淺析基質(zhì)細(xì)胞衍生因子在哮喘小鼠氣道中的表達(dá)

1、淺析基質(zhì)細(xì)胞衍生因子在哮喘小鼠氣道中的表達(dá)【摘要】目的觀察基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stral-derivedfatr-1,SDF-1)在雞卵清蛋白(VA)誘導(dǎo)小鼠哮喘模型中的表達(dá)，探究哮喘氣道重塑的發(fā)活力制。方法40只雌性SPF級57BL/6小鼠，體重1822g，隨機(jī)分為哮喘組和對照組。按照文獻(xiàn)方法建立VA小鼠哮喘模型。兩組動物于末次霧化完畢后24h處死，取肺組織行病理切片，蘇木精-伊紅染色(HE)觀察肺臟的組織病理學(xué)變化;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒错?RT-PR)、免疫印跡法(esternblt)、免疫組織化學(xué)(iunhistheistry,IH)技術(shù)檢測肺組織SDF-1的表達(dá)。結(jié)果哮喘組支氣管上皮細(xì)

2、胞脫落、氣道壁增厚，細(xì)支氣管和血管周圍有大量炎細(xì)胞浸潤;哮喘組肺組織SDF-1在RT-PR、esternblt及IH中均為陽性表達(dá)，而對照組那么否。結(jié)論小鼠哮喘時肺組織分泌大量細(xì)胞趨化因子SDF-1，可能是哮喘氣道重塑的重要因素之一。【關(guān)鍵詞】基質(zhì)細(xì)胞衍生因子;哮喘;氣道重塑ABSTRAT:bjetiveTstudytheexpressinfstral-derivedfatr-1(SDF-1)intheairayfieithallergiasthainduedbyvalbuin(VA)sastexplretheehanisfasthatiairayredeling.ethdsFrtyfeale

3、57BL/6iefSPFgradeererandlydividedintasthagrupandntrlgrupith20ineah.ieeresensitizedandhallengedithvalbuintestablishtheasthatidel.Alltheieerekilled24hursafterthelastaerslisatin.Theparaffinebeddedsetinsflungtissueserestainedithheatxylinandesin(HE)franalyzingpathlgialhanges.SDF-1RNAextratedfrlungtissues

4、asassessedbyRT-PRhileSDF-1prtEinextratedfrlungtissuesasassessedbyesternbltandiunhistheistry(IH).ResultsAfterrepeatedallergenhallenge,bviusinfiltratinfinflaatryellsandprliferatinfgbletellsandsthuslesappearedinusebrnhi.ArdingtRT-PRandesternbltandIHresults,theexpressinfSDF-1aspsitiveinasthagrupbutnegat

5、iveinntrlgrup.nlusinAlargeauntfSDF-1isseretedinthelungtissuesinasthatiie,hihaybeneftheritialfatrsinasthatiairayredeling.KEYRDS:stral-derivedfatr-1;astha;airayredeling支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥，伴有氣道高反響性和氣道重塑，而氣道重塑那么是一個在慢性炎癥根底上的異常損傷修復(fù)過程?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stral-derivedfatr-1,SDF-1)是由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種X型趨化因子。近年來研究說明，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子對組織或器官

6、的創(chuàng)傷、炎癥損傷修復(fù)起到了重要的作用。但是，SDF-1與哮喘相關(guān)性的研究目前還未見報道，我們就此進(jìn)展了討論。1材料與方法1.1藥品與試劑雞卵清蛋白(VA)級(美國GBI公司);氫氧化鋁干粉(鄭州派尼化學(xué)試劑公司);PBS(美國GBI公司);SDF-1兔抗小鼠一抗(武漢博士德生物);過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(美國DAK公司);EL發(fā)光液(北京碧云天公司);兔抗小鼠內(nèi)參-atin(北京博奧森公司);免疫組織化學(xué)試劑盒(美國DAK公司)。1.2方法1.2.1哮喘模型的制備小鼠哮喘模型實驗參考文獻(xiàn)1，略有變動。實驗動物為40只雌性SPF級57BL/6小鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供)，體重1822g，隨

7、機(jī)分為哮喘組和對照組。按照文獻(xiàn)方法1構(gòu)建哮喘模型：0、7、14d于小鼠腹腔內(nèi)注射致敏液0.2L/只(致敏液為每0.2LPBS溶液內(nèi)含10gVA、20g氫氧化鋁)。于第21天開場0.5g/L濃度的VA生理鹽水溶液霧化，每次30in，隔日1次，共計18次。對照組用空白PBS及生理鹽水，余同模型組。兩組動物于霧化完畢后24h處死，取右肺于40g/L甲醛溶液中固定，石蠟包埋，用于病理觀察及免疫組織化學(xué)(IH)檢測;取左肺于液氮中保存，用于RT-PR及estern-blt測定SDF-1。1.2.2RT-PR法檢測SDF-1的表達(dá)提取肺組織總RNA，分光光度儀上定量及檢測RNA純度，用兩步法RT-PR。S

8、DF-1上游引物：5-ATTT-ATTGGTA-3，下游引物為：5-TGAAG-GGAAGTTTGGAG-3，序列長度約500bp。PR反響條件：94變性30s，57退火30s，72延伸1in，30個循環(huán)。RT-PR產(chǎn)物以10g/L瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在GDS-8000數(shù)碼成像及分析系統(tǒng)上觀察、拍照。1.2.3esternblt法檢測SDF-1的表達(dá)左上肺組織用液氮粉碎及超聲提取總蛋白后，每組取400L總蛋白，參加等體積的2SDS凝膠加樣緩沖液，1005in使蛋白變性;經(jīng)120g/LSDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜;50g/L脫脂奶粉封閉后，SDF-1兔抗小鼠一抗(120

9、0)及兔抗小鼠內(nèi)參-atin(1200)孵育4過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(1500)37孵育2h后，EL試劑進(jìn)展檢測，在FlurheF2成像及分析系統(tǒng)中觀察、拍照。1.2.4免疫組織化學(xué)法檢測SDF-1的表達(dá)哮喘組及對照組肺組織蠟塊連續(xù)石蠟切片，經(jīng)脫蠟至水后以0.3L/L過氧化氫溶液浸泡10in，滅活內(nèi)源性過氧化物酶;抗原熱修復(fù)后以正常山羊血清封閉，分別加一抗即兔抗小鼠SDF-1抗體1200，4過夜;加生物素標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG1200)，37，40in;加新穎配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，顯微鏡下觀察510in，棕黃色染色為陽性信號。1.3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SP

10、SS16.0軟件包行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩樣本t檢驗處理統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)，P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1小鼠的一般情況及肺組織病理學(xué)改變哮喘組小鼠經(jīng)激發(fā)后，出現(xiàn)煩躁不安，呼吸急促，腹部翕動，易激惹;對照組小鼠行動敏捷，一般情況未見異常。哮喘組小鼠肺組織切片HE染色可見，小鼠細(xì)支氣管周圍和血管周圍有大量的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和多形核細(xì)胞浸潤，并伴有上皮脫落，氣道壁增厚。對照組病理切片無上述表現(xiàn)(圖1)。圖1小鼠肺組織的病理學(xué)改變Fig.1HEstainingflunghistlgialsetins(HE,100)A：對照組;B：哮喘組。2.2RT-PR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)

11、果哮喘組于500bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期趨化因子SDF-1擴(kuò)增片段一致;對照組無特異性擴(kuò)增條帶。正常肺組織幾乎無SDF-1RNA，哮喘時肺組織有SDF-1RNA(圖2、表1)。圖2RT-PR法檢測兩組小鼠肺組織SDF-1RNA的表達(dá)Fig.2TheexpressinfSDF-1RNAinasthatiuselungtissuesnRT-PR：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1：哮喘組;2：對照組。表1兩組小鼠肺組織SDF-1RNA的表達(dá)2.3esternblt化學(xué)熒光法的檢測結(jié)果哮喘組于15ku處有特異性條帶顯像，與SDF-1蛋白分子質(zhì)量一致;對照組無特異性條帶顯像。正常肺組織無SDF-1蛋白表達(dá)，哮

12、喘肺組織表達(dá)SDF-1蛋白(圖3、表2)。圖3esternblt化學(xué)熒光檢測兩組小鼠肺組織SDF-1蛋白的表達(dá)情況Fig.3TheexpressinfSDF-1prtEininuselungtissuesnesternblt表2兩組小鼠肺組織SDF-1蛋白的表達(dá)2.4免疫組織化學(xué)(SAB)法的檢測結(jié)果哮喘組可見支氣管上皮細(xì)胞破壞，支氣管和血管周圍有大量炎細(xì)胞浸潤，支氣管壁及周圍大量細(xì)胞于胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色陽性信號;對照組無上述病理變化，無棕黃色陽性信號出現(xiàn)(圖4)。圖4小鼠肺組織SDF-1表達(dá)的IH化學(xué)檢測Fig.4Iunhistheistystainingflunghistlgialsetin

13、s(SAB,100)A：對照組;B：哮喘組。3討論SDF-1是由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的X型趨化因子，有SDF-1、SDF-1，SDF-1三個亞型。X族細(xì)胞因子受體4(XR4)是目前所知的SDF-1的唯一受體。SDF-1基因5末端存在豐富的G序列，而TATA序列那么極少表達(dá)。SDF-1在各物種中有高度保守性，在人與鼠的SDF-1的氨基酸序列中有95%是一樣的2。支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥，伴有氣道高反響性和氣道重塑，氣道重塑是哮喘難以治療的主要因素之一。因此，防止或減輕氣道重塑也就成為防治哮喘的重要策略，是呼吸領(lǐng)域備受關(guān)注的熱點問題。我們采用RT-PR、esternblt方法檢測到哮喘肺組織高表達(dá)SD

14、F-1。進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)SDF-1蛋白質(zhì)主要分布于支氣管壁及周圍細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在多種組織損傷修復(fù)過程中均有SDF-1的參與。例如，留神3、腦4、肝臟5、腎臟6等組織器官損傷時，病灶內(nèi)SDF-1的分泌量顯著增加，促進(jìn)了纖維組織增生和新生血管形成。在博來霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化小鼠模型中，肺組織高表達(dá)SDF-1與肺纖維化有親密關(guān)系7。氣道重塑的本質(zhì)是一個在慢性炎癥根底上的異常損傷修復(fù)過程，因此我們推測：在支氣管哮喘導(dǎo)致氣道重塑的過程中，肺部損傷釋放趨化因子SDF-1可能在支氣管哮喘氣道重塑中起重要作用。現(xiàn)有的研究說明，SDF-1與組織損傷的修復(fù)有著親密的關(guān)聯(lián)，但其是否

15、在哮喘氣道重塑中起到作用，還需要做大量的研究。希望以此為切入點，為治療支氣管哮喘、防止或減輕氣道重塑尋找到新的、更為有效的方法?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1TEELKVSKIJ,HGANSP,SHEPHERDDP,etal.Aniprvedurinedelfastha:seletiveairayinflaatin,epitheliallesinsandinreasedethahlinerespnsivenessfllinghrniexpsuretaerslisedallergenJ.Thrax,1998,53(10):849-856.2URDH.XR4:hekinereeptrextrardinaireJ.

16、IunlRev,2000,177:175-184.3KUIA,DANB,HUNTG,etal.ellsexpressingearlyardiaarkersresideinthebnearrandarebilizedinttheperipheralbldafteryardialinfartinJ.irulatinRes,2022,95(12):1191-1199.4IITLAJ,RADDASSIK,PARKKI,etal.DiretedigratinfneuralsteellstsitesfNSinjurybythestralell-derivedfatr1alpha/Xhekinereeptr4pathayJ.PrNatlAadSiUSA,2022,101(52):18117-18122.5DALAKASE,NESEPN,HARRISNDJ,etal.Heatpie