食品中微生物檢測課件

1、第四十講 食品中微生物數(shù)量檢測第四十講 食品中微生物數(shù)量檢測食品中微生物數(shù)量的檢測方法1）標準平板計數(shù)法Standard plate count, SPC）2）最近似數(shù)測定法（most probable number,MPN）3）染色還原技術(shù)估算具有還原能力的各種細胞的總數(shù)4）顯微鏡直接計數(shù)法（DMC）食品中微生物數(shù)量的檢測方法1）標準平板計數(shù)法Standard一、樣品采集采樣：指從待檢物中采取少量具代表性的樣品供分析檢驗用。1、采樣要求（1）采樣前，準備好滅菌的容器及采樣工具；（2）無菌采樣；（3）用無菌紙袋或玻璃器皿存放樣品；（4）樣品及時封口，并做好記錄；（5）及時送檢。越快越好，一般不

2、得超過3h。2、采樣原則： 代表性 防止污染3、采樣的種類： 大樣 一整批樣品 中樣 200g 小樣 分析的樣品（檢樣）25g（ml)一、樣品采集采樣：指從待檢物中采取少量具代表性的樣品供分析檢4、采樣方法： 無菌操作 采樣用具必須無菌 盡量采集有包裝的食品； 粉末狀樣品 邊取樣邊混合 液體樣品 邊振搖邊混合 冷凍食品 保持冷凍狀態(tài) 非冷凍食品 保存在05 5、采樣數(shù)量和部位： 200g/件 乳制品 一瓶（個、罐、聽） 糧 三層五點（表、中、下） 油 重點采取表層及底層油4、采樣方法： （1）面包、糕點、方便食品采集方法：取原包裝，用無菌鑷子夾下包裝紙采取外部及中心部位檢樣共200g，帶餡糕點

3、直接采取外皮與內(nèi)陷25g。（1）面包、糕點、方便食品采集方法：（2）豆制品樣品采集：采取接觸盛器邊緣、底部及上面不同部位樣品200g放入滅菌容器內(nèi)。（2）豆制品樣品采集：采取接觸盛器邊緣、底部及上面不同部位樣（3）乳及乳制品散裝或大型包裝：用滅菌刀、勺取樣，每件不少于200g，及時送檢。大型包裝：采用整件原包裝，每件樣品采集量為瓶裝：1瓶 袋裝：1袋 罐裝：1罐（3）乳及乳制品（4）蛋及蛋制品樣品采集：鮮蛋：用流水沖洗外殼，再用95%酒精棉球涂擦消毒后，放入滅菌袋內(nèi)，加封作好標記送檢。全蛋粉、蛋黃粉、蛋白片：將包裝開口處用75%酒精棉球消毒再開蓋，用滅菌的金屬制雙層螺旋式套管采樣器斜角插入箱底

4、，使套管旋轉(zhuǎn)收取檢樣，提出箱外用滅菌小匙自上、中、下部取樣，裝入滅菌廣口瓶中，每個檢樣不少于100克。（4）蛋及蛋制品樣品采集：（5）肉及肉制品樣品采集： 肉類包括鮮肉、凍肉、肉餡、禽肉等，肉制品指火腿、香腸等。生肉：宰后用無菌刀取兩腿內(nèi)側(cè)肌肉各500克或劈半后兩側(cè)背最長肌各50克，立即送檢。家禽：用滅菌棉拭采胸腹各10cm2，背10cm2，四邊各5cm2其他熟制品：一般采200克。（5）肉及肉制品樣品采集：（6）調(diào)味品樣品采集：醬油、食醋：瓶裝 采取1瓶 散裝 無菌吸500ml醬類 用滅菌勺子取500g味精 采取一袋100g（6）調(diào)味品樣品采集：（7）冷食品樣品采集：冷食菜：將樣品混勻，采樣

5、200g瓶裝飲料：兩瓶為一件 散裝采500ml冰淇凌：4杯為一件 散裝采200g，放瓶內(nèi)冷藏或隔熱容器中食用冰塊：食用冰塊取500g（7）冷食品樣品采集：6、采樣標簽：名稱 來源 數(shù)量 編號 時間.7、送檢 從采樣到實驗室越快越好，不得超過3h。6、采樣標簽：名稱 來源 數(shù)量 編號 時間.（一） 傳統(tǒng)的SPC方法標準平板計數(shù)法（Standard plate count, SPC）、平板菌落計數(shù)法意義： 判定食品被微生物污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，也可觀察微生物在食品中生長繁殖的動態(tài)。菌落總數(shù)：在一定條件下，每克（每毫升）樣品中所含CFU（菌落形成單位）。測定方法： 檢測樣品的處理 稀釋 傾注（涂布）

6、平板 培養(yǎng) 計數(shù) 報告國標規(guī)定： 在需氧條件下： 細菌 NA 37 48h 霉菌 酵母 PDA 2528 5天二、 檢測方法（一） 傳統(tǒng)的SPC方法標準平板計數(shù)法（Standard 1、樣品的預處理（1）取樣：無菌操作 25g放入225mL滅菌生理鹽水的無菌瓶內(nèi)（ 1：10稀釋液）（2）均勻混合 ：均質(zhì)器1、樣品的預處理2、稀釋1 ml1 ml1 ml1ml9ml9ml9ml9ml1ml1 ml1 ml1ml1ml1ml 3、傾注平板： 稀釋液移入平皿后，將46 的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL,轉(zhuǎn)動平皿。 空白對照2、稀釋1 ml1 ml1 ml1ml9ml9ml9ml9m4、倒置 培養(yǎng)

7、瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板 細菌 37 48h 霉菌 2 8 5天5、菌落計數(shù)法肉眼觀察；放大鏡； TTC（氯化三苯基四氮唑) 顯色:培養(yǎng)基中加入 TTC作指示劑, 細菌細胞脫氫酶使其還原生成紅色的不溶于水的三苯基甲簪 ( TF)，使菌落中心產(chǎn)生紅色。6、菌落計數(shù)的報告：報告單位： cfu/g(mL)（1）平板菌落數(shù)的選擇： 細菌30300；真菌30-100（2）稀釋度的選擇：（3）菌落數(shù)的報告：100以內(nèi)時， 按實數(shù)報告； 大于100時，兩位有效數(shù)字如：16400 報告為1.641044、倒置 培養(yǎng)（二）旋轉(zhuǎn)接種法（Spiral plate method） 原理：接種針將樣品液以螺旋方式從平板中央

8、往外連續(xù)接種。接種量：0.05mL優(yōu)點：可測定50500000cfu/mL的菌數(shù)；樣品不需事先稀釋；不需做2個重復；接種速度快；結(jié)果可人工計數(shù)，也可用激光計數(shù)器計數(shù)；人力與物力花費成本低廉；測定結(jié)果與傳統(tǒng)方法相關(guān)性高。缺點：設(shè)備投資較高含顆粒樣品容易堵塞管道如果樣品的帶菌量超出范圍則結(jié)果準確性降低對瓊脂平板表面要求高（二）旋轉(zhuǎn)接種法（Spiral plate method） （三）膜過濾SPC方法的改良：過濾膜的孔徑為 0.45um；收集菌體以提高檢出率；直接顯微計數(shù)；膜過濾與熒光染色方法結(jié)合直接熒光膜技術(shù)計數(shù)法（ DEFT ）Direct Epifluorescent Filter Tech

9、nique：微菌落計數(shù)，僅用于活細胞的檢測。 原理：食品勻液經(jīng)DEFT膜過濾，膜放在培養(yǎng)基表面，恒溫培養(yǎng)至微菌落長出，顯微鏡觀察 G- 3h G+ 6h?？焖贆z測技術(shù)：特殊濾膜（0.5um）過濾樣品液 ；濾膜經(jīng)吖啶橙染色；紫外光顯微鏡觀察； 活細胞 橙色熒光 ； 死細胞 綠色熒光 2030min（三）膜過濾SPC方法的改良：過濾膜的孔徑為 0.45um；（四）最近似數(shù)測定法（MPN） 選擇3個稀釋梯度的稀釋液，每種稀釋液接種3管（5管）裝有培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，根據(jù)實驗結(jié)果查MPN檢索表，得到樣品中微生物數(shù)量。MPN的優(yōu)點：方法相對簡單；與SPC相比，相似率較高；用選擇性培養(yǎng)基可檢測特殊的微生物

10、類群；測定大腸菌群數(shù)量的方法。MPN的缺點：需要大量的玻璃器皿（特別是5試管實驗）；不能觀察微生物菌落的形態(tài)；準確性不高。檢驗結(jié)果：用每100mL（g）樣品中大腸菌群最近似數(shù)來表示， 簡稱大腸菌群MPN.（四）最近似數(shù)測定法（MPN） 選擇3個稀釋梯度亞甲基藍（蘭色） 白色刃天青（暗蘭色） 粉紅色或白色染色還原的時間與樣品中微生物濃度成反比兩種染料：（五）染色還原計數(shù)法一種估計活性微生物數(shù)量的方法。原理： 活細胞內(nèi)含有還原酶，可把特定的染料從一種顏色還原為另外一種顏色。 應用： 乳品工業(yè)上原料乳中的微生物檢測優(yōu)點： 簡便、快捷和經(jīng)濟缺點：不同的微生物還原能力不同，給估算帶來了一定的困難。 不適用于含有還原酶的食品亞甲基藍（蘭色） 白色兩種染料：（五）（六）顯微直接計數(shù)法（Direct microscope count, DMC）一定量的食品（0. 1mL）涂布于載玻片（1cm2）上烘干、固定、脫脂、染色顯微鏡計數(shù)，用鏡臺測微尺計算出視野面積則 每ml原樣液含菌數(shù) =視野中平均菌數(shù)涂布面積/視野面積100 稀釋倍數(shù)DMC方法的優(yōu)點：快捷 、簡便； 能對細胞形態(tài)進行分析； 載玻片易保存，作參考；可使用熒光技術(shù)增強效果。缺點：僅適于檢含大量菌體的樣品；準確性差；易造成操作人員的疲勞。（六）顯微直接計數(shù)法（Direct mic