流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用

1、流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第1頁 科研型 分選功效488nm激光 四色熒光(525、575、610、675nm）流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第2頁 一、流式細胞術(shù)原理 流式細胞儀發(fā)展起源于細胞計數(shù)自動化研究。其原理是被熒光染色單細胞或顆粒，經(jīng)過高速液流系統(tǒng)形成細胞柱，排列成單細胞依次經(jīng)過流動室，在激光照射區(qū)域，攜帶熒光素細胞受激發(fā)產(chǎn)生不一樣熒光信號，這些熒光信號能夠反應(yīng)細胞生物特征。流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第3頁前向散射激光流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第4頁FCM液流系統(tǒng)（怎樣形成單個細胞流）樣本管鞘液管流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第5頁 近30年來流式細胞術(shù)在我國得到很快發(fā)展，應(yīng)用

2、范圍不停增大。當前，流式細胞術(shù)作為一門生物檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于免疫學、血液學、腫瘤學、細胞遺傳學、細胞生物學、生物化學等臨床醫(yī)學和基礎(chǔ)醫(yī)學研究領(lǐng)域。流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第6頁二、流式細胞術(shù)特點、優(yōu)點速度快極短時間內(nèi)可分析大量細胞，每秒可檢測上萬個細胞，甚至幾萬個細胞。多參數(shù)分析可同時分析單個細胞各種特征，取得單個細胞各種信息，也能夠依據(jù)其細胞表面標志不一樣把細胞群分為各亞群。流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第7頁定性、定量分析細胞經(jīng)過熒光染色對單細胞一些成份，如：DNA、抗原或受體等進行定性、定量分析。 靈敏度高 熒光能檢測到單個微粒上標有熒光分子少于10、G2/M15或S20、G2/M5流式細胞術(shù)

3、實驗方法及應(yīng)用第41頁2、 淋巴細胞亞群分析白細胞分化抗原（CD分子）命名：1982年世界衛(wèi)生組織和國際免疫學會聯(lián)合會，將全部抗體依據(jù)白細胞分化抗原反應(yīng)性類型劃分為25群，把每一群抗體稱為一個分化抗體群(Cluster of Differentiation，CD)，進行編號、命名，即為單克隆抗體國際命名法。由CD抗體群識別分化抗原就稱為CD分子。當前已經(jīng)有339個分化抗體群被判定并命名流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第42頁 流式細胞結(jié)合單克隆抗體技術(shù)能準確分類計數(shù)淋巴細胞亞群，被認為是血液中淋巴細胞免疫表型分析標準方法。血液淋巴細胞是一群特異性極強細胞，依據(jù)淋巴細胞功效及膜表面標志，主要分為T淋巴細

4、胞(CD3+)、B淋巴細胞(CD19+)、NK細胞(CD16+56+/CD3-)三個亞群。流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第43頁CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+ T淋巴細胞（CD3+）淋巴細胞 B淋巴細胞（CD19+） NK細胞（CD16+56）+流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第44頁NK細胞:CD(16+56)+/CD3-B淋巴細胞:CD19+/CD3-NK+/CD3-CD（16+56）+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3-流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第45頁外周血淋巴細胞亞群標識方法（表面標識） 50ul+10ul對應(yīng)抗體 避光孵育15min 加Opt

5、iLyes C溶血素250ul 室溫10min PBS洗一次 上機分析抗體: CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三標抗體CD19-PE/CD3-FITC二標抗體CD16+56-PE/CD3-FITC二標抗體IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型對照流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第46頁淋巴細胞亞群檢測臨床意義： CD3+、CD4+、CD8+總數(shù)降低：細胞免疫功效低下 CD4+（CD4+/CD8+）降低或CD8+(CD8+/CD4+)升高：AIDS、病毒感染、惡性腫瘤（復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移）、再生障礙性貧血等 CD4+(CD4+/CD8+)升高或CD8+(CD8+/CD4+)

6、降低：本身 免疫性疾、多發(fā)性硬化病、本身免疫性溶血性貧血 CD3+CD4+CD8+T細胞降低：見于免疫球蛋白缺乏癥、胸腺發(fā)育不良、嚴重免疫缺點病。流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第47頁 NK CD(16+56) + 活性低下：腫瘤、白血病、本身免疫病、免疫缺點病等 NK+ CD(16+56) + 活性增高：多發(fā)性骨髓瘤、骨髓移植感染、感染性疾病（B病毒、皰疹病毒、肺TB）、習慣性流產(chǎn)等 CD19+B細胞降低：體液免疫抑制 CD19+B細胞增高：B細胞惡性增殖性疾?。ò籽。┝魇郊毎g(shù)實驗方法及應(yīng)用第48頁3、 白血病免疫分型 FCM作為白血病輔助診療，免疫分型是急白血病診療關(guān)鍵技術(shù)。利用不一樣類型白

7、血病含有不一樣抗原表示特異性進行分型：髓系、B淋巴系、T淋巴系、非系列特異性等。標識方法：往往需要胞漿和胞膜同時標識，一線抗體包含：胞漿（髓系-MPO，B淋巴系-CD79a, T淋巴系-cyCD3）,胞膜(髓系-CD13、CD117，B淋巴系-CD19、CD10, T淋巴系-CD3、CD2)等流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第49頁 采取CD45和側(cè)向散射(SSC）設(shè)門技術(shù)可將各細胞群分開，熒光從強大到弱：淋巴細胞群單核細胞成熟粒細胞原/幼細胞(白血病細胞)，而成熟紅細胞和血小板不表示。流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第50頁正常骨髓流式細胞分布圖流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第51頁各系表示抗原造血干細胞：CD3

8、4、CD33髓系表示 ：CD13、CD14、CD33巨核細胞 ：CD61、CD41B細胞系：CD10 、CD19、CD20T細胞系：CD2、CD3、CD5、CD7NK細胞: CD16、CD56、CD57流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第52頁4、細胞因子檢測 細胞因子（CK）主要由免疫細胞產(chǎn)生，也可由非免疫細胞如內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等產(chǎn)生。一個細胞可產(chǎn)生各種CK，一個CK也可由各種細胞產(chǎn)生。細胞因子分為4類：白細胞介素（lL）；干擾素（IFN）；造血生長因子；腫瘤壞死因子（TNF）。流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第53頁血液中未活化白細胞內(nèi)無或僅極小量細胞因子，當其被各種激活劑活化后，細胞內(nèi)細胞因子合成增加

9、并不停分泌到細胞外而發(fā)揮作用。所以，要測定細胞內(nèi)細胞因子較為困難。通常應(yīng)用刺激劑（如：佛波脂）來刺激細胞因子分泌 ，同時加入一定濃度細胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑（如：莫能霉素），使細胞因子合成后累積在細胞內(nèi)，經(jīng)過細胞因子特異單克隆抗體進行細胞內(nèi)熒光染色，并結(jié)合膜表面抗原染色，進行多色分析各種細胞內(nèi)合成細胞因子。流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第54頁流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第55頁細胞因子檢測（IFN-r ，IL-4）：全血或單細胞+刺激素(佛波脂)和阻斷劑(莫能霉素) 37培養(yǎng)4-6h 加入細胞表面抗體(如CD3、CD4/CD8) 孵育20-30min PBS洗1次 加固定破膜劑 室溫15min 加入IFN

10、- r和IL-4抗體 孵育30min PBS洗兩次 FCM。流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第56頁結(jié)果分析：利用流式設(shè)門技術(shù)，先利用前向散射（FS）和側(cè)向散射（SS）圈出淋巴細胞，再用CD3+和SSC設(shè)門圈出T淋巴細胞，再用CD8-/CD3+設(shè)門選定T淋巴細胞亞群，再分析IL-4+和CD4+/IFN-r淋巴細胞T淋巴細胞（CD3+）CD3+CD8-（CD4+）IFN-rIL-4流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第57頁5、細胞內(nèi)Ca2+濃度Ca2+超載是細胞損傷主要標志，造成DNA降解，促使細胞凋亡。 檢測 Fluo-3/Am是高特異性Ca2+熒光指示劑，能與Ca2+特異結(jié)合。Fluo-3它本身是親水性，不易

11、透過膜，依賴其脂溶性AM（乙酰氧甲基），酯化后就輕易跨過質(zhì)膜進入胞漿，在胞內(nèi)酯酶作用下，脫去AM重新生成親水性形式，首先不能再進入細胞器，另首先易于在胞內(nèi)擴散，與游離鈣離子結(jié)合，經(jīng)過檢測其熒光強度可反應(yīng)出細胞內(nèi)游離Ca2+濃度改變。 單細胞懸液+flour-3/AM 37C避光孵育40min PBS洗1次 上機檢測 流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第58頁6、線粒體膜電位 線粒體膜電位（MMP）是線粒體功效主要參數(shù)，是評價線粒體功效敏感指標，它大小直接反應(yīng)線粒體功效及數(shù)量，MMP下降，其氧化磷酸化功效障礙，使ATP產(chǎn)生降低，造成細胞凋亡和壞死。流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第59頁MMP檢測原理及方法：Rh

12、odamine123（羅丹明123）、DiOC6、JC-1等各種親脂性陽離子熒光素都能被流式細胞分析用于作為檢測 MMP探針。這些親脂性熒光染料，對膜含有通透性，另外線粒體內(nèi)外膜之間存在著跨膜電位，線粒體內(nèi)膜內(nèi)側(cè)帶負電荷，當它們與活細胞一起培養(yǎng)時，這些陽離子熒光素進入細胞內(nèi)就能特異地聚集于線粒體，其攝入量與線粒體膜電位成正比。 流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第60頁 當MMP降低后，線粒體內(nèi)熒光素會發(fā)生外漏，在細胞內(nèi)熒光強度降低。檢測其熒光強度能反應(yīng)線粒體數(shù)量和MMP降低或喪失。操作：單細胞懸液（1*10 6 ）+1umol/LRh123 37 C,30min PBS洗兩次 上機檢測 流式細胞術(shù)實驗

13、方法及應(yīng)用第61頁7、 FCM檢測細胞凋亡 細胞凋亡是細胞在一定生理或病理條件下，遵照本身程序結(jié)束其生命過程。細胞凋亡為一個可調(diào)控、主動細胞死亡過程，有很多促進或抑制凋亡調(diào)控路徑存在，因而就能夠人為地誘導或抑制一些細胞凋亡，從而到達防病、治病目標。流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第62頁（1） Caspase家族 半胱氨酸蛋白酶（Caspase）以無活性酶原形式存在細胞內(nèi)，需被水解加工后才能成為有活性片段?；罨疌aspase深入激活其它Caspase前體，形成了級聯(lián)放大切割過程，是直接造成凋亡細胞解體蛋白酶系統(tǒng)，當前已發(fā)覺15個Caspase家族組員，分別命名為Caspase1-15。在Caspase

14、家族組員中，Caspase-3是最主要指示蛋白酶。 流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第63頁操作：單細胞懸液（1*10 6） 固定和破膜劑 冰浴20min Perm/Wash Buffer洗兩次 20ul單抗 室溫孵育30min Perm/Wash Buffer洗1次 加0.5ml Perm/Wash Buffer 上機檢測。流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第64頁（2） 凋亡相關(guān)基因蛋白細胞凋亡過程中有各種基因蛋白參加調(diào)控。凋亡相關(guān)基因可分兩類：誘導凋亡基因和抗凋亡基因。主要有bcl-2家族、P53、 ced基因家族等。 抗凋亡基因:bcl-2、bcl-XL、Bad 等 促凋亡基因:bax、bak、bcl-

15、XS等 染色標識同Caspase流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第65頁（3）Fas/FasL Fas又稱APO-1，即CD95分子，是細胞膜上跨膜蛋白，表示在各種組織細胞，是經(jīng)典細胞死亡受體。Fas/FasL是凋亡誘導家族主要組員之一，是調(diào)整組織發(fā)育和體內(nèi)平衡主要分子,Fas/FasL結(jié)合,可向細胞傳遞死亡信號,引發(fā)細胞凋亡。 檢測：同表面標識流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第66頁（4） 凋亡率檢測被認為比較成熟方法：PI單染色法Annexin VPI雙染法。TUNEL法流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第67頁碘化丙啶（PI）單染法（DNA周期分析）：因為凋亡細胞DNA被降解，小分子DNA可經(jīng)過細胞膜滲透到細胞外

16、，另外凋亡小體也可帶走個別DNA，造成凋亡細胞DNA含量降低，與熒光染料結(jié)合降低，熒光強度減弱，在DNA直方圖上顯示在G0/G1峰前出現(xiàn)一個DNA含量降低亞二倍體峰，稱凋亡細胞峰。 流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第68頁流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第69頁流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第70頁Annexin VPI雙染法：在凋亡細胞形態(tài)學改變中，胞膜改變是最早。在細胞凋亡早期，細胞膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內(nèi)層翻轉(zhuǎn)，暴露在凋亡細胞表面，組成早期凋亡主要生化特征，PS被特異Annexin V-FITC探針所標識，而PI對細活細胞和早期凋亡細胞是拒染，故Annexin V-FITC/PI雙染法能區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞和死亡細胞。 流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第71頁機械損傷細胞： Annexin V -/PI+ 晚期凋亡、壞死細胞：Annexin V +/PI+早期凋亡細胞： Annexin V +/PI-活細胞： Annexin V -/PI-流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第72頁流式細胞術(shù)實驗方法及應(yīng)用第73頁TUNEL法：細胞凋亡時，雙鏈DNA會出現(xiàn)斷裂點，即產(chǎn)生一系列3 端。