免疫膠體金法檢測MPB64抗原在結核病實驗室診斷中的價值

1、免疫膠體金法檢測MPB64抗原在結核病實驗室診斷中的價值【摘要】目的通過與傳統(tǒng)的結核病實驗室診斷方法直接涂片抗酸染色、改進羅氏培養(yǎng)、PR的比擬，評價免疫膠體金法檢測結核桿菌PB64抗原在結核病快速診斷中的應用價值。方法搜集158例確診為結核病患者的臨床標本，分別用直接涂片抗酸染色、改進羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)、PR、免疫膠體金法檢測米氏7H9培養(yǎng)產物中的PB64抗原檢測結核分支桿菌，并對結果進展比擬分析。結果涂片陽性率為10.76%，改進羅氏培養(yǎng)陽性率為20.89%，PR檢測陽性率為56.33%，免疫膠體金法檢測陽性率為41.14。結論免疫膠體金法檢測米氏7H9液體培養(yǎng)產物中的PB64抗原可以作為一種較

2、為敏感、快速簡便的檢測結核分支桿菌感染的方法，有助于結核病臨床快速診斷?！娟P鍵詞】PB64抗原；結核??；快速診斷結核病的控制關鍵在于早發(fā)現(xiàn)和早治療，而結核病細菌學檢查是臨床上明確結核病診斷和化療方案的重要根據，也是考核和評價療效的可靠標準。結核病確實診和治療方案很大程度上依賴于結核分支桿菌的實驗室檢查，快速、準確的結核分支桿菌的檢測對于結核病的快速診斷，乃至對結核病的防治，都有著極其重要的意義。近年來可以作為結核桿菌存在直接證據的結核特異性外分泌抗原如Ag85、ESAT6、FP10、PB64等的檢測越來越受到關注，其中PB64是較為令人注目的一種1-4。本研究搜集了158例確診為結核病的臨床標

3、本，分別用直接涂片抗酸染色、改進羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)、DNAPR檢測、免疫膠體金法檢測米氏7H9培養(yǎng)產物中的PB64抗原以下簡稱PB64抗原檢測檢測結核分支桿菌，并對結果進展比擬分析，以評價PB64抗原檢測在結核病快速診斷中的應用價值。1資料和方法1.1對象選取2022年1月2022年12月根據?中華人民共和國傳染病防治法?規(guī)定管理的傳染病診斷標準試行中的結核病診斷標準，確診為結核病的本院及淮安市第四人民醫(yī)院住院和門診患者158例，搜集標本158份。其中男性91例，女性67例，年齡1378歲，平均年齡32.3歲。肺結核124例，結核性胸膜炎30例，結核性關節(jié)炎3例，結核性腦膜炎1例。搜集到的標本分別

4、為痰124份，胸腔積液30份，關節(jié)穿刺物3份，腦脊液1份。另外，于同一時期搜集50例臨床已排除結核病的呼吸道感染患者的痰液標本50份作為對照組。1.2材料抗酸染液和改進酸性羅氏培養(yǎng)基等材料為本院實驗室參照全國結核病細菌學檢驗規(guī)程自配，7H9液體培養(yǎng)基及結核菌膠體金檢測試劑盒均購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術，7H9液體培養(yǎng)基批號為071215、080524、090122，結核菌膠體金檢測試劑盒批號為070501、081104、090108。DNAPR檢測采用的設備為羅氏lightyler2.0，試劑為中山大學達安基因股份消費的結核分支桿菌核酸擴增PR熒光檢測試劑，批號為202205、202206、20

5、2212、202202。不能及時檢測的標本，將留置容器嚴格密封后，置于4冰箱保存，并在其上應注明患者姓名、編號及日期。1.3方法1.3.1標本搜集和前處理痰標本肺結核患者在治療前搜集痰標本，每個病例按規(guī)定搜集痰液，痰液總量不少于20l。除局部用于直接涂片染色外，其他痰標本作如下前處理：在容器中參加適量4%NaH，用無菌玻棒持續(xù)攪拌，痰液充分消化后，汲取0.2l消化后痰液另放用于改進羅氏培養(yǎng)；其余的消化后痰液進展中和處理，標本移至50l離心管量多者分多管，3000g離心15in，傾去上清，再參加2030lpH值為6.8的PBS中和,再以3000g離心，傾倒去上清，上述中和、離心必要

6、時可重復1次或屢次PBS中和所得沉淀物測試pH值為7.07.2后用于米氏7H9培養(yǎng)基培養(yǎng)。胸腔積液、腦脊液、關節(jié)腔積液以無菌容器搜集臨床穿刺所得的積液，除局部用于直接涂片染色檢測外，經3000g離心15in后，傾倒去上清得到沉淀，參加2l生理鹽水混勻備用。1.3.2直接涂片抗酸染色詳細操作步驟和判讀標準均參照?全國結核病細菌學檢驗規(guī)程?。1.3.3改進羅氏培養(yǎng)和米氏7H9培養(yǎng)改進羅氏培養(yǎng)汲取0.1l標本均勻地接種于改進酸性羅氏培養(yǎng)基斜面，放入37孵箱中進展培養(yǎng)，觀察并記錄斜面長菌情況。米氏7H9培養(yǎng)汲取1l左右標本接種于含有5l米氏7H9液體培養(yǎng)基的培

7、養(yǎng)管中，放入37孵箱中進展培養(yǎng)。所有培養(yǎng)管自第2天開場，每天觀察1次，并取其培養(yǎng)液進展PB64抗原檢測，陽性者培養(yǎng)管另存?zhèn)溆?，陰性者繼續(xù)培養(yǎng)觀察，直至第30天檢測結果仍為陰性者報告為陰性。假設培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中很快13天出現(xiàn)混濁，或有大量快速增加的沉淀物，應考慮培養(yǎng)基污染。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.1.3.4DNAPR檢測按廠家提供的試劑和儀器操作說明書操作并報告結果。1.3.5PB64抗原檢測經7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后715天，將培養(yǎng)液混勻，汲取150l培養(yǎng)液參加PB64結核菌膠體金檢測卡的檢測孔中，15in后觀察結果。結果斷定:檢測區(qū)和控制區(qū)均出現(xiàn)紫紅色條帶為陽性，在控制區(qū)出現(xiàn)紫紅色條帶、檢測區(qū)未

8、出現(xiàn)為陰性結果?？刂茀^(qū)未出現(xiàn)任何條帶需重新檢測。2結果2.14種檢測方法陽性率比擬158份標本4種方法檢測陽性率及特異性比擬見表1。表14種方法檢測結核桿菌陽性率比擬略2.2肺結核和各肺外結核標本檢測結果比擬見表2。表2肺結核和肺外結核標本檢測陽性率比擬略3例關節(jié)穿刺物標本中，2例為改進羅氏培養(yǎng)和PB64抗原檢測2種方法檢測同為陽性，1例為改進羅氏培養(yǎng)、DNAPR、PB64抗原檢測3種方法檢測同為陽性，而僅有的1例腦脊液標本4種方法檢測均為陽性。2.3PB64抗原檢測陽性結果報告時間見表3。表365例PB64抗原檢測陽性結果報告時間略2.4痰標本PB64抗原檢測與涂片抗酸染色和改進羅氏培養(yǎng)陽性

9、率的比擬見表4。其中，改進羅氏培養(yǎng)陽性而PB64抗原檢測為陰性的4例標本菌株后經對硝基苯甲酸PNB生長試驗鑒別，鑒定為非結核分支桿菌。表4124例痰標本PB64抗原檢測與涂片抗酸染色和改進羅氏培養(yǎng)的比擬略3討論PB64也稱PT64蛋白是結核分支桿菌在生長繁殖中分泌的分子量為24kD的一種有特殊作用的外分泌蛋白，可導致強烈的遲發(fā)型超敏反響。PB64蛋白主要存在于結核分支桿菌復合菌群，.flavesens為弱陽性，而非結核分支桿菌極少出現(xiàn)陽性，因此有很強的特異性5-6。張嶸等7曾報道用免疫色譜法抗-PB64單克隆抗體檢測和快速診斷結核分支桿菌結核菌群，能特異性地鑒別結核和非結核分支桿菌。Hille

10、ann等8用apiliaTB產品檢測PB64抗原，在172例結核桿菌陽性的臨床標本的檢測中，陽性檢出率為92%，特異性到達100%。本實驗中改進羅氏培養(yǎng)陽性而PB64抗原檢測為陰性的4例標本菌株后經PNB生長試驗鑒定為非結核分支桿菌，這一實驗結果支持他們的研究結果。本次研究結果顯示，4種結核桿菌實驗室檢測方法中，結核桿菌DNAPR檢測最敏感、快速，但此法在陰性對照組中也有3例檢出陽性，可能為假陽性;但也不能排除3份標本存在微量結核分支桿菌，由于PR檢測靈敏度很高，因此仍能被檢出的可能性。不管屬于哪種情況，其陽性結果對臨床診斷有一定的誘導作用。而傳統(tǒng)的直接涂片抗酸染色鏡檢陽性檢出率10.76%明

11、顯比其他3種方法低，改進羅氏培養(yǎng)的檢出率20.89%雖然比涂片鏡檢有所進步，但明顯低于PB64抗原檢測的41.14%，且耗時更長。相對于涂片和改進羅氏培養(yǎng)，PB64抗原檢測在報告時間、陽性檢出率等方面均表達出較大的優(yōu)勢。但是從實驗可操作性方面來講，每天都要汲取150l用于檢測很可能會影響后面的培養(yǎng)效能，增加污染時機，另外每天消耗一張檢測卡也會大大地增加本錢，不過PB64檢測陽性的出現(xiàn)時間絕大多數(shù)集中在培養(yǎng)614天時，因此假如此法用于臨床檢測，建議可在培養(yǎng)7天開場作PB64抗原檢測，檢測結果陽性可直接報告結核分支桿菌檢測陽性，檢測結果為陰性者，待培養(yǎng)至第15天再作PB64抗原檢測，假如此時檢測結

12、果仍為陰性，根本上可以報告結核分支桿菌檢測陰性，臨床高度疑心結核病的標本，可繼續(xù)培養(yǎng)至30天再作PB64抗原檢測。這樣可以進步PB64抗原檢測的可操作性，并大大降低本錢。綜上所述，免疫膠體金法檢測米氏7H9培養(yǎng)產物中的PB64相對具備了快速、經濟、操作方便、無須大型儀器投入等多種優(yōu)點，在基層醫(yī)院結核病診斷中有較大的應用價值?！緟⒖嘉墨I】1NakauraR,EinkL,VelnteA,etal.DetetinfativetuberulsisbyanPB-64transderalpath:afieldstudyJ.SandJInfetDis，2001,33(6):405-407.2TasakaH,

13、ShigetE,atsuK,etal.SeretinfPB64antigenbyarebinantlnefybateriusegatis:haraterizatinandappliatinfrthediagnsisftuberulsisJ.SandJIunl，1995,42(4):487-492.3angBL,XuY,LiZ,etal.AntibdyrespnsetfurseretryprtEInsfrybateriutuberulsisandtheirplexantigeninTBpatientsJ.IntJTuberLungDis，2022,9(12):1327-1334.4Abe,Hir

14、anK,TiyaaT.Sipleandrapididentifiatinftheybateriutuberulsisplexbyiunhratgraphiassayusinganti-PB64nlnalantibdiesJ.Jlinirbil，1999,37(11):3693-3697.5Harbe,NagaiS,PatarryE,etal.PrpertiesfprteinsPB64,PB70,andPB80fybateriubvisBGJ.InfetIun，1986,52(1):293-302.6張靈霞,吳雪瓊,史迎昌,等.結核分枝桿菌重組PT64蛋白抗原誘發(fā)豚鼠遲發(fā)型超敏反響的研究J.中國免疫學雜志，2001，178:414-415.7張嶸,