微生物學(xué)實驗三抗酸染色病毒的接種與培養(yǎng)真菌菌落形態(tài)觀察

1、微生物學(xué)實驗三抗酸染色病毒的接種與培養(yǎng)真菌菌落形態(tài)觀察一、實驗?zāi)康?.掌握抗酸染色方法。2.了解抗酸染色的原理和意義。抗 酸 染 色 Acid fast stain分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用3%鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為蘭色。二、實驗原理 細(xì)菌：卡介苗 （Bacillus Ca

2、lmette-Guerin， BCG） 染液：石炭酸復(fù)紅液、3%鹽酸酒精、堿性美 蘭溶液 其它：接種環(huán)、酒精燈、載玻片等三、實驗材料1、細(xì)菌涂片的制備 涂片 干燥 固定 2、染色1）初染：用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3 滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，加熱35min，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。2）脫色： 3%鹽酸酒精脫色30s1min；用水沖洗。3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1min；用水沖洗后用吸水紙吸干。四、方法與步驟五、實驗結(jié)果未染色 初染后 脫色后 復(fù)染后初染脫色復(fù)染石炭酸復(fù)紅鹽酸酒精堿性美蘭 結(jié)核桿菌呈紅色，常堆積成團(tuán)

3、，排列無序，偶呈分枝狀生長。背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色。六、注意事項1、無菌操作2、染色時間3、初染加熱的溫度，勿沸騰病毒的接種與培養(yǎng)真菌菌落形態(tài)觀察 實驗?zāi)康牧私獠《镜呐囵B(yǎng)方法掌握病毒的雞胚接種及動物接種了解常見真菌的菌落特點一.病毒的培養(yǎng)動物接種法雞胚培養(yǎng)法組織細(xì)胞培養(yǎng)法病毒的分離培養(yǎng) 病毒結(jié)構(gòu)簡單，缺乏完整的酶系統(tǒng)，不能在無生命的人工培養(yǎng)基中生長，必須在活的組織細(xì)胞中才能增殖。1.動物接種（Animal inoculation）最早應(yīng)用的病毒培養(yǎng)法。用途：分離鑒定、傳代、制備免疫血清。缺陷：帶菌，缺敏感動物。常用動物：鼠、家兔、猴和羊等。接種的途徑：腦內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)和靜脈注射等。病

4、 毒 分離材料 實驗動物 接種途徑 接種后癥狀 腦炎病毒 蚊體懸液、尸解腦懸液 小鼠 腦內(nèi)、腹腔 腦炎 柯薩奇病毒A組 咽拭子、糞便懸液、腦脊液、尸解腦懸液 乳鼠（小于3d） 皮下、腦內(nèi)、腹腔 弛緩性麻痹 柯薩奇病毒B組 咽拭子、糞便懸液、腦脊液、尸解腦懸液 乳鼠（小于24h） 皮下、腦內(nèi)、腹腔 震顫、痙攣性麻痹 狂犬病病毒 唾液、腦懸液 小鼠 腦內(nèi) 腦炎 常用動物接種分離的病毒及接種途徑 小白鼠的腦內(nèi)接種1、取病毒懸液：用0.25ml注射器取0.1ml病 毒懸液，去除注射器內(nèi)的氣泡。2、固定小白鼠：用左手大拇指和食指握住小白鼠的頭部，手掌輕輕按住小白鼠的體部。3、消毒注射部位：右手用棉簽蘸以

5、碘酒，消毒小白鼠的右側(cè)顳部皮毛（不碰到眼）。4、接種：右手拿注射器在小白鼠顳部（眼與耳根聯(lián)線的中點略偏耳朵的方向）注入，進(jìn)入顱腔即可，（一般進(jìn)針23mm）不要插得太深。5、觀察：注射完畢，將用過的注射器放入煮沸消毒器內(nèi)，煮沸消毒。實驗動物置于防蚊設(shè)備的室內(nèi)飼養(yǎng)，逐日觀察動物發(fā)病情況。處死小白鼠-頸椎脫臼法2.雞胚接種接種途徑可根據(jù)病毒種類選擇適宜接種部位，如分離流感病毒常用羊水囊和尿囊同時接種法，而痘病毒常采用絨毛尿囊膜接種法 尿囊腔接種法卵黃囊接種法絨毛尿囊膜接種法羊膜囊接種法 常用雞胚分離或鑒定的病毒 病 毒 接種途徑 接種后變化 血清學(xué)診斷所用材料 痘苗病毒 絨毛尿囊膜 痘斑 產(chǎn)生痘斑的

6、絨毛尿囊膜 單純皰疹病毒 絨毛尿囊膜 白斑、核內(nèi)包涵體 尿囊液 流感病毒 羊水囊、尿囊 產(chǎn)生血凝素 尿囊液 腮腺炎病毒 羊水囊或卵黃囊 產(chǎn)生血凝素 羊水 判斷雞胚是否存活在檢卵燈下觀察能否看到清晰的血管；胚胎是否移動；若胚齡過長，則需觀察其胎盤部分，胎盤部分變蒼白說明胚胎死亡，正常時胎盤發(fā)暗，蛋白部分透亮。判斷雞胚是否存活氣室雞胚卵黃囊尿囊腔羊膜腔絨毛尿囊膜卵白卵膜雞胚結(jié)構(gòu)示意圖卵膜絨毛尿囊膜接種法定位：將胎盤部分 及自然氣室部分用記號 筆畫出，在離開胎盤與大血管區(qū)畫一直徑約1cm的等邊三角形卵窗取卵殼：依次用碘酊，酒精消毒記號處，用鋸片將標(biāo)記三角區(qū)卵殼鋸穿，（注意勿損傷卵殼下各層膜組織），取

7、下所畫三角形區(qū)域的卵殼，（注意卵殼下各層膜組織），然后用針尖輕輕將暴露的卵膜中心刺破一個小口（不要傷及絨毛尿囊膜）。造人工氣室：在自然氣室部分消毒后用錐子或大注射器針頭在氣室正中鉆一孔，用橡皮頭自氣室端小孔將氣室中空氣吸出，使絨毛尿囊膜下陷形成一“人工氣室”。接種：去除卵膜，于絨毛尿囊膜上滴上病毒0.10.2ml 。封口：用膠布封口，膠布事先用碘酒消毒，并通過火焰燒去余碘。培養(yǎng)：放入溫箱培育4天，然后收獲病毒。二.真菌菌落的觀察（示教）真菌培養(yǎng)營養(yǎng)要求不高，在一般培養(yǎng)基上能生長常用沙保弱（Sabouraud）培養(yǎng)基（含4%葡萄糖、10%蛋白胨、瓊脂、PH4.06.0），真菌的最適酸堿度是PH4

8、.06.0，最適生長溫度淺部真菌2228 深部真菌37 。真菌菌落類型酵母型菌落（yeast colony） 菌落光滑、濕潤。無菌絲隱球菌菌落類酵母型菌落（yeast-like colony） 外觀和酵母型菌落相似，顯微鏡下可看到假菌絲白色念株菌菌落絲狀型菌落（filamentous colony）菌落系由多細(xì)胞菌絲體所組成大多數(shù)絲狀真菌或霉菌的菌落新型隱球菌：菌落屬酵母型菌落，圓形、較大、白色、邊緣整齊，表面濕潤光滑，與一般細(xì)菌菌落相似 。白色念珠菌：菌落屬類酵母樣菌落，圓形、較大、白色、菌落底層有假菌絲長入培養(yǎng)基內(nèi)。表皮癬菌：菌落屬絲狀菌落，在沙保瓊脂斜面培養(yǎng)基上菌落開始為白色，顆粒狀，以后變?yōu)榻q毛樣甚至粉末狀，有許多輻射狀溝，且培養(yǎng)基常有皺裂。小孢子菌：菌落屬絲狀菌落，在沙保培養(yǎng)基上菌落為棉絮狀、羊毛狀或粉末狀。注意事項消毒小白