微生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)

1、細(xì)胞培養(yǎng)【相關(guān)知識(shí)】一、細(xì)胞培養(yǎng)概念 細(xì)胞培養(yǎng)是指從生物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存、生長(zhǎng)和繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。二、細(xì)胞培養(yǎng)的意義 由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞其結(jié)構(gòu)和功能接近體內(nèi)情況，便于使用各種技術(shù)和方法進(jìn)行研究，并能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)直接觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化過程中的形態(tài)和功能變化，而且可同時(shí)提供大量生物學(xué)性狀相似的細(xì)胞作為研究對(duì)象。所以細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中一項(xiàng)非常重要的技術(shù)。三、細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn) 細(xì)胞培養(yǎng)是一種程序復(fù)雜、要求條件多而嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)性工作。所有離體細(xì)胞的生長(zhǎng)都受溫度、滲透壓、pH值、無機(jī)鹽影響，消毒、配液等均有嚴(yán)

2、格的規(guī)范和要求，特別是無菌操作是細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。 細(xì)胞培養(yǎng)不但是一門技術(shù)，也是一門科學(xué)，有它的基本理論、基本知識(shí)、和基本方法。原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。四、細(xì)胞培養(yǎng)的類型細(xì)胞懸液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長(zhǎng)和分裂。隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變遺傳物質(zhì)未改變6一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解組織細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作過程 學(xué)習(xí)細(xì)胞原代培養(yǎng)基本方法

3、，初步掌握細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作技術(shù)。 實(shí)驗(yàn)一、大鼠組織細(xì)胞原代培養(yǎng)7二、實(shí)驗(yàn)原理 將各種組織從動(dòng)物機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。一般說來，幼稚狀態(tài)的組織和細(xì)胞，如：動(dòng)物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進(jìn)行原代培養(yǎng)。8原代培養(yǎng)細(xì)胞的過程 幼齡動(dòng)物取動(dòng)物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞9三、實(shí)驗(yàn)用品1、儀器與用品：CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、滅菌高壓鍋、離心機(jī)、水浴箱、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板、玻璃吸管、移液管、培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、平皿、手術(shù)器械（眼科直剪2把、彎

4、剪1把、鑷子3把）。 2、材料：新生大鼠3、試劑：DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、75%酒精。10四、操作步驟（一）胰酶消化法1、取材 （根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物任選）（1）用鑷子拉頸椎處死新生大鼠。然后，把其完全浸入盛有75乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在平皿中攜入超凈臺(tái)。用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚，用消過毒的剪刀剖腹取出小鼠肺組織。置于無菌平皿中。 （2）剔除干凈小鼠肺組織周圍的脂肪和血塊，用滅菌的PBS液清洗三次。112、切割 ：將肺轉(zhuǎn)移到另一干凈的平皿內(nèi)，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，加入PBS13滴，用吸管移入無菌離心管中。 3、消化：

5、吸取等量0.25胰蛋白酶消化液加入離心管中，與組織塊混勻吹打后，旋緊蓋子，置于37水浴中消化10分鐘，每隔幾分鐘搖動(dòng)一下離心管，使組織與消化液充分接觸。124、加入23ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑），1000rpm，離心5分鐘，棄上清液。5、接種培養(yǎng)： 向離心管中加入23ml含10小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，用吸管吹打混勻，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天組織塊和細(xì)胞貼壁后加入5毫升培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 6、結(jié)果 ： 細(xì)胞接種后第二天就能貼壁，并開始生長(zhǎng)，如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。 上述消化分離的方法是最基本的方法，在該方法的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步分

6、離不同細(xì)胞。細(xì)胞分離的方法各實(shí)驗(yàn)室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶，透明質(zhì)酶等）。13（二）組織塊直接培養(yǎng)法 將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入37靜置35小時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37繼續(xù)培養(yǎng)。141、操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。2、點(diǎn)燃酒精燈，隨后的整個(gè)無菌操作過程都要在火焰附近進(jìn)行。金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營(yíng)養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。3、嚴(yán)禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿

7、。4、培養(yǎng)瓶、試劑瓶等要在超凈臺(tái)內(nèi)才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒，打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺(tái)內(nèi)完成。5、使用的吸管在從消毒的鋁盒中取出后要手拿末端，將尖端在火上燒一下，戴上膠皮乳頭，然后再去吸取液體。6、操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。7、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺(tái)面上用品要布局合理。 8、瓶口不宜長(zhǎng)時(shí)間處于開啟狀態(tài)。操作完畢后，加上瓶塞，才能拿到超凈臺(tái)外。9、吸溶液的吸管等不能混用。 五、注意事項(xiàng)15實(shí)驗(yàn)二、細(xì)胞傳代培養(yǎng)概念：培養(yǎng)的細(xì)胞由于細(xì)胞增殖，數(shù)量增加，細(xì)胞難以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)

8、，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)，也叫做繼代培養(yǎng)一般細(xì)胞可傳代10-50代。所謂細(xì)胞“一代”，即從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。如某一細(xì)胞系為50代即該細(xì)胞已傳代50次。16一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)細(xì)胞傳代培養(yǎng)基本方法，掌握培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。2. 在細(xì)胞培養(yǎng)方面獲得進(jìn)一步的感性知識(shí)。17二、實(shí)驗(yàn)原理體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營(yíng)養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)

9、移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。 18三、實(shí)驗(yàn)材料1、儀器與用品：CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、培養(yǎng)瓶或、15毫升無菌離心管、吸管、移液管、37水浴箱、離心機(jī)。 2、材料：大鼠平滑肌細(xì)胞。3、試劑：DMEM培養(yǎng)基（含10%小牛血清）、0.25%胰酶、PBS。19四、貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作步驟1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：細(xì)胞培養(yǎng)用的器材滅菌、超凈工作臺(tái)準(zhǔn)備、實(shí)際預(yù)溫、操作人員準(zhǔn)備。2、倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入23ml的D-Hanks液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片。3、加入2滴0.25胰蛋白酶消化液，消化23min，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時(shí)，倒去酶液。20剛加入合適過頭214、加入12滴管含有血清的培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其成細(xì)胞懸液。5、以1：2或1：3進(jìn)行分裝，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，注明代號(hào)、日期，輕輕搖勻，37 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 6、觀察：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。22五、結(jié)果觀察1、細(xì)胞傳代前后的生長(zhǎng)狀況及速度的觀察；2、了解生長(zhǎng)良好、一般及較差細(xì)胞的顯微鏡下觀察