三章核酸技術(shù)

1、第三章核 酸 技 術(shù) 1核酸的分離和純化核酸電泳染色體DNA電泳 DNA限制酶切反應(yīng)和限制酶譜繪制 DNA的連接PCR技術(shù)分子雜交技術(shù) 核酸序列的測(cè)定2第一節(jié)核酸的分離和純化3 一、一般程序 1、供體的核酸分離 供體細(xì)胞培養(yǎng) 收集(菌體)細(xì)胞 細(xì)胞破碎 分離總DNA 分離細(xì)胞器 分離總RNA 分離細(xì)胞器DNA RNA poly(A)RNA 特異性RNA 染色體DNA(組建基因組文庫(kù))4 2、載體DNA分離 載體DNA 感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞（病毒型） 轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞（質(zhì)粒型） 分離病毒顆粒 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、收集菌體 病毒載體DNA分離與純化 破碎細(xì)胞 質(zhì)粒DNA分離與純化 3、DNA片段的分離 DNA 限

2、制酶切 凝膠電泳分離 特定DNA片段的回收5 4、質(zhì)量評(píng)估 1）凝膠電泳 2）光密度值測(cè)定 3）限制酶切分析二、細(xì)胞裂解 1.酶法： 利用某些細(xì)胞壁裂解酶使細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體，然后加去垢劑使原生質(zhì)體裂解。 1) 細(xì)菌：溶菌酶 2) 酵母：蝸牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase 等 3)絲狀真菌：Novozyme234、溶壁酶、纖維素酶 4)植物細(xì)胞：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶 酶法裂解時(shí)要注意細(xì)胞的生長(zhǎng)條件和生長(zhǎng)時(shí)間，反應(yīng)時(shí)盡可能滿足酶的最佳反應(yīng)條件。6 2.機(jī)械法 1)壓力剪切法：French壓力機(jī)，酵母細(xì)胞，細(xì)菌（芽孢和G+球菌除外） 2)射擊破碎法：Brau

3、n破碎機(jī)，攪切器（blender），混合器（mixer），0.1-0.45mm玻璃球 3)固體研磨法：將待破碎細(xì)胞與玻璃球（0.10.45mm）同時(shí)致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4)反復(fù)凍融法 三、DNA的分離與純化 1、供體DNA的分離與純化 要求：盡可能地保持其高分子量，無(wú)其它污染物。 1) 基因組大?。? 染色體細(xì)菌 33004200kb酵母 15,000 kb果蠅 1.28x105 kb人 3x106 kb植物 2x1051x108 kb 天花病毒 288 kb痘病毒 196 kb質(zhì)體 幾100以上kb 線粒體 藻類 線狀 15kb酵母 環(huán)狀 1978 kb植物 環(huán)狀 100150

4、kb動(dòng)物(扁蟲到人)環(huán)狀 1518 kb錐蟲 網(wǎng)狀 6000 kb(幼體)短膜蟲 網(wǎng)狀 30,000 kb(幼體) (Kinetoplast） 葉綠體雙子葉植物 121（菠菜）154kb（豌豆）單子葉植物 151（玉米）182kb（浮萍）藻類 132（裸藻）191kb（衣藻）8 1) DNA分離純化過(guò)程 破碎細(xì)胞 + DNA抽提液(EDTA、去污劑、還原劑) 65溫育20 冰浴冷卻 離心去細(xì)胞碎片 苯酚抽提法 CsCl密度梯度離心 1) 苯酚抽提法上清液 緩沖液用水飽和苯酚抽提23次 上層液相用氯仿抽至界面無(wú)蛋白變性物 上層液相用兩倍體積冷乙醇沉淀 沉淀物用70%冷乙醇洗滌,干燥 溶于緩沖液

5、加入RNAase處理除去RNA 苯酚氯仿抽提 沉淀干燥 9 2) CsCl密度梯度離心上清液 加入固體CsCl與EtBr溶液 室溫下超速離心(45,000rpm）16小時(shí) 穿孔取出DNA（320nm） 異丙醇抽提溴乙錠 緩沖液透析除去殘余CsCl 兩倍體積冷乙醇沉淀DNA 離心、洗滌、干燥 *兩種方法比較： CsCl法操作步驟少，分離DNA分子量大，耗財(cái)多，且需超速離心機(jī)。 苯酚法耗時(shí)少，不需昂貴儀器，但操作步驟多，易使DNA分子斷裂。 若 小心操作，所獲DNA亦符合要求。 * 上述兩種分離方法都包含了下述四個(gè)分離步驟.可溶與不可溶物分離：高速離心除去細(xì)胞碎片，保留上清液。. 使蛋白質(zhì)分離：苯

6、酚抽提或超速離心. 使RNA分離：RNase處理或超速離心. 使DNA與其它可溶物分離10 2.載體DNA的分離與純化 1)質(zhì)粒載體DNA的分離 關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒DNA與宿主染色體DNA分開 原理：質(zhì)粒DNA比染色體DNA 小得多，在DNA抽提過(guò)程中，染色體DNA斷裂成小片段(線狀)，質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型 3)細(xì)胞器DNA的分離 植物組織 用核分離緩沖液勻漿 過(guò)濾 濾液離心(2000g, 10,4) 核緩沖液使核裂解(含0.5%Triton X-100) 抽提DNA 植物組織 細(xì)胞器緩沖液勻漿 離心(100g, 10,4)除去細(xì)胞核 離心(1800g, 10,4)分離葉綠體 離心(10,

7、000g, 10,4)分離線粒體 DNase除去細(xì)胞器外DNA 加入EDTA使DNase失活 純化細(xì)胞器 細(xì)胞器裂解 提取DNA 11 方法： . 超速離心：利用兩種DNA分子的大小和空間構(gòu)型 . 變性法：在變性條件下使染色體DNA變?yōu)閱捂?，而質(zhì)粒DNA仍保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)變性條件發(fā)生迅速變化時(shí)，前者仍不能復(fù)性，而后者又可回復(fù)到天然構(gòu)型。 變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法上述方法亦可用于ss環(huán)狀病毒DNA RF型的分離, 質(zhì)粒DNA的氯霉素?cái)U(kuò)增使用并不廣泛（菌株和載體） 2)噬菌體載體DNA的分離 純凈病毒顆粒 病毒載體DNA M13mp載體可采用質(zhì)粒DNA的分離方法12 二、RNA的分離與純

8、化 1.制備RNA的關(guān)鍵防止內(nèi)外源RNase的作用 1)RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍; 抗高溫嚴(yán)寒(065均具活性）；抗變性劑 2)解決辦法：外源RNase高溫，焦磷酸二乙酯(DEPC)處理所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者帶手套 內(nèi)源RNase高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等 2.總RNA的制備 根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下三種制備方法： 1）熱苯酚抽提法 2）胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法 13其中以胍鹽法最好，對(duì)于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）中提取RNA特別有效，可使RNase迅速變性，制備的RNA

9、有較高翻譯活性。在RNA制備中，細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)變性是同步進(jìn)行的。3. 多聚核糖體RNA的制備 1) 多聚核糖體的分離 超速離心法（30-40萬(wàn)g，離心2-3 h） 鎂鹽沉淀法（0.1 M Mg+） 分級(jí)分離法分離特異性多聚核糖體14 i. 結(jié)合與游離核糖體的分離，這種方法可避免溶酶體破裂。 ii. 核糖體大小分級(jí)分離，利用連續(xù)密度梯度分離特大和特小的 多聚核糖體 iii.核糖體免疫沉淀法 *直接免疫沉淀法 新生肽鏈+抗體 蔗糖密度梯度離心 *間接免疫沉淀法 新生肽鏈+抗體+抗-抗體（二抗） 不可 溶復(fù)合物 離心分離 15 *免疫親和層析法 新生肽鏈-抗體復(fù)合物 不溶性交聯(lián)抗原基 質(zhì)親和層析柱

10、吸附 洗脫 免疫沉淀法優(yōu)點(diǎn)：可分離到含量?jī)H為1%的mRNA，但必須使用高純度的抗體，不能發(fā)生交叉反應(yīng)和污染核酸酶 2) 多聚核糖體RNA的分離純化多聚核糖體+SDS 蔗糖密度梯度離心或蛋白酶K-苯酚抽提 4.RNA的分級(jí)分離 1)分子量大小分級(jí)分離 i.蔗糖密度梯度離心 ii. 凝膠電泳 2)核酸序列分級(jí)分離 i. 分子雜交法：適用于同源性很高的RNA的分離DNA分子變性 結(jié)合到NCF RNADNA雜交 洗滌 洗膜 乙醇沉淀16 ii.親和層析法： 低聚dT纖維素: 用于poly(A)較長(zhǎng)的mRNA； 多聚U瓊脂糖: 用于poly(A)較短的mRNA（20A） RNA進(jìn)樣吸附 洗滌 洗脫 收集

11、260nm處吸收峰樣品 乙醇沉淀 iii. 無(wú)poly(A) mRNA的分離 純化多聚核糖體 核糖體亞基+mRNP 離心 mRNP 蛋白酶K mRNA 低聚（dT）纖維素層析 洗出液 乙醇沉淀（無(wú)多聚A mRNA） 5.RNA的質(zhì)量評(píng)估方法 1) 光密度值測(cè)定法 A260/A280=2.0 2) 凝膠電泳 3) 體外蛋白質(zhì)翻譯17細(xì)胞裂解物 胍鹽法 總RNA 分子雜交法 特異RNA分子 熱苯酚法 凝膠電泳 圍RNA大小分級(jí)分離 大小范蔗糖密度梯度離心 一定 LiCl/ 核酸序列 尿素法離心 分級(jí)分離 親和層析法 poly（A）RNA分子 高速離心法 全部多聚核糖體 上清液 鎂鹽沉淀法蔗糖密度梯

12、度離心結(jié)合與游離多聚核糖體分級(jí)分離法 蔗糖連續(xù)密度一定范圍大小核糖體多聚核糖體RNA免疫沉淀法特異性多聚核糖體 18第二節(jié)核 酸 電 泳 19 1.種類 1) 按凝膠材料分: 聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳(普通瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖) 2) 按電泳裝置分: 水平式/瓊脂糖凝膠; 豎式/聚丙烯酰胺凝膠 3) 兩種方法比較：分離效果和分離范圍; 操作難易 2.用途 瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。 3.凝膠電泳的一般程序 制膠 點(diǎn)樣 電泳 染色 觀察二、DNA電泳 1.DNA分子種類 1) 線狀DNA單鏈與雙鏈，ss-DNA電泳時(shí)要注意局部區(qū)域形成ds-

13、DNA，造成遷移距離不確定 2) 環(huán)狀DNA單鏈（如M13mp）和雙鏈（質(zhì)粒DNA） 3) 線狀ds-DNA電泳使用頻率最高的一種電泳20 這類DNA分子在電泳過(guò)程中遷移的距離受以下幾個(gè)因素的影響： i.分子量 的大小: 遷移距離與分子量的常用對(duì)數(shù)成反比 ii. 凝膠濃度: 濃度越高，移動(dòng)距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動(dòng)距離越長(zhǎng)，適合分離高分子量DNAiii.電壓: 低電壓時(shí)，遷移率與電壓成正比；電壓增高時(shí)，不同大小DNA片段遷移率增大是不同的。iv.堿基組成與溫度: 不受影響,溫度高可導(dǎo)致DNA帶變形或解鏈。214) 環(huán)狀ds-DNA電泳: 常用于質(zhì)粒DNA的初步鑒定5) 線狀

14、ss-DNA電泳 鏈分離凝膠：化學(xué)定序時(shí)，用于單鏈分離。DNA雙鏈互補(bǔ)，但組成不一樣，仍可分離（機(jī)理不詳），電泳時(shí)形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。 核酸定序凝膠(染料指示劑)：為避免局部區(qū)域產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等）22三. RNA凝膠電泳 方法：不同的RNA電泳方法是依據(jù)使RNA分子變性所采取的方法。這些方法不僅要使RNA分子在點(diǎn)樣時(shí)是一級(jí)結(jié)構(gòu)，而且在整個(gè)電泳過(guò)程中也保持一級(jí)結(jié)構(gòu)。 1.乙二醛/二甲基亞砜法 原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應(yīng)，特別是鳥苷形成一個(gè)穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止GC堿基的互補(bǔ)作用發(fā)生 步驟

15、：RNA+10mM羥甲基醛和50% DMSO混合 50、1 h變性 點(diǎn)樣 電泳 染色 觀察 2. 羥甲基汞法 原理：羥甲基汞可與RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。 步驟：RNA+10mM羥甲基醛 點(diǎn)樣在含4mM羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上 電泳 染色觀察23 3.甲醛法 步驟：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺 點(diǎn)樣在含2.2M甲醛瓊脂糖凝膠上 MOPS緩沖液電泳 染色觀察 其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于RNA電泳. 4. 三種方法的比較 第一種方法安全，但由于反應(yīng)是不可逆的，由此回收的RNA樣品用于體外翻譯效果不好。第二、三種方法的反應(yīng)可逆，回收RNA樣品可用

16、于體外翻譯反應(yīng)，但操作必須小心，因兩種變性劑有毒。五、蛋白質(zhì)電泳 方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者常稱之為SDS。差別：有無(wú)變性劑 用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)程中，可直接用于酶促反應(yīng)（顏色變化） SDS可用于蛋白質(zhì)分子量、亞基組成的測(cè)定。mRNA翻譯產(chǎn)物，基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定等。 24五、核酸片段的分離與回收 1.方法 用于DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的回收 1)電洗脫法: 利用電泳方法將凝膠中的特定核酸分子到其它介質(zhì)中； 2) 濾紙法 核酸凝膠染色 長(zhǎng)波紫外光確定位置 在分離帶前方切一口子并插入濾紙條(其背面覆蓋透析袋膜) 電泳至DNA帶全部進(jìn)入濾紙條 洗脫DNA 純化、沉淀

17、 3) 透析袋法切下含DNA帶瓊脂塊 放入透析袋，封口 放入電泳槽 電泳23小時(shí)至全部DNA離開凝膠塊 反向電泳1分鐘 取出DNA液 純化、沉淀 4) 凍融法 5) 酶解法 25待回收DNA 切口 DNA 切口 凝膠塊 濾紙法 透析袋 凝膠塊 待回收DNA 透析袋法 待回收DNA 凝膠塊 V-型槽 電洗脫槽法 回收DNA方法 262. 影響回收率的因素 1）DNA分子大小回收率與分子量大小呈負(fù)相關(guān)； 2）乙醇沉淀其中溫度、時(shí)間和DNA濃度（回收時(shí)體積）均與回收率有關(guān)； 3）離心時(shí)間時(shí)間越長(zhǎng)，效果越好，對(duì)低濃度DNA尤其明顯。3. 回收DNA片段質(zhì)量 凝膠材料的質(zhì)量，如瓊脂糖中的硫酸鹽 沉淀劑若

18、改用精胺，它可有效地去除PEG、核苷酸、鹽、聚丙烯酰胺及蛋白質(zhì)等。27第三節(jié) 染色體DNA電泳28一、DNA分子在凝膠電泳中的移動(dòng) 1、常規(guī)電泳 在自由電場(chǎng)中，DNA的移動(dòng)速度與分子量大小無(wú)關(guān)； 將DNA分子置于凝膠中進(jìn)行電泳，DNA移動(dòng)距離與分子量有關(guān)。分子量小的移動(dòng)快；反之則慢。大于20kb的DNA大分子，其移動(dòng)距離與分子量無(wú)關(guān)。因?yàn)檫@些DNA分子要通過(guò)膠孔時(shí)必須發(fā)生變形，并沿分子長(zhǎng)軸運(yùn)動(dòng)經(jīng)過(guò)膠孔，它們都以相同速度前進(jìn)，分辨率也就消失了。 2、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE) PFG工作假說(shuō) 1) DNA松弛時(shí)間：大分子DNA改變形

19、狀和重新定向所需的時(shí)間。這個(gè)時(shí)間與DNA分子量呈正相關(guān)（Tr） 2) DNA移動(dòng)時(shí)間：DNA分子向前移動(dòng)的時(shí)間（Tm） 3) 電場(chǎng)脈沖時(shí)間：其電場(chǎng)方向所持續(xù)的時(shí)間（Tp）29 分子量大的DNA分子所需的松弛時(shí)間長(zhǎng)，分子量小的則短。由于脈沖時(shí)間是一個(gè)人為的固定值，那么用于向前移動(dòng)的時(shí)間則隨分子量大小而變化。分子量大的用于向前運(yùn)動(dòng)的時(shí)間少，移動(dòng)距離就短，分子量小的用于向前運(yùn)動(dòng)的時(shí)間多，移動(dòng)距離就長(zhǎng)。這就是使不同大小分子量DNA分離的假說(shuō)。 Tp小 = Tm小+ Tr小 Tp大 = Tm大+ Tr大因Tp小 = Tp大 ， Tr小 Tm大 ，所以， S小 S大 顯然，要使一個(gè)DNA樣品中不同大小的D

20、NA分子分離，脈沖時(shí)間應(yīng)選在最大DNA分子所需的上限。二脈沖場(chǎng)凝膠電泳的種類 1正交場(chǎng)脈沖凝膠電泳（OFAGE） 利用兩個(gè)或多個(gè)交變電場(chǎng)，使200-3000 kb的DNA分子發(fā)生分離，其電極排列可以是雙向非均勻，單向非均勻等。30脈沖場(chǎng)凝膠電泳原理圖 北 南 脈沖場(chǎng)電泳 常規(guī)電泳 兩組電極，排列不均勻; 一組電極，電場(chǎng)方向不變，電極排列均勻， 定時(shí)改變電場(chǎng)方向，DNA分子的凈 DNA移動(dòng)方向與電場(chǎng)方向相同。整個(gè)電泳 移動(dòng)方向與兩電場(chǎng)呈45o，在電泳過(guò) 過(guò)程保持電壓穩(wěn)定。常規(guī)方法制備DNA 程中，電壓有時(shí)可隨時(shí)間的增加而樣品增加， 制備DNA樣品與常規(guī)方法不同31 2. 場(chǎng)倒置凝膠電泳（FIGE

21、） 利用常規(guī)電泳槽進(jìn)行電泳，但電場(chǎng)方向則是周期性地發(fā)生倒置，其正向和反向的脈沖時(shí)間長(zhǎng)度之比為3或其它比值。該法可使15-700 Kb或以上的DNA分子發(fā)生分離。 為了克服同移動(dòng)現(xiàn)象產(chǎn)生（即不同大小DNA分子一起移動(dòng)），可以采用轉(zhuǎn)換時(shí)間遞增法（swiching-interval ramps）, 即由電泳開始時(shí)的短脈沖時(shí)間逐漸遞增到電泳結(jié)束時(shí)的長(zhǎng)脈沖時(shí)間。如開始時(shí)為60：20，結(jié)束時(shí)可為180：60。 上述兩種方法也可聯(lián)合使用，使一些很難分開的大分子DNA分離。 3. CHEF(Contour-Clamped Homogeneous Electric Fields) 動(dòng)態(tài)調(diào)控閉合均一電場(chǎng)電泳32120場(chǎng)倒置電泳 CHEF(動(dòng)態(tài)調(diào)控閉合均一電場(chǎng)電泳)33各種脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)的比較方法 染色體帶 最大帶 最小帶 動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié) 直道 均勻電場(chǎng) 液體樣品 機(jī)械轉(zhuǎn)換CHEF 15 12000kb 88 bp 是 是 是 是 不OFAGE 13 9000kb 5000 bp 不 不 不 是 不 TAFE 13 9000kb 2000 bp 不 是 不 不 不FIGE 11 2000kb 200 bp