥,野生品種早已不能滿足臨床需要，栽培秦艽開發(fā)利用尚處于起步階段，對其的研究多見于化學成分及藥效學方面，少有對藥動學的研究。有報道龍膽苦苷在Beagle犬體內(nèi)的藥動學過程表現(xiàn)為靜脈內(nèi)給藥一房室模型1;大鼠灌胃給予含龍膽苦苷藥物后2；用HPL法測定龍膽苦苷呈靜脈外給藥的二房室模型。龍膽苦苷是裂

3、環(huán)烯醚萜苷類化合物，極性大，吸收較少，靜脈外給藥其血藥濃度均較低。為此本實驗選擇兔耳靜脈注射秦艽水煎醇沉液，用HPL法定量測定家兔體內(nèi)龍膽苦苷的藥動學過程。1材料與儀器1.1藥品三年生栽培秦艽采于寧夏六盤山藥材栽培基地(由寧夏六盤山藥材栽培基地張守宗高級農(nóng)藝師提供)，經(jīng)寧夏藥檢所邢世瑞主任藥師鑒定原植物為秦艽GentianaarphyllaPall.的生藥材；按中藥制劑藥理學實驗的常規(guī)制備方法制備秦艽水煎醇沉液1.0g/l以生藥計，于冰箱內(nèi)冷藏保存。1.2試劑與藥物龍膽苦苷對照品中國藥品生物制品檢測定所，批號：770-200105。乙腈、甲醇美國TEDIA，色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分

4、析純。1.3儀器日本島津L-20A系列高效液相色譜儀(包括L-20AT輸液泵、DGU-20A5在線、脫氣機、SPD-20AV紫外檢測器、SL-20Avp系統(tǒng)控制器、L-slutin色譜工作站)。Explrer電子分析天平(hausrpratin，美國)；UV-2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；高速臺式離心機上海安亭科學儀器廠。1.4動物家兔1.52.5kg，普通級,由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱為SHI-PAKVP-DS1504.6,5;流動相為甲醇-乙腈-水51085；檢測波長271n；流速1.0lin-1。2.2系列對照品

5、溶液的配制精細稱取龍膽苦苷對照品0.00683g至5l容量瓶中,甲醇溶解，定容至刻度,得濃度為1.366gl-1標準貯備液，分別稀釋成6種不同濃度的系列對照品溶液，密封、低溫、避光保存?zhèn)溆谩?.3血清樣品的預處理微量移液器汲取經(jīng)預處理的兔血清200l于2l離心管中，加600l甲醇沉淀蛋白，于渦旋混合器上充分混合30s，離心16000rin-110in，取上清液，經(jīng)0.22的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10l進樣得色譜圖1?？瞻籽逶?in之前有色譜峰，5in后再無色譜峰出現(xiàn)。在一樣的HPL流動相條件下，與龍膽苦苷對照品的保存時間相比擬，確認龍膽苦苷樣品，在上述色譜條件下別離良好，空白血漿內(nèi)源性物質(zhì)無

6、干擾。2.4HPL法測定秦艽中龍膽苦苷血藥濃度2.4.1對照品標準曲線制作取空白血清，參加標準品的血清溶液，配置成6種所需不同濃度的系列標準血清樣品，按照“血清預處理項下操作后測定峰面積，以龍膽苦苷的濃度為橫坐標，以測得的相應峰面積為縱坐標，用最小二乘法進展線性回歸。得回歸方程A7922.7456.52，R20.9995，線性范圍0.683136.6gl-1，最低定量濃度為0.0342gl-1。見圖2。2.4.2回收率實驗精細移取200l空白血清，參加標準品的血清溶液，配制成高、中、低濃度3組各5份，照“2.3項下操作,計算平均方法回收率。結(jié)果見表1。表1龍膽苦苷回收率實驗數(shù)據(jù)略2.4.3精細

7、度實驗取空白血清，參加標準品的血清溶液，按“回收率實驗項下配制不同濃度空白血清樣品各5份，分別測定計算各濃度日內(nèi)精細度，并連續(xù)測定5d，計算日間精細度。結(jié)果見表2。表2龍膽苦苷精細度實驗數(shù)據(jù)略2.5給藥及血液采集取安康家兔6只，秦艽水煎醇提液按2l/kg耳靜脈注射給藥。給藥前取空白血清，給藥后分別在0.08，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，8h經(jīng)耳中動脈取血，約1l/次，置于具塞離心管中，靜置10in后，以3000r/in離心10in，別離血清，在低溫冰箱冷凍保存至測試時。2.6樣品測試從冰箱中取出待測血清樣品，室溫下自然解凍，血樣經(jīng)乙腈預處理后,進展HPL分析,色譜條件同

8、“2.1項。精細量取給藥后血清200l于2l離心管中，按樣品測定方法和預處理方法分別測定各時間點的血藥濃度。結(jié)果見圖1。2.7數(shù)據(jù)處理與分析根據(jù)標準工作曲線，計算家兔血清中龍膽苦苷的血藥濃度，見圖2。采用DAS軟件自動擬合得到有關(guān)的藥代動力學參數(shù)，龍膽苦苷的分布代謝最正確房室模型為三房室模型，主要藥代動力學參數(shù)Tax=0.083h，ax=45.1g/L，V=1.312L/kg，L=0.761Lh-1kg-1，t1/2=1.195h,AU(0)=30.78gL-1h-1。3討論隨著對秦艽藥用價值的研究逐步深化,對秦艽成品藥的開發(fā)也即將進入消費階段，研究秦艽制劑的體內(nèi)過程，對秦艽成品藥的開發(fā)有一定的參考價值。兔耳靜脈注射秦艽水煎醇沉液，進展單劑量藥動學研究，其ax到達45.1g/L,能準確的用HPL進展定量測定。此方法準確、簡便、快速,可用于秦艽中龍膽苦苷的微量檢測。用DAS2.0軟件處理顯示龍膽苦苷的分布代謝最正確房室模型為三房室模型，說明龍膽苦苷在體內(nèi)能維持較長時間穩(wěn)定的治療濃度?！?/p>