糞菌移植對炎癥性腸病大鼠血清TNF-α、IL8的影響

1、 碩士：蔡景融 導(dǎo) 師：武華教授4月糞菌移植對炎癥性腸病大鼠血清TNF-、IL8影響專 業(yè)：普通外科第1頁研究方案研究基礎(chǔ)研究計劃及預(yù)算國內(nèi)外研究進展選題依據(jù) Content糞菌移植對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清TNF-、IL8影響第2頁選題依據(jù) 潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一個病因和患病機制還未完全說明，可能與微生態(tài)環(huán)境、黏膜免疫應(yīng)答、應(yīng)激、遺傳等原因相關(guān)慢性腸道炎癥性疾病，病變主要局限于結(jié)直腸粘膜及粘膜下層，可累及整個結(jié)腸甚至末端回腸。當(dāng)前研究發(fā)覺，與健康人相比，UC患者腸道中微生物多樣性降低約1/4，擬桿菌門與厚壁菌門在總菌群中所占百分比顯著降低，而放線菌門與變形菌門百分比顯著增加。腸道菌群是機體一個

2、特殊器官，其調(diào)整機體免疫、調(diào)控炎癥、參加物質(zhì)代謝等方面發(fā)揮主要作用。第3頁 選 題依 據(jù) 糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT），是將健康人糞便中功效菌群移植到菌群分布異?；颊呶改c道內(nèi)，重建其健康菌群分布結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)腸道及腸道外疾病恢復(fù)一個治療方式?，F(xiàn)階段，F(xiàn)MT研究大部分是關(guān)于FMT治療復(fù)發(fā)性難辨梭狀芽孢桿菌感染（CDI）和炎癥性腸?。↖BD）個案或系列病例報道,但FMT造成患者腸道菌群詳細發(fā)生何種有益改變及其潛在機制仍不完全清楚，但有待深入研究。對常規(guī)治療失敗或有手術(shù)禁忌證UC病人，F(xiàn)MT或許是不錯選擇。第4頁 腸道菌群生理作用1.防御病原體侵犯

3、2.物質(zhì)代謝作用3.生長與衰老4.合成維生素5.腸道生物、免疫屏障作用選 題依據(jù) 第5頁傳統(tǒng)升階治療方案，序貫地應(yīng)用5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素與免疫抑制劑，無疑最為安全易行、經(jīng)濟實用；然而無限期地等候療效，可能錯失治療良機，延誤緩解時間，使約50患者仍處于活動狀態(tài)，造成失用或致殘并發(fā)癥，其療效費用比反而降低。伴隨新藥問世后治療經(jīng)驗積累，教授們提出早期、強力治療，即降階治療方案。這種看似昂貴、危險，實則經(jīng)濟、高效治療方法已使相當(dāng)多IBD患者獲益，但降階治療藥品昂貴，又有一定風(fēng)險，如嚴重感染、藥品反應(yīng)等，對非選擇性病例也存在過分治療之嫌，而且停藥或減藥后病情仍會發(fā)復(fù)發(fā)作，并表現(xiàn)出一定激素依賴性。對

4、常規(guī)治療失敗或有手術(shù)禁忌證UC病人，F(xiàn)MT或許是不錯選擇。當(dāng)前FMT應(yīng)用最為廣泛是治療復(fù)發(fā)性難治性難辨梭狀芽胞桿菌感染(CDI)腸炎，其短期緩解率可達90以上。FMT也在其它各種疾病中被用于試驗性治療，都取得了良好效果，如IBD、IBS、肥胖、代謝綜合征、糖尿病等。還有FMT被成功利用于系統(tǒng)性硬化病、帕金森病、慢性疲勞綜合征和特發(fā)性血小板降低性紫癜等個案報道。 國內(nèi)外研究進展第6頁1檢測指標及意義3試驗方案2 創(chuàng)新之處及可行性分析4 研 究方案研究目標和內(nèi)容第7頁研究目標和內(nèi)容1 潰瘍性性結(jié)腸炎大鼠模型建模成功評判標準研究內(nèi)容擬處理關(guān)鍵問題123研究目標糞菌移植對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清TNF-、

5、IL-8影響試驗分組、建立潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型糞菌液制備指標檢測、 Chiu氏6級評分法評定損傷程度第8頁（1）分組情況（2）模型建立 （3）糞菌液制備（4）指標檢測（5） Chiu氏6級評分法評定損傷程度 （6）統(tǒng)計學(xué)分析2試驗方案第9頁2.1分組情況健康SD大鼠54只，雌雄各半，體重200-250g，由山西醫(yī)科大學(xué)生理試驗室提供。隨機分成3組：空白對照組(A組)、模型對照組（B組）、糞菌液模型組（C組），每組18只。其中A組為正常大鼠，給予無菌生理鹽水保留灌腸，天天一次，自由飲水、進食。B、C兩組為潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠，分別給予無菌生理鹽水、糞菌液保留灌腸，天天一次，自由飲水、進食。（生理

6、鹽水量、糞菌液量按體重換算）第10頁2.2模型建立大鼠造模前1 d禁食24 h，不禁水，稱重后，3戊巴比妥（1ml/kg）腹腔注射麻醉，52，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS W/V)按100 mg/kg加入等體積50%乙醇溶液；體位為頭朝下，用聚丙烯管插入肛門上段8 cm，注射器注人。再倒立15 min左右，以防藥液溢出，一次性灌腸。第11頁2.3糞菌液制備糞菌液制備流程：將約5g供體（A組）新鮮糞便樣本置于攪拌器中，加入25 mL無菌09NaCl溶液進行初步均質(zhì)加工；將糞便漿體經(jīng)不銹鋼濾網(wǎng)過濾去除其中大顆粒物質(zhì)；2 h內(nèi)將樣本在氮氣生物工程廚內(nèi)進行稱重并在勻漿器中深入勻質(zhì)處理；漿體逐層經(jīng)過直

7、徑2漿體逐層經(jīng)過直徑20 mm、10 mm、05 mm和025 mm不銹鋼濾網(wǎng)過濾以去除未吸收食物殘渣和小顆粒物質(zhì)；將再次過濾樣本以6000轉(zhuǎn)/min速率離心15 min，并將沉淀再懸浮于09NaCl溶液中，得幾乎無色無味糞菌液。取得新鮮糞菌液可馬上進行移植，也可加入無菌甘油后置于一80作為冰凍樣本保留18周。第12頁2.4指標檢測2.5Chiu氏6級評分法評定損傷程度 分別于造模后3d、7d、11d每組各取6只大鼠，3戊巴比妥鈉麻醉后開腹，使用一次性采血針穿刺門靜脈取全血2ml，待低溫離心后，再吸出上清液，置于一80冰箱中保留備用，采取酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定血清TNF-、IL-8濃度。

8、取肛門以上8cm腸段卷起，置10中性甲醛中固定、石蠟包埋、切片、HE染色后顯微鏡下觀察。而且于取材完成后采取頸椎脫臼法處死對應(yīng)大鼠。2.6 統(tǒng)計學(xué)分析采取Spss13.0統(tǒng)計軟件包進行分析，各組試驗數(shù)據(jù)用均數(shù)標準差表示，血清學(xué)指標比較采取單原因方差分析，P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。第13頁 3檢測指標及意義TNF-主要由脂多糖(LPS)激活單核巨噬細胞產(chǎn)生，對免疫反應(yīng)、機體代謝、炎癥反應(yīng)、抗腫瘤都有主要調(diào)整介導(dǎo)作用。1.潰瘍性結(jié)腸炎中TNF-分泌水平及其mRNA表示高于正常組或未受累結(jié)直腸粘膜。2.TNF-不但能刺激巨噬細胞、纖維母細胞、平滑肌細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞分泌花生四烯酸代謝物、

9、細胞因子和蛋白酶，還能吞噬細胞產(chǎn)物和補體片段引發(fā)細胞壞死、間質(zhì)中蛋白質(zhì)破壞和水腫發(fā)生，從而促進胃腸細胞組織損害。3.TNF-可使中性粒細胞聚集，內(nèi)皮細胞粘附分子上調(diào)以及增加上皮緊密連接通透性和抑制上皮細胞生長等，還可誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細胞凋亡，破壞腸粘膜屏障，同時血管系統(tǒng)也遭到破壞，經(jīng)過以上路徑造成一系列潰瘍性結(jié)腸炎經(jīng)典炎癥病變。第14頁IL-8 是一個強而有力中性粒細胞趨化和活化因子，由單核細胞、上皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞及T淋巴細胞在IL-1、TNF 和外源性因子細菌多糖(LPS)刺激下產(chǎn)生,其主要生物學(xué)作用是1.趨化并激活中性粒細胞,促進中性粒細胞溶酶體酶活性和吞噬作用,對嗜堿性粒細胞和T

10、 細胞也有一定趨化作用。 2.臨床試驗發(fā)覺IL-8 在UC 患者腸黏膜上皮中高表示而且IL-8 水平與結(jié)腸炎嚴重程度呈正相關(guān)。檢測指標及意義3第15頁技 術(shù) 路 線 圖 SD大鼠空白對照組模型對照組血清TNF-、IL8濃度并取結(jié)直腸組織HE染色后光鏡觀察數(shù)據(jù)SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析糞菌液模型組3、7、11天各處死6只大鼠第16頁可行性分析創(chuàng)新點 1導(dǎo)師對此項課題有系統(tǒng)、全方面認識與把握 2.已初步掌握動物喂養(yǎng)及試驗操作基本要領(lǐng)3.山西醫(yī)科大學(xué)試驗中心具備本試驗相關(guān)條件創(chuàng)新之處及可行性分析4現(xiàn)階段，F(xiàn)MT研究大部分是關(guān)于FMT治療復(fù)發(fā)性、難治性炎癥性腸?。↖BD）個案或系列病例報道,對常規(guī)治

11、療失敗或有手術(shù)禁忌證UC病人，F(xiàn)MT或許是不錯選擇，但其作用機制尚不完全清楚第17頁研 究基 礎(chǔ)前期研究工作積累（1） 導(dǎo)師武華教授有深厚學(xué)術(shù)造詣和豐富臨床經(jīng)驗，可為試驗提供理論技術(shù)指導(dǎo)。（2）已參閱大量與課題相關(guān)中英文文件及與本課題參考性較強相關(guān)資料和理論。硬件設(shè)施基本完備我校生理試驗室具備完成本試驗基本條件：高速冷凍離心機、均漿機、超低溫冰箱、氮氣操作廚、，能夠滿足本課題需求。動物中心試驗室有喂養(yǎng)動物動物房和喂養(yǎng)條件。第18頁預(yù) 期結(jié) 果 1.給予糞菌水UC大鼠與給予無菌生理鹽水UC大鼠相比，血清TNF-、IL-8檢測值較小，說明前者腸道炎癥反應(yīng)輕，通透性低，腸屏障功效相比后者很好。 2.

12、給予糞菌水UC大鼠與給予無菌生理鹽水UC大鼠相比，結(jié)直腸損傷情況判定評分較低。第19頁9月-3月4月-8月3月進 度安 排 文件查閱；資料搜集；資料分析；撰寫匯報。 動物喂養(yǎng)，做好試驗；搜集試驗數(shù)據(jù)。整理資料；分析資料；統(tǒng)計分析；撰寫論文。 第20頁經(jīng)費預(yù)算支出科目金額（萬元）計算依據(jù)及理由累計0.8科研業(yè)務(wù)費0.25查閱資料、發(fā)表論文試驗材料費0.5動物喂養(yǎng)、化學(xué)試劑及耗材0.05儀器設(shè)備使用費第21頁參 考文 獻主要參考文件：參考文件1邱新運,劉玉蘭. 糞菌移植在疾病治療中應(yīng)用進展.中華內(nèi)科雜志. , 2Borody TJ，Khomts AFecal microbiota transpla

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15、霞，王世宣中華內(nèi)科雜志，1993：12：842. 8 Ishignro YMucosal proinflammatory cytokine production correlates with endoscopic activity of ulcerative colitisJ Gastroenter011 999；34：66ol.53 ,NO.11.第22頁主要參考文件：參 考文 獻 9Song AL. The severity correlation of TNF-, IL-6 and IL-8 levels in plasma in patients with ulcerative co

16、litis and their clinical significances J.China Prac Med, , 3(36): 3-4.10 Pearl DS, Shah K, Whittaker MA, et al. Cytokine mucosal expression in ulcerative colitis, the relationship between cytokine release and disease activity J. J Crohns Colitis, , 7(6): 481-489. 11 Eiseman B，Silen W，Bascom GS，et a1Fecal enema as an adjunct in the treatment of pseudomembranous enterocolitisJ.Surgery，1958，44：854-859 12 Feingold KR，Moser A，Patzek SM，et a1Infection decreases fatty acid oxidation and nuclea