染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)

1、知無不“研”|一文讀懂染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chip）染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chip）基于體內(nèi)分析而發(fā)展的染色質(zhì)免疫沉淀分析（Chromatinimmunoprecipitationassaykit,ChIP）技術(shù)可以真實、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活細(xì)胞或者組織的方法，因此能比較真實的反映細(xì)胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。近年來，這種技術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善。采用結(jié)合微陣列技術(shù)在染色體基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域檢查染色體活性，是深入分析癌癥、心血管病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病主要通路的一種非常有效的工具。染

2、色質(zhì)免疫沉淀分析（ChIP）的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下，當(dāng)用甲醛處理時，相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會產(chǎn)生共價鍵。細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)TF與Promoter相互結(jié)合時，它們必然靠的比較近或者契合在一起，這個時候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價鍵。固定的蛋白質(zhì)一DNA復(fù)合物通過超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過抗原抗體的特異性識別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。通過qPCR或二代測序，篩選與目的蛋白互作的未知DNA信息。今天小編將珍藏多年的ChIP實驗心得拿出來

3、與大家一同探討。應(yīng)用領(lǐng)域1、判斷DNA鏈的某一特定位置會出現(xiàn)何種組蛋白修飾2、檢測RNApolymeraseII及其它反式因子在基因組上結(jié)合位點的精確定位3、研究組蛋白共價修飾與基因表達(dá)的關(guān)系4、轉(zhuǎn)錄因子研究技術(shù)流程功能蛋白質(zhì)組學(xué)一站式研究地址梵辺市東建離新區(qū)離斷大號主創(chuàng)希00麗疼2樓rtfi4302l0&.iS;027-8&19683帕箔;朋n乳曲戲飢*cm阿址WiVW.eriacreate.MrTIwwV*朋GCi曲伯5超AIIJIOHJ交聯(lián).裂傅細(xì)胞免疫沉錠解交聯(lián)井艸化富族的EJNAFCRGcrateIliElhmruutdi#!業(yè)rqiM-EH：inf$_Jkfiafa-cAfcjll

4、案例展示案例一題目：HypoxiainducesH19expressionthroughdirectandindirectHif-laactivity,promotingoncogeniceffectsinglioblastoma期刊：scientificreports主要內(nèi)容：作者分別使用了兩種細(xì)胞U87和U251，驗證SP1對于H19的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。用SP1抗體進(jìn)行ChIP實驗，對H19的啟動子區(qū)域上游100bp的高GC含量，設(shè)計引物。富集到的DNA進(jìn)行qPCR檢測，結(jié)果顯示SP1能夠調(diào)控H19啟動子的轉(zhuǎn)錄。功能蛋白質(zhì)組學(xué)一站式研蓋地11lS汶市東QUSfrlZ離斷大號生廟城創(chuàng)希囲B-4r

5、t-4302|Ti社.亠“耳叫i-JL還丄吐丄案例三題目：AcrucialrolefortheubiquitouslyexpressedtranscriptionfactorSp1atearlystagesofhematopoieticspecification.期刊：Development主要內(nèi)容：分離培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞并誘導(dǎo)分化，分別收集組細(xì)胞及Flk+細(xì)胞，用轉(zhuǎn)錄因子Spl抗體進(jìn)行ChIP實驗后二代測序，獲得Sp1結(jié)合位點在兩種細(xì)胞中的分布區(qū)域。功能蛋白庾組學(xué)一站式研究ItuJL：R市東.第離肪広離斷丈iflefiE號主物城創(chuàng)祈I】別棟囚圭電ii;027-8ai8S683叩昭;marhe

6、iin逅朋術(shù)怕出$M內(nèi)址馳怕曲仲朋netr曰面切武漢金開瑞生物工程有限公司曲JHMGENECREATEBIOLOGICALEMQNEERINGCO.LTD.ChIP經(jīng)驗分享ChIP實驗操作性很強(qiáng)，金開瑞根據(jù)多年的實踐，總結(jié)了一些ChIP實驗中您可能會遇到的棘手的問題，下面我們就一起來康康吧！細(xì)胞固定1、甲醛終濃度為1%較適宜2、固定時間一般為5-60min較好，具體時間根據(jù)實驗而定染色質(zhì)斷裂1、超聲時斷時續(xù)，保證低溫2、注意探頭位置，防止產(chǎn)生泡沫3、研究組蛋白需使用酶處理染色質(zhì)免疫沉淀1、最好有Input對照。Input對照不僅可以驗證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及

7、染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實驗必不可少的步驟。2、抗體的選擇是關(guān)鍵?？贵w的選擇要注意三點：一是應(yīng)該選擇能夠做ChIP實驗的抗體。盡量選擇ChIP級別商業(yè)化的抗體。如沒有，一般可以重組到帶有標(biāo)簽的載體上，再轉(zhuǎn)染相應(yīng)的宿主（目前市面上商業(yè)化的chip抗體只有300多種，因此正好找到對應(yīng)抗體較困難，可以選擇標(biāo)簽抗體）。二是抗體的結(jié)合位點。選擇單抗的話，盡量遠(yuǎn)離抗原和染色質(zhì)相結(jié)合的位點，這樣可以最大限度保證抗體和抗原的結(jié)合，而多抗可識別多個表位，可基本避免該風(fēng)險。因此單多抗各有優(yōu)缺點，應(yīng)重點關(guān)注該抗體是否經(jīng)過ChIP驗證。三是抗體的濃度。

8、抗體濃度的也很重要，濃度太低，不能與靶蛋白完全結(jié)合。濃度太高會導(dǎo)致非特異性條帶增加背景。3、陰性對照可以使用血清或lgG，陽性對照一般使用RNAPolymeraseII或者組蛋白。陰性對照：用實驗抗體同型的IgG作為抗體，理論上不會ChIP下來任何DNA片段，因此作為陰性對照，但是由于非特異結(jié)合，或者實驗過程中，沒發(fā)生結(jié)合的DNA清除不完全，可能也會出現(xiàn)條帶。如果陰性對照樣品中的產(chǎn)物量等于特異靶標(biāo)樣品中產(chǎn)物量，說明特異靶標(biāo)抗體未發(fā)揮作用或者染色質(zhì)斷裂不充分。陽性對照：為了保證陽性對照有效，一般選擇陽性對照的引物是根據(jù)管家基因設(shè)計的。一般用RNAPolymeraseII或者HistoneH3（組

9、蛋白）抗體，因為RNAPolymeraseII是通用轉(zhuǎn)錄因子，在所有細(xì)胞中都能結(jié)合基因的核心啟動子區(qū)。因此，理論上ChIP后PCR都會有條帶。4、需設(shè)計已經(jīng)確定的、不與特異抗原相結(jié)合的DNA片段的引物，用來排除抗原和染色質(zhì)的非特異結(jié)合。交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)1、RNA酶、蛋白酶需65C保溫6小時2、不加蛋白酶可以提取、分析結(jié)合蛋白DNA的純化最好用試劑盒，便于后面的PCR檢測DNA的鑒定可以進(jìn)行二代測序或者qPCR檢測結(jié)果因為ChIP實驗涉及的步驟多，結(jié)果的重復(fù)性較低，所以對ChIP實驗過程的每一步都應(yīng)設(shè)計相應(yīng)的對照,而且對結(jié)果的分析也需要有一定的經(jīng)驗。如果ChIP實驗方面有什么問題，歡迎與我們交流哦

10、！實驗Q&AQ:ChIP-Seq和ChIP-qPCR有何異同？A:染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）所獲得的DNA產(chǎn)物，在ChIP-Seq中通過高通量測序的方法，在全基因組范圍內(nèi)尋找目的蛋白（轉(zhuǎn)錄因子、修飾組蛋白）的DNA結(jié)合位點片段信息；ChIP-qPCR需要預(yù)設(shè)待測的目的序列，針對目的序列設(shè)計引物，以驗證該序列是否同實驗蛋白結(jié)合互作。功能蛋白質(zhì)組學(xué)一站式研蓋地址梵辺市東建離新區(qū)離斷大號主創(chuàng)希00麗疼2樓rtfi4302l0&.iS;027-8&19683帕箔;朋n乳曲戲飢*cm阿址wwV*朋GCi曲伯5Q:染色質(zhì)片段大小在哪個范圍比較合適？A:對于ChlP-seq,片段在200-500bp左右是最合適范圍；對于ChlP-qPCR，片段在200-800bp左右適宜。Q:植物樣本處理和動物組織/細(xì)胞有何區(qū)別？A:植物組織由于細(xì)胞壁、氣腔等結(jié)構(gòu)的存在，會給交聯(lián)緩沖液的作用帶來困難，因此相對于動物組織/細(xì)胞來說，往往需要在抽真空條件下進(jìn)行交聯(lián)，而該步奏是一個需要經(jīng)驗及優(yōu)化的過程。Q:ChIP-Seq中的測序DNA樣本需要多少產(chǎn)量？A:通常是M10ng。Q:ChIP風(fēng)險如果判斷A:ChIP實驗以標(biāo)簽來判斷實驗風(fēng)險，重組標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子組蛋白；當(dāng)以重組蛋白作為靶蛋白時，重組蛋白同內(nèi)源蛋白可能存在