乳與乳制品常規(guī)理化指標檢驗硝酸鹽亞硝酸鹽的檢測

1、乳與乳制品常規(guī)理化指標檢驗硝酸鹽亞硝酸鹽的檢測 YLNB 2.11 范圍本方法規(guī)定了采用鎘還原和光度分析法測定硝酸鹽和亞硝酸鹽的方法。本方法適用于乳粉、液體奶、乳清粉及嬰兒配方粉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的測定。本方法的檢出極限分別為：硝酸鹽1.5mg/kg；亞硝酸鹽0.2mg/kg。原理將樣品溶解于水中，沉淀脂肪和蛋白后，進行過濾。用鍍銅鎘粒使部分濾液中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。在未還原的濾液和已還原的濾液中，加入磺胺和N-1萘基-乙二胺二鹽酸鹽，使其顯粉紅色，然后用分光光度計在538nm波長下測其吸光度。將測得的吸光度與亞硝酸鈉標準系列溶液的吸光度進行比較，就可計算出樣品中的亞硝酸鹽含量和硝酸鹽還原

2、后的亞硝酸鹽總量，從兩者之間的差值可以計算出硝酸鹽的含量。試劑測定用水應是不含硝酸鹽和亞硝酸鹽的蒸餾水或去離子水。注：為避免鍍銅鎘粒（4.10）中混入小氣泡，柱制備（5.1）、柱還原能力的檢查（5.2）和柱的再生（5.3）時所用的蒸餾水或去離子水，最好是剛煮沸過并冷卻至室溫的。3.1 鍍銅鎘粒：直徑0.3-0.8mm。也可下述方法制備。將適量的鋅棒放入燒杯中，用40g/L的硫酸鎘（CdSO4 8H2O）溶液浸沒鋅棒。在24h之內，不斷將鋅棒的海綿狀鎘刮下來。取出鋅棒，潷出燒杯中多余的溶液，剩下的溶液能浸沒鎘即可。用蒸餾水沖洗海綿狀鎘2-3次，然后把鎘移入小型攪拌器中，同時加入400ml 0.1

3、mol/L的鹽酸攪拌幾秒鐘，以得到所需粒度的顆粒。將攪拌器中的鎘粒連同溶液一起倒回燒杯中，靜置幾小時，這期間要攪拌幾次以除掉氣泡。傾出大部分溶液，立即按5.1.1至5.1.8中敘述的方法鍍銅。3.2 硫酸銅溶液：溶解20g五水硫酸銅（CuSO4 5H2O）于水中，稀釋至1000ml。3.3 鹽酸-氨水緩沖溶液：pH9.60-9.70。用600ml水稀釋75ml濃鹽酸201.19g/mL，質量分數(shù)約為38%?；靹蚝?。再加入135ml濃氨水200.91g/mL，質量分數(shù)等于25%的新鮮的氨水。用水稀釋至1000ml，混勻。用精密的pH計調PH值為9.60-9.70。3.4 鹽酸溶液：c（H+）約為

4、2mol/L。用水將160ml的濃鹽酸（201.98g/mL）稀釋到1000ml。3.5 鹽酸溶液：c（H+）約為0.1mol/L。將50ml的2mol/L鹽酸溶液用水稀釋到1000ml。3.6 沉淀蛋白和脂肪的溶液：3.6.1 硫酸鋅溶液：將53.5g的七水硫酸鋅（ZnSO4 7H2O）溶于水中，并稀釋至100ml。3.6.2 亞鐵氰化鉀溶液：將17.2g的三水亞鐵氰化鉀K2Fe（CN）6 3H2O溶于水中，并稀釋至100ml。3.7 EDTA溶液：用水將33.5g的二水乙二胺四乙酸二鈉（Na2C10H14N2O3 2H2O）溶解，稀釋至1000ml。3.8 顯色液1：體積比450：550鹽

5、酸溶液。將450ml濃鹽酸加入到550ml水中，冷卻后裝入試劑瓶中。3.9 顯色液2：5g/L的磺胺溶液。在75ml的水中加入5ml濃鹽酸，然后在水浴上加熱，用其溶解0.5g磺胺（NH2C6H4SO2NH2）。冷卻到室溫后用水稀釋到100ml。必要時進行過濾。3.10 顯色液3：1g/L的萘胺鹽酸鹽溶液。溶解0.1g的N-1-萘基-乙二胺二鹽酸鹽于水中，用水稀釋到100ml。如有必要過濾。注：此溶液應少量配制，裝于密閉的棕色瓶中，冰箱中25保存。3.11 亞硝酸鈉標準溶液：相當于亞硝酸鹽的濃度為0.001g/L。將亞硝酸鈉（NaNO2）在110-120的范圍內干燥至恒重。冷卻后稱取0.150g

6、，溶于1000ml的容量瓶中，用水定容。在使用的當天配制該溶液。于1000ml的容量瓶中，吸取10ml上述溶液和20ml緩沖溶液（3.3），用水定容。1毫升此標準溶液含1.00g的NO2。3.12 硝酸鉀標準溶液，相當于硝酸鹽的濃度為0.0045 g/L。將硝酸鉀（KNO3）在110-120的范圍內干燥至恒重。冷卻后稱取1.4680g，溶于1000ml的容量瓶中，用水定容。在使用當天，與1000mL的容量瓶中，取5ml上述溶液和20ml緩沖溶液（3.3），用水定容。1mL的該標準溶液含有4.50g的NO3。儀器及器材所有玻璃儀要用蒸餾水沖洗，以保證不帶有硝酸鹽和亞硝酸鹽。4.1 分析天平。4.

7、2 燒杯：100ml。4.3 錐形瓶：250ml，500ml。4.4 容量瓶：體積為100ml，500ml，1000ml。 4.5 移液管：2ml，5ml，10ml，20ml。4.6 吸量管：2ml，5ml，10ml，25ml。4.7 量筒：根據(jù)需要選取。4.8 玻璃漏斗：直徑約為9cm，短頸。4.9 定性濾紙：直徑約18cm。4.10 還原反應柱：簡稱鎘柱。4.11 分光光度計：測定波長為538nm，使用1-2cm光程的比色皿。4.12 pH計，精度為0.01，使用前用pH7和pH9的標準溶液進行校準。5. 方法5.1 制備鍍銅鎘柱5.1.1 置鎘粒（3.1）于錐形燒瓶（4.3）中（所用鎘粒

8、的量以達到要求的鎘柱高度為準）。5.1.2 加足量的鹽酸（3.4）以浸沒鎘粒，搖晃幾分鐘。5.1.3 潷出溶液，在錐形燒瓶中用水反復沖洗，直到把氯化物全部沖洗掉。5.1.4 在鎘粒上鍍銅。向鎘粒中加入硫酸銅溶液（3.2）（每克鎘粒約需2.5ml），搖晃1min。5.1.5 潷出溶液，立即用水沖洗鍍銅鎘粒，注意鎘粒要始終用水浸沒。當沖洗水中不再有銅沉淀時即可停止沖洗。5.1.6 在用于盛裝鍍銅鎘粒的玻璃柱的底部裝上幾厘米高的玻璃纖維。在玻璃柱中裝入水，排凈氣泡。5.1.7 將鍍銅鎘粒盡快地裝入玻璃柱，使其暴露于空氣的時間盡量短。鍍銅鎘粒的高度應在15-20cm的范圍內。注：1 避免在顆粒之間遺留

9、空氣。2 注意不能讓液面低于鍍銅鎘粒的頂部。5.1.8 新制備柱的處理。以不大于6ml/min的流量將由750ml水、225ml硝酸鉀標準溶液（3.12）、20ml緩沖溶液（3.3）和20mlEDTA溶液（3.7）組成的混合溶液通過剛裝好鎘粒的玻璃柱，接著用50ml水以同樣的流速沖洗該柱。5.2 檢查柱的還原能力這種檢查每天至少要進行兩次，一般在開始時和一系列測定之后。5.2.1 用移液管將20ml的硝酸鉀標準溶液（3.12）移入還原柱頂部的貯液杯中，再立即向該貯液杯中添加5ml緩沖溶液（3.3）。用一個100ml的容量瓶收集洗提液。洗提液的流量不應超過6ml/min。5.2.2 在貯液杯將要

10、排空時，用約15mL水沖洗杯壁。沖洗水流完后，再用15ml水重復沖洗。當?shù)诙螞_洗水也流完后，將貯液杯灌滿水，并使水以最大流量流過柱子。5.2.3 當容量瓶中的洗提液接近100ml時，從柱子下取出容量瓶，用水定容至刻度，混合均勻。5.2.4 移取10ml洗提液于100ml容量瓶中,加水至60ml左右。然后按5.8.2、5.8.3、5.8.4操作。5.2.5根據(jù)測得的吸光度，通過回歸方程（5.8.5）計算出稀釋洗提液（5.2.4）中的亞硝酸鹽含量（g/mL）。據(jù)此可計算出以百分率表示的柱還原能力（NO2的含量為0.067g/mL時還原能力為100%）。如果還原能力小于95%或大于105，柱子就需

11、要再生。5.3 柱子再生柱子使用后，及鎘柱的還原能力低于95%或高于105時，按如下步驟進行再生。5.3.1 在100ml水中加入約5mlEDTA溶液（3.7）和2ml鹽酸溶液（3.5）。以10ml/min左右的速度過柱。5.3.2 當貯液杯中混合液排空后，按順序用25ml水、25ml鹽酸（3.5）和25ml水沖洗柱子。5.3.3 檢查柱子的還原能力，如低于95%或高于105，要重復再生。5.4 樣品的稱取和溶解5.4.1 液體乳樣品：量取90ml樣品于500ml錐形瓶中，用22ml50-55的水分數(shù)次沖洗樣品量筒，沖洗液傾入錐形瓶中，混勻。5.4.2 乳粉樣品：在100ml燒杯中稱取10g樣

12、品，準確至0.001g。用112ml50-55的水將樣品洗入500ml錐形瓶中，混勻。5.4.3 乳清粉及乳清粉為原料生產的嬰兒配方粉樣品：在100ml燒杯中稱取10g樣品，準確至0.001g。用112ml50-55的水將樣品洗入500ml錐形瓶中，混勻。用鋁箔紙蓋好錐形瓶瓶口，將溶好的樣品在沸水中煮15min然后冷卻至約50。5.5 脂肪和蛋白的去除5.5.1 按順序加入24ml硫酸鋅溶液（3.6.1）、24ml亞鐵氰化鉀溶液（3.6.2）和40ml緩沖溶液（5.3），加入時要邊加邊搖，每加完一種溶液都要充分搖勻。5.5.2 靜置15min-1h。然后用濾紙（4.9）過濾，濾液用250ml錐

13、形瓶收集。5.6 硝酸鹽還原為亞硝酸鹽5.6.1 移取20ml濾液于100ml小燒杯中，加入5ml緩沖溶液（3.3）混勻，倒入鎘柱頂部的貯液杯中，以小于6ml/min的流速過柱。洗提液（過柱后的液體）接入100ml容量瓶中。5.6.2 當貯液杯快要排空時，用15ml水沖洗小燒杯，再倒入貯液杯中。沖洗水流完后，再用15ml水重復一次。當?shù)诙螞_洗水快流完時，將貯液杯裝滿水，以最大流速過柱。5.6.3 當容量瓶中的洗提液接近100ml時，取出容量瓶，用水定容，混勻。5.7 測定5.7.1 分別移取20ml洗提液（5.6.3）和20ml濾液（5.5.2）于100ml容量瓶中，加水至約60ml。5.7

14、.2 在每個容量瓶中先加入6ml顯色液1（3.8），邊加邊搖；再加入5ml顯色液2（3.9）小心混合溶液，使其在室溫下靜置5min，避免陽光直射。5.7.3 加入2ml顯色液3（3.10），小心混合，使其在室溫下靜置5min，避免陽光直射。用水定容至刻度，混勻。5.7.4 在15min內用538nm波長，以空白試驗溶液為對照測定上述樣品溶液的吸光度。5.8 標準曲線的制作5.8.1 分別移?。ɑ蛴玫味ü芊懦觯?，2，4，6，8，10，12，16，20ml亞硝酸鈉標準溶液（3.11）于九個100ml容量瓶中。在每個容量瓶中加水，使其體積約為60ml。5.8.2 在每個容量瓶中先加入6ml顯色液1

15、（3.8），邊加邊混；再加入5ml顯色液2（3.9）。小心混合溶液，使其在室溫下靜置5min，避免陽光直射。5.8.3 加入2ml顯色液3（3.10），小心混合，使其在室溫下靜置5min，避免陽光直射。用水定容至刻度，混勻。5.8.4 在15min內，用538nm波長，以第一個溶液（不含亞硝酸鈉）為對照測定另外八個溶液的吸光度。5.8.5將測得的吸光度和亞硝酸根質量濃度兩組數(shù)據(jù)分別輸入excel表，通過excel表計算出回歸方程。亞硝酸根的質量濃度可根據(jù)加入的亞硝酸鈉標準溶液的量計算出。亞硝酸根的質量濃度以g/ml表示。（亞硝酸根的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標。）6. 結果計算6.1 亞硝

16、酸鹽的含量樣品中亞硝酸根含量（mg/kg）= - - (1)式中：c1根據(jù)濾液（5.5.2）的吸光度（5.7.4），通過回歸方程計算出的NO2的濃度，g/ml；m樣品的質量，g；V1所取濾液（5.5.2）的體積（5.7.1）。樣品中以亞硝酸鈉表示的亞硝酸鹽含量 W（NaNO2）=1.5W（NO2）-(2)式中：W（NO2）樣品中亞硝酸根的含量，mg/kg；W（NaNO2）樣品中以亞硝酸鈉表示的亞硝酸鹽的含量，mg/kg。報告測定結果準確至0.1mg/kg。6.2 硝酸鹽含量 樣品中硝酸根含量（mg/kg）= -式中：c2根據(jù)洗提液（5.6.3）的吸光度（5.7.4），通過回歸方程計算出的亞硝酸

17、根離子的濃度，g/ml；m樣品的質量，g；V2所取洗提液（5.5.2）的體積（5.7.1）。W（NO2）根據(jù)式（1）計算出的亞硝酸根含量。若考慮柱的還原能力, 樣品中硝酸根含量（mg/kg）= 式中：r 測定一系列樣品后的還原能力樣品中以硝酸鈉表示的硝酸鹽含量 W（NaNO3）=-(5)式中：W（NO3）樣品中硝酸根的含量，mg/kg；W（NaNO3）樣品中以硝酸鈉計的硝酸鹽的含量，mg/kg。報告測定結果準確至0.1mg/kg。允許差7.1 重復性7.1.1由同一分析人員在短時間間隔內測定的兩個亞硝酸鹽結果之間的差值，不應超過1mg/kg。7.1.2 由同一分析人員在短時間間隔內測定的兩個硝酸鹽結果之間的差值，在硝酸鹽含量小于30mg/kg時，不應超過3mg/kg；在硝酸鹽含量大于30mg/kg時，不應超過結果平均值的10%。7.2 重現(xiàn)性由不同實驗室的兩個分析人員對同一樣品測得的兩個硝酸鹽結果之差，在硝酸鹽含量小于30mg/kg時，差值不應超過8mg/kg；在硝酸鹽含量大于或等于30mg/kg時，該差值不應超過結果平均值的25%。注意事項8.1 鎘是有害元素，在處理鎘粒時，不要用手直接接觸，同時注意不要弄到皮膚上，一旦接觸立即用水沖洗。實驗用水必須不含有亞硝酸根和硝酸根。氨緩沖液除控制溶液的pH外，還可緩解鎘對亞硝酸根的還原。 對于顏色較深的樣品,在處理時,